牛PLIN2和CGI-58蛋白互作研究

摘要

【目的】克隆牛PLIN2和CGI-58基因CDS序列并构建蛋白互作载体，对PLIN2和CGI-58蛋白的互作关系进行验证，为后续研究2种蛋白互作对秦川牛脂肪细胞早期脂滴生成的影响提供试验依据。【方法】PCR扩增牛PLIN2和CGI-58基因CDS区序列，将其分别无缝克隆到线性化pBiFC-VN-173、pBiFC-VC-155载体中，构建蛋白双分子荧光互补载体pBiFC-VN-173-PLIN2、pBiFC-VC-155-PLIN2、pBiFC-VN-173-CGI-58和pBiFC-VC-155-CGI-58。将pBiFC-VN-173-PLIN2+pBiFC-VC-155-CGI-58,pBiFC-VC-155-PLIN2+pBiFC-VN-173-CGI-58共转染牛原代脂肪细胞，以空载pBiFC-VN-173+BiFC-VC-155共转染处理作为阴性对照，用显微镜观察融合蛋白黄色荧光情况，并采用流式细胞仪检测黄色荧光强度。用实时荧光定量RCR法检测PLIN2和CGI-58蛋白双分子荧光互补载体共转染对牛原代脂肪细胞脂质合成相关基因PPARγ、C/EBPα、FASN、ACLY、ACC1表达量的影响。【结果】pBiFC-VN-173-PLIN2+pBiFC-VC-155-CGI-58共转染牛原代脂肪细胞培养24 h后检测到黄色荧光，且荧光强度极显著高于pBiFC-VN-173-CGI-58+pBiFC-VC-155-PLIN2共转染组和对照组(P<0.01);流式细胞仪检测结果显示，pBiFC-VN-173-PLIN2+pBiFC-VC-155-CGI-58组出现明显的黄色荧光细胞聚类现象，表明牛PLIN2蛋白与CGI-58蛋白存在互作关系。pBiFC-VN-173-PLIN2+pBiFC-VC-155-CGI-58共转染的牛脂肪细胞脂质合成关键基因表达量与对照组相比未出现明显差异，表明构建的载体未对脂肪细胞生长及脂质合成等生理过程产生影响。【结论】成功构建了牛PLIN2和CGI-58蛋白互作载体，并证明这2种蛋白存在互作关系；构建的载体未对牛脂肪细胞脂质合成关键基因表达量产生明显影响。

关键词

PLIN2 / CGI-58 / 蛋白互作 / 脂肪细胞 / 秦川牛