泰国伯克霍尔德氏菌环二鸟苷酸代谢关键酶PdcA的筛选及活性分析

doi:10.13207/j.cnki.jnwafu.2025.10.016

西北农林科技大学学报（自然科学版） ›› 2025, Vol. 53 ›› Issue (10) : 1 -12. DOI: 10.13207/j.cnki.jnwafu.2025.10.016

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摘要

【目的】筛选泰国伯克霍尔德氏菌环二鸟苷酸(c-di-GMP)代谢关键酶,并对其活性以及突变体的运动性、生物膜形成能力和毒性等进行分析,为相关致病性伯克霍尔德氏菌的防治提供科学依据。【方法】以泰国伯克霍尔德氏菌E264菌株为研究对象,通过氨基酸多序列比对筛选泰国伯克霍尔德氏菌中的c-di-GMP代谢酶的关键活性位点。采用同源重组方法构建单基因缺失突变体,利用泳动试验和生物膜形成试验筛选c-di-GMP代谢关键酶,并通过体外酶促反应和高效液相色谱分析其酶活性。通过大蜡螟幼虫感染试验检测c-di-GMP代谢关键酶基因缺失对E264菌株毒性的影响。【结果】共筛选到14个c-di-GMP代谢酶,其中BTH＿Ⅰ0751和BTH＿Ⅰ1393的EAL结构域以及BTH＿Ⅰ2871的GGDEF结构域活性位点发生了突变;成功构建了14个c-di-GMP代谢酶基因缺失突变体,并筛选出PdcA(BTH＿Ⅱ2363)为c-di-GMP代谢关键酶。结构域分析结果显示,PdcA含有Per-ARNT-Sim(PAS)传感结构域(N-端)和GGDEF结构域(C-端);酶活性分析结果显示,PdcA具有c-di-GMP合成酶活性,能够调节胞内c-diGMP水平,而且其PAS结构域对酶活性的发挥至关重要。大蜡螟幼虫感染试验发现,pdcA的缺失增强了泰国伯克霍尔德氏菌E264的毒力。【结论】PdcA是泰国伯克霍尔德氏菌E264 c-di-GMP代谢的关键酶,能够调节其运动性、生物膜形成能力以及毒力。PdcA的c-di-GMP合成活性依赖于自身的PAS结构域。