抗缪勒管激素对绵羊卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制研究

摘要

【目的】研究抗缪勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)对绵羊有腔卵泡颗粒细胞生长的影响,并探究其作用机制。【方法】收集绵羊不同直径(<3 mm、3～5 mm、>5 mm)有腔卵泡卵泡液与颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测颗粒细胞AMH及其Ⅱ型受体(AMHRⅡ)m RNA表达水平,用ELISA法检测颗粒细胞和卵泡液中AMH蛋白质量浓度;将绵羊有腔卵泡颗粒细胞用含有不同质量浓度AMH(0(对照组),0.5,5和50ng/m L)的培养基培养48 h,利用CCK-8法检测细胞增殖水平,用流式细胞仪检测培养细胞凋亡率,用RT-q PCR检测凋亡相关基因(Caspase 3、BCL-2、BAX)和增殖相关基因(PCNA)m RNA表达水平。用流式细胞仪检测AMH对颗粒细胞内SMAD1/5/8、磷酸化SMAD1/5/8(P-SMAD1/5/8)、CREB、磷酸化CREB(P-CREB)蛋白表达水平的影响。通过Ed U细胞增殖试验,检测SMAD1/5/8抑制剂LDN193189和CREB抑制剂666-15对颗粒细胞增殖水平的影响。【结果】随着卵泡直径的增大,颗粒细胞内AMH转录水平及蛋白质表达量均显著下降(P<0.05),AMHRⅡm RNA在直径3～5 mm的中腔卵泡颗粒细胞中表达量显著高于小卵泡(直径<3 mm)及大卵泡(直径>5 mm)颗粒细胞(P<0.05);随着卵泡直径的增大,卵泡液中AMH蛋白质量浓度显著降低(P <0.05)。与对照组相比,5和50ng/m L AMH显著抑制了颗粒细胞增殖(P<0.05),PCNA m RNA相对表达量显著降低。与对照组相比,5和50ng/m L AMH组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),BCL-2 m RNA相对表达水平显著下降(P<0.05),而Caspase 3、BAX m RNA相对表达水平显著上升(P<0.05)。经5 ng/m L AMH培养的颗粒细胞,SMAD1/5/8与CREB总蛋白水平与对照组无显著差异(P>0.05),但P-SMAD1/5/8蛋白水平显著高于对照组(P<0.05),P-CREB蛋白水平显著低于对照组(P<0.05)。LDN193189处理显著促进了颗粒细胞内PCNA表达(P<0.05),而666-15处理显著抑制了颗粒细胞内PCNA表达(P<0.05);Ed U检测结果显示,与AMH组相比,LDN193189处理颗粒细胞增殖水平显著提高(P<0.05),666-15处理颗粒细胞增殖水平显著降低(P<0.05)。【结论】绵羊有腔卵泡颗粒细胞中AMH分别通过SMAD1/5/8、CREB通路调节颗粒细胞增殖和凋亡,进而在卵泡发育过程中发挥重要作用。

关键词

绵羊 / 抗缪勒管激素 / 颗粒细胞 / 有腔卵泡