基于重组酶介导恒温核酸扩增技术快速检测犬传染性肝炎方法的建立

摘要

【目的】建立一种基于重组酶介导恒温核酸扩增（RAA）技术快速检测犬传染性肝炎疾病的方法。【方法】以犬传染性肝炎病原体1型犬腺病毒（CAV-1）的E3基因序列作为靶标序列,设计合成引物和荧光探针,构建重组质粒作为标准品,进行RAA基础检测来筛选引物,确立RAA荧光反应体系。应用不同含量（10～5,10～4,10～3,10～2,10,1,0.1 COPY/μL）的质粒标准品作为模板,进行RAA检测,分析RAA检测的灵敏度;分别以CAV-1、2型犬腺病毒（CAV-2）、犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）、犬冠状病毒（CCV）、犬副流感病毒（CPIV）的基因组作为模板,进行RAA检测,分析RAA检测的特异性;选择同批次和不同批次的质粒标准品作为模板,进行RAA检测,分析RAA检测的重复性。选取经RT-qPCR检测为阳性和阴性的临床血液样本各40份,进行RAA检测,验证2种方法的符合情况。【结果】成功扩增到约419 bp的E3基因;构建了阳性质粒标准品p18TC1,其质量浓度为200 ng/μL,质粒含量为5.74×10¹⁰COPY/μL。经筛选确立以CAV-F4/CAV-R3为引物、以CAV-P为探针的RAA荧光反应体系,反应温度恒定为39℃,反应时间为15 min,检测灵敏度为1 COPY/μL,与CAV-2、CPV、CDV、CCV、CPIV等病毒无任何交叉反应,且批内重复试验的变异系数小于1.00%,批间重复试验的变异系数小于2.00%。临床样本检测结果表明,建立的基于RAA的检测方法与RT-qPCR法的符合率为100%。【结论】建立了基于RAA技术的犬传染性肝炎快速检测方法,该方法具有检测快速、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。

关键词

犬传染性肝炎 / 1型犬腺病毒 / 重组酶 / 恒温核酸扩增