猪繁殖与呼吸综合征病毒激活mTORC1/HIF⁃1α通路诱导炎症的作用机制

Mechanism of inflammation induced by porcine reproductive and respiratory syndrome virus via mTORC1/HIF⁃1α signaling pathway activation

摘要

目的 探究缺氧诱导因子1α （HIF-1α）在猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）诱导的猪肺泡巨噬细胞炎症中的作用机制。 方法 采用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）和实时荧光定量PCR （Real-time PCR， RT-qPCR），检测感染PRRSV的猪肺脏、肺泡巨噬细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达水平。使用BAY87-2243或CoCl₂处理PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞，检测PRRSV M蛋白和mRNA表达水平，ELISA检测白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6 （IL-6）和肿瘤坏死因子α （TNF-α）的水平。将猪肺泡巨噬细胞转染TSC2 siRNA后，用mTORC1抑制剂Rapa和mTOR抑制剂KU0063794处理，用Western Blot检测猪肺泡巨噬细胞mTOR对HIF-1α的调控机制。将猪肺泡巨噬细胞过表达mTORC1后，检测PRRSV对HIF-1α和炎症因子水平的影响。 结果 PRRSV感染可明显提高猪肺脏、肺泡巨噬细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达水平。与PRRSV组相比，HIF-1α激活组（CoCl₂处理）促进了PRRSV M蛋白和mRNA的表达，IL-1β、IL-6和TNF-α的含量极显著升高 （P<0.01）；HIF-1α抑制组（BAY87-2243处理）降低了PRRSV M蛋白和mRNA的表达，IL-1β、IL-6和TNF-α的含量显著或极显著降低（P<0.01）。PRRSV促进肺泡巨噬细胞中mTOR表达，抑制mTOR后HIF-1α的表达降低，炎症细胞因子水平显著或极显著降低；重新恢复HIF-1α的表达后，炎症细胞因子水平显著升高（P<0.05）。mTOR主要通过mTORC1上调HIF-1α表达；过表达mTORC1可提高PRRSV M和HIF-1α蛋白水平，促进炎症细胞因子表达（P<0.05）。 结论 HIF-1α可调控PRRSV诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应，其表达受mTORC1信号通路调节。

Abstract

Objective The study aims to explore the mechanism of hypoxia-inducible factor HIF-1α in porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）-induced inflammation in porcine alveolar macrophages. Method HIF-1α mRNA and protein expression levels in PRRSV-infected porcine lungs and alveolar macrophages were assessed using Western Blot and real-time quantitative PCR （RT-qPCR）.PRRSV-infected porcine alveolar macrophages were treated with BAY87-2243 or CoCl₂，followed by detection of PRRSV M protein and mRNA expression，and ELISA quantification of interleukin-1β （IL-1β），interleukin-6 （IL-6），and tumor necrosis factor alpha （TNF-α）.TSC2 siRNA-transfected porcine alveolar macrophages were treated with Rapa （mTORC1 inhibitor） and KU0063794 （mTOR inhibitor），and the regulatory mechanism of mTOR on HIF-1α in porcine alveolar macrophages was detected by Western Blot.After mTORC1 overexpression in porcine alveolar macrophages，the effects of PRRSV on the levels of HIF-1α and inflammatory cytokines were evaluated. Result PRRSV infection significantly elevated HIF-1α mRNA and protein levels in porcine lungs and alveolar macrophages.Compared with the PRRSV-infected group，the HIF-1α activation group （CoCl₂ treatment） showed increased expression of PRRSV M protein and mRNA and significantly elevated levels of IL-1β，IL-6，and TNF-α （P<0.01）.The HIF-1α inhibition group （BAY87-2243 treatment） exhibited decreased expression of PRRSV M protein and mRNA and significantly reduced levels of IL-1β，IL-6，and TNF-α （P<0.01）.PRRSV was found to enhance mTOR expression in alveolar macrophages，while mTOR inhibition decreased HIF-1α expression and significantly or extremely significantly reduced inflammatory cytokine levels.Upon re-elevating HIF-1α expression，the inflammatory cytokine levels significantly increased （P<0.05）.mTOR mainly upregulated HIF-1α expression through mTORC1.Overexpression of mTORC1 leads to increased levels of PRRSV M protein and HIF-1α protein，enhancing inflammatory cytokine expression （P<0.05）. Conclusion HIF-1α plays a pivotal role in regulating PRRSV-induced inflammatory responses of alveolar macrophages，with its expression modulated by the mTORC1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

猪繁殖与呼吸综合征病毒 / 缺氧诱导因子1α / 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 / 炎症因子 / 肺泡巨噬细胞

Key words

porcine reproductive and respiratory syndrome virus / hypoxia inducible factor 1α / mammalian target of rapamycin / inflammatory factors / alveolar macrophage

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）引起猪的一种高度传染性疾病，主要造成母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难、死亡及免疫机能障碍，在世界范围内广泛流行，困扰全球养猪业的持续健康发展^［1-2］。PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞，感染后肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、白介素6（IL-6）和白介素8（IL-8）等多种炎症因子大量表达，形成“炎症因子”风暴，使猪机体炎症调节失衡。“炎症因子”风暴是PRRSV导致猪死亡的重要因素之一，其可导致猪免疫系统以及肺、肾、心肌等器官损伤，体温升高，关节肿大，呼吸困难，应激反应^［3-4］。炎症反应在PRRSV感染的致病机制中起重要作用，深入了解PRRSV的致病机制对开发有效的防控措施具有重要意义。PRRSV诱导炎症的研究已经取得了一些进展，如PRRSV可激活宿主细胞TLR4/MyD88、NF-κB、ERK1/2和p38MAPK等炎症信号通路，导致炎症因子的表达增加^［5-7］，但PRRSV诱导炎症的具体分子机制仍不完全清楚。

细胞代谢在免疫反应中起着核心作用，特别是糖酵解和氧化磷酸化等途径，为细胞功能提供了必要的能量和分子基础。当细胞受到病原体或损伤刺激时，其代谢途径会发生变化，促进炎症因子的合成和分泌。炎症反应导致组织代谢旺盛，耗氧增加，致使炎症组织部位细胞处于“生理性低氧”环境中。缺氧诱导因子1α （hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）对组织细胞适应低氧环境具有调节作用，其影响几乎涵盖了生理学的各方面，包括细胞能量代谢、胚胎发育和免疫应答等，同时HIF-1α在炎症反应方面也发挥着至关重要的调控作用^［8-9］。研究表明，人免疫缺陷病毒（HIV）^［10］、戊型肝炎病毒（HEV）^［11］和呼吸道合胞病毒（RSV）^［12］等感染可促进细胞内HIF-1α表达，影响细胞糖代谢过程以及炎症细胞因子的表达。巨噬细胞感染病原后即使在有氧环境下也会增强HIF-1α蛋白的表达和稳定性，HIF-1α基因表达增强依赖于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）信号的激活^［13-14］。本课题组前期研究发现，猪原代肺泡巨噬细胞感染PRRSV可促进HIF-1α表达，敲低HIF-1α表达能降低PRRSV滴度，HIF-1α在PRRSV感染、致病过程中起重要作用^［15］，然而目前对PRRSV感染中HIF-1α与炎症因子的关系却仍不清楚。为此，本试验探究了PRRSV感染肺泡巨噬细胞中HIF-1α与IL-1β、TNF-α和IL-6炎症细胞因子含量的关系，以及mTORC1/HIF-1α通路对炎症细胞因子表达的作用，旨在为PRRSV的防控和药物治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞、病毒和肺脏组织

猪肺泡巨噬细胞系3D4/21细胞，购自湖南丰晖生物科技有限公司；mTORC1过表达质粒pcDNA-flag-mTORC1和PRRSV （GenBank： KP860909，病毒滴度为2×10^-5.79 TCID₅₀/mL），由预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室保存；PRRSV未感染和感染仔猪肺脏组织，由本课题组刘建奎教授惠赠^［16］。

1.1.2 主要试剂

胎牛血清 （fetal bovine serum， FBS） ，购自Biological Industries （BI）；Total RNA Extraction Reagent、HiScript Ⅲ RT SuperMix和SYBR Green Master Mix，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；β-actin鼠抗单克隆抗体（1∶1 000倍稀释）、mTOR鼠抗单克隆抗体（1∶1 000倍稀释）和磷酸化mTOR（p-mTOR）鼠抗单克隆抗体（1∶1 000倍稀释），购自Cell Signaling Technology公司；HIF-1α鼠抗单克隆抗体（1∶1 000倍稀释），购自Abcam公司；PRRSV M兔抗多克隆抗体（1∶1 000倍稀释），购自北京博奥森生物技术有限公司；p-S6（S240/244）兔抗单克隆抗体（1∶1 000倍稀释），购自武汉爱博泰克公司；TSC2鼠抗单克隆抗体（1∶1 000倍稀释），购自proteintech公司；Lipofectamine^TM 3000 Transfection Reagent，购自Invitrogen公司；0.22 μm PVDF膜，购自Millipore公司；CoCl₂，购自Sigma公司，用DMEM溶解，配制成浓度为100 mmol/L的母液，储存于-20 ℃冰箱备用；BAY87-2243、KU0063794和雷帕霉素（rapamycin，Rapa），购自MCE公司，均用DMSO溶解，分别配制成浓度为400，300和10 000 μmol/L的母液，储存于-20 ℃冰箱备用；山羊抗兔IgG-HRP（1∶5 000倍稀释）、山羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000倍稀释）、SDS-PAGE凝胶试剂盒和ECL化学发光检测试剂盒，购自碧云天生物科技有限公司；ELISA检测试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司。引物由生工生物工程 （上海） 股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 PRRSV对猪肺脏和肺泡巨噬细胞HIF⁃1α水平的影响

培养3D4/21细胞，待其融合度达到90%时分成对照组（CK）和PRRSV组，PRRSV组加入感染复数（MOI）为1的PRRSV病毒液，37 ℃孵育2 h后换成维持液，于12，24和48 h收集样品。提取PRRSV阴性和阳性猪肺脏和3D4/21细胞的蛋白，用Western Blot检测HIF-1α蛋白表达；用TRIzol方法提取PRRSV阴性和阳性猪肺脏和3D4/21细胞总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）测HIF-1α mRNA表达水平。

1.2.2 HIF-1α对PRRSV诱导炎症因子的作用

使用不同浓度HIF-1α抑制剂BAY87-2243或诱导细胞低氧环境的CoCl₂处理感染PRRSV的3D4/21细胞，检测HIF-1α在PRRSV诱导炎症反应中的作用。将生长良好的3D4/21细胞在六孔板中传代培养，待其融合度达到90%时，分成对照组（CK）、PRRSV组、PRRSV+CoCl₂组和PRRSV+BAY87-2243组，PRRSV、PRRSV+CoCl₂和PRRSV+BAY87-2243组细胞加入MOI为1的PRRSV病毒液，37 ℃孵育2 h，然后PRRSV+CoCl₂组换成含CoCl₂ （浓度50和100 μmol/L）的维持液培养，PRRSV+BAY87-2243组换成含BAY87-2243（浓度200和400 nmol/L）的维持液培养，对照组和PRRSV组换成等量的维持液培养，于24，48 h时收集样品。采用Western Blot检测PRRSV M蛋白表达水平，用RT-qPCR检测200 nmol/L BAY87-2243和50 μmol/L CoCl₂处理PRRSV M mRNA表达水平，用ELISA试剂盒检测200 nmol/L BAY87-2243和50 μmol/L CoCl₂处理细胞上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。

1.2.3 mTOR对PRRSV诱导炎症因子的作用

mTOR通过调节细胞代谢和蛋白质合成，促进炎症反应的进行。将PRRSV感染3D4/21细胞后，使用mTOR抑制剂Rapa 或细胞低氧环境诱导剂CoCl₂进行处理，以检测mTOR在PRRSV诱导肺泡巨噬细胞炎症因子表达中的作用。培养3D4/21细胞，待其融合度达到90%时，分成对照组（CK）、PRRSV组、PRRSV+Rapa组（PRRSV+R）和PRRSV+Rapa+CoCl₂组（PRRSV+R+C），PRRSV接毒参考1.2.2节方法进行，PRRSV+R组换成含Rapa （10 μmol/L）维持液培养，PRRSV+R+C组换成含Rapa （10 μmol/L）和CoCl₂ （50 μmol/L）维持液培养，对照组和PRRSV组换成等量的维持液培养，24 h时收集细胞和上清液，采用Western Blot检测细胞HIF-1α、p-mTOR和mTOR蛋白的变化，用ELISA试剂盒检测细胞上清液IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。

1.2.4 mTOR对HIF-1α的调控作用

mTOR蛋白包括2种复合体mTORC1和mTORC2，mTORC1和mTORC2在组成和功能上有差异。结节性硬化症蛋白复合体2 （tuberous sclerosis complex 2，TSC2）是mTOR的负调控因子，磷酸化S6（phospho-S6，p-S6）是mTORC1活化的标志。利用siRNA抑制3D4/21细胞TSC2表达，以检测mTOR对HIF-1α蛋白的调控作用。将3D4/21细胞转染TSC2 siRNA后分别用mTORC1的抑制剂Rapa和mTOR抑制剂KU0063794（KU）处理，以探究mTOR调控HIF-1α表达的形式。

根据猪源TSC2基因mRNA序列（XM_003354670.4）设计TSC2 siRNA si-TSC2（正义链：GCUGUUACCUUGACGAGUACA，反义链：UACUCGUCAAGGUAACAGCUG）。培养3D4/21细胞，待其融合度达到80%时，使用Lipofectamine 3000转染si-TSC2，转染操作如下：20 μmol/L siRNA 5 μL+Opti-MEM 125 μL，轻轻混匀；Lipofectamine 3000 5 μL+Opti-MEM 125 μL，轻轻混匀；将2管混匀，室温孵育15 min，加入到细胞中，转染24 h后分别加入Rapa （10 μmol/L）或KU0063794 （300 nmol/L），Western Blot检测细胞HIF-1α和p-S6蛋白水平的变化。

1.2.5 mTORC1对PRRSV诱导炎症因子表达的作用

将mTORC1过表达质粒转染3D4/21细胞，以确定mTORC1在PRRSV调控HIF-1α表达中的作用。培养3D4/21细胞，待其融合度达80%时，分成对照组（CK）和试验组，试验组用Lipofectamine 3000转染mTORC1过表达质粒pcDNA-flag-mTORC1，转染操作如下：5 μL Lipofectamine 3000+250 μL Opti-MEM，轻轻混匀；2.5 μg质粒+250 μL Opti-MEM，加入5 μL P3000试剂，轻轻混匀；将2管混匀，室温孵育15 min，将转染复合物加入到细胞中，24 h后CK组和试验组均接种PRRSV （MOI=1），48 h后收集细胞及上清液，采用Western Blot检测细胞HIF-1α、p-S6和PRRSV M蛋白水平的变化，用ELISA试剂盒检测细胞上清液IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。

1.2.6 HIF-1α和PRRSV M mRNA水平RT-qPCR检测

用TRIzol方法提取肺脏和3D4/21细胞总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以β-actin为内参基因，采用RT-qPCR法检测HIF-1α和PRRSV M基因mRNA变化，反应体系为：cDNA（50 ng/μL）2 μL、SYBR Green 10 μL、上游引物（10 μmol/L）0.6 μL、下游引物（10 μmol/L）0.6 μL、双蒸馏水6.8 μL。采用2^-∆∆Ct法计算mRNA的相对表达量。试验所需引物序列见表1。

1.2.7 样品中蛋白水平Western Blot检测

样品使用RIPA裂解液获得细胞蛋白样品，测定浓度后使用5×loading buffer煮沸变性，样品经SDS-PAGE电泳、转膜，4 ℃冰箱过夜孵育目的蛋白一抗（1∶1 000倍稀释），37 ℃恒温箱孵育HRP标记的二抗2 h （1∶5 000倍稀释），洗膜后曝光观察分析。试验选用β-actin或甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）蛋白为内参蛋白。

1.3 数据分析

试验数据用GraphPad Prism 5.0软件进行分析，组间差异性采用单因素方差法进行分析，结果以“平均值±标准差” 表示。

2 结果与分析

2.1 PRRSV对HIF-1α表达的影响

猪肺脏HIF-1α含量的结果如图1-A、B所示，与CK组相比，PRRSV感染猪肺脏HIF-1α蛋白表达水平升高，HIF⁃1α mRNA的表达量极显著升高（P<0.01）。检测3D4/21细胞感染PRRSV后HIF-1α含量的变化，Western Blot结果显示，与CK组相比，感染PRRSV 12，24 和48 h细胞内HIF-1α蛋白水平明显升高（图1-C）；RT-qPCR结果显示，与CK组相比，HIF-1α mRNA水平在感染后12和24 h极显著升高（P<0.01），感染时间延长至48 h时HIF-1α mRNA水平高于CK组，但无显著差异（图1-D）。试验结果表明，感染PRRSV后猪肺泡巨噬细胞和仔猪肺脏组织HIF-1α mRNA和蛋白水平均升高。

2.2 HIF-1α对PRRSV诱导炎症的作用

HIF-1α对PRRSV诱导猪肺泡巨噬细胞3D4/21炎症反应的作用如图2所示。Western Blot试验结果显示，CoCl₂可促进3D4/21细胞内PRRSV M蛋白的表达，而 BAY87-2243可抑制M蛋白的表达（图2-A）；RT-qPCR试验结果显示，与PRRSV组相比，添加BAY87-2243可极显著抑制3D4/21细胞内PRRSV M基因mRNA表达（P<0.01），而CoCl₂可极显著促进PRRSV M基因mRNA表达（P<0.01）（图2-B、C）。进一步使用ELISA试剂盒检测HIF-1α对炎症细胞因子表达的作用，结果显示，与PRRSV组相比，PRRSV+BAY87-2243组细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量大多显著或极显著降低（图2-D、E、F），而PRRSV+CoCl₂组细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均极显著升高 （图2-G、H、I）。结果表明，HIF-1α对PRRSV诱导猪肺泡巨噬细胞炎症细胞因子表达有显著促进作用。

2.3 mTOR对PRRSV诱导炎症的作用

mTOR对PRRSV诱导猪肺泡巨噬细胞3D4/21炎症反应的作用如图3所示。试验结果显示，与CK 组相比，PRRSV组p-mTOR和mTOR的表达水平升高；与PRRSV组相比，PRRSV+R组HIF-1α蛋白表达被抑制，p-mTOR蛋白表达水平降低；PRRSV+R+C组能够提高细胞HIF-1α的表达量，而对p-mTOR的表达无明显作用（图3-A）。炎症细胞因子表达如图3-B、C、D所示，与PRRSV组相比，PRRSV+R组细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均显著或极显著降低；与PRRSV+R组相比，PRRSV+R+C组IL-1β和TNF-α的含量均显著升高（P<0.05），IL-6的含量有升高趋势，但无显著差异（P>0.05）。试验结果表明，PRRSV可能通过mTOR调控HIF-1α的表达，进而促进炎症细胞因子表达。

2.4 mTORC1调控HIF-1α表达的机制

试验结果显示，转染si-TSC2抑制TSC2可使mTOR活化的猪肺泡巨噬细胞3D4/21中p-S6和HIF-1α蛋白含量均显著升高（图4-A），表明上调mTOR的表达能促进HIF-1α表达，mTOR对HIF-1α蛋白可能具有调控作用。Western Blot结果显示，抑制剂Rapa和KU0063794均能抑制猪肺泡巨噬细胞3D4/21 p-S6蛋白表达，Rapa抑制mTORC1活性后猪肺泡巨噬细胞3D4/21 HIF-1α的表达量明显降低，而与Rapa处理组相比，KU0063794组细胞HIF-1α表达没有被更明显地抑制（图4-B），表明mTOR蛋白主要通过mTORC1上调HIF-1α表达。

2.5 PRRSV通过mTORC1上调HIF-1α促进炎症因子的表达

Western Blot结果显示，过表达mTORC1的3D4/21细胞在感染PRRSV后，mTORC1下游靶点p-S6表达升高，HIF-1α水平上调，PRRSV M蛋白水平提高（图5-A）。与CK组相比，mTORC1过表达试验组细胞上清液中IL-1β含量极显著升高（P<0.01），IL-6和TNF-α的含量均显著升高（P<0.05）（图5-B、C、D）。试验结果表明，PRRSV通过mTORC1调控HIF-1α促进炎症细胞因子表达。

3 讨 论

PRRSV可导致猪的繁殖障碍和严重的呼吸困难，是危害生猪生产最重要的疾病之一，给全球养猪业造成重大的经济损失。肺脏是PRRSV侵袭的主要器官，猪肺泡巨噬细胞是PRRSV的主要靶细胞和感染期间病毒复制的主要场所。PRRSV造成猪群呼吸困难可能是肺部炎症细胞因子释放的结果，促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等高度表达，迅速引起肺水肿、出血、肺炎和毛细支气管炎^［17-19］。免疫细胞感染病毒后能量代谢由氧化磷酸化代谢转变为有氧糖酵解代谢^［20］，这种转变称为“Warburg效应”。这种代谢重编程可能通过诱导细胞内缺氧微环境，激活具有广泛靶基因谱的转录活性核蛋白HIF-1α，其可调控缺氧适应、糖酵解代谢及炎症反应（如IL-1β、IL-6等）相关的近100种靶基因^［21］。本研究发现，PRRSV感染的仔猪肺脏和3D4/21细胞中HIF-1α蛋白和mRNA表达量升高，并且HIF-1α表达与mTOR信号通路有关，主要受mTORC1调控。

已有的研究表明，HIF-1α和糖酵解途径的代谢物能够促进炎症，HIF-1α直接或间接参与了免疫反应调控，并且在此过程中发挥着重要的作用^［21-22］。研究发现，HIF-1α可促进SARS-CoV-2、IAV 复制，诱导炎性细胞因子表达，抑制HIF-1α会下调炎性细胞因子表达量^［23-24］。PANG等^［25］研究表明，PRRSV nsp1β可通过抑制HIF-1α泛素化降解而发挥稳定HIF-1α蛋白作用。本研究结果显示，HIF-1α蛋白及mRNA在正常肺脏和3D4/21细胞中含量较低，而在感染PRRSV后蛋白含量迅速升高3~4倍，mRNA转录水平提高2~3倍，表明PRRSV感染促进了肺脏组织和3D4/21细胞内HIF-1α mRNA转录及蛋白翻译，在感染过程中HIF-1α含量维持在较高水平。用BAY87-2243抑制HIF-1α后，PRRSV诱导IL-1β、IL-6和TNF-α炎症细胞因子水平显著降低，而CoCl₂则具有相反的作用，表明PRRSV可通过提高HIF-1α含量而促进炎症细胞因子表达。试验结果表明，HIF-1α通过诱导IL-1β等炎症因子间接促进PRRSV复制，提示病毒可能同时利用“直接蛋白稳定”和“炎症微环境重塑”双策略增强复制能力。

研究表明，抑制mTOR可显著降低HIF-1α含量，同时炎症因子表达下降，表明mTOR-HIF-1α轴在炎症因子网络中具有核心调控作用^［26］。本研究结果显示，PRRSV感染3D4/21细胞后，mTOR磷酸化水平升高，表明PRRSV感染可促进mTOR磷酸化，进而促进mTOR表达，与现有研究报道^［27］一致。mTOR抑制剂Rapa处理组3D4/21细胞内HIF-1α蛋白的水平降低，而在Rapa基础上同时添加HIF-1α的稳定剂CoCl₂后可提高HIF-1α蛋白水平。ELISA结果显示，mTOR抑制剂Rapa可降低PRRSV感染诱导IL-1β、IL-6和TNF-α细胞因子水平，在Rapa基础上同时添加HIF-1α的稳定剂CoCl₂后IL-1β、IL-6和TNF-α细胞因子显著回升。试验结果表明，PRRSV可通过促进mTOR磷酸化而调节细胞内HIF-1α的水平，进而促进炎症细胞因子的产生。

TSC2突变失活或缺失会导致mTOR过度活化。本试验使用TSC2的特异性siRNA抑制TSC2表达活化mTOR，结果显示HIF-1α蛋白水平升高，表明mTOR能调控HIF-1α蛋白，这与SAXTON等^［28］的研究结果一致。在mTOR活化的细胞中使用mTORC1抑制剂Rapa，HIF-1α蛋白水平显著降低；在mTOR活化的细胞中使用mTORC1和mTORC2的抑制剂KU0063794，HIF-1α蛋白水平没有更明显的降低，表明mTOR蛋白主要通过mTORC1调控HIF-1α表达。为了进一步检测mTORC1在PRRSV调控HIF-1α表达中的作用，将mTORC1过表达质粒转染3D4/21细胞，mTORC1过表达后其下游靶点p-S6表达水平升高，而且HIF-1α、PRRSV M蛋白水平和IL-6、TNF-α含量均显著升高，表明提高mTORC1蛋白水平可促进PRRSV诱导的HIF-1α蛋白表达，进而促进炎症细胞因子表达。

参考文献

[1] YU Y， ZHANG Q， CAO Z，et al.Recent advances in porcine reproductive and respiratory syndrome virus NADC30-like research in China：molecular characterization，pathogenicity，and control［J］.Front Microbiol，2021，12：791313.

[2] ZHOU L， HAN J， YANG H C.The evolution and diversity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China［J］.Veterinary Microbiology，2024，298：110252.

[3] GAO P， LIU Y Y， WANG H，et al.Viral evasion of PKR restriction by reprogramming cellular stress granules［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2022，119（29）： e2201169119.

[4] 魏春华，刘建奎，戴爱玲，等.福建NADC30-like PRRSV FJLY01株的全基因组分子特征分析［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2017，45（3）：51-60，67.

[5] WEI C H， LIU J K， DAI A L，et al.Whole genome molecular feature analysis of Fujian NADC30⁃like PRRSV FJLY01 strain［J］.Journal of Northwest A&F University （Natural Science Edition），2017，45（3）：51-60， 67.

[6] CHEN D J， XU S K， JIANG R J，et al.IL-1β induced by PRRSV co-infection inhibited CSFV C-strain proliferation via the TLR4/NF-κB/MAPK pathways and the NLRP3 inflammasome［J］.Veterinary Microbiology，2022，273：109513.

[7] MA Y， HAN Y， WANG P，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus activates lipid synthesis through a ROS-dependent AKT/PCK1/INSIG/SREBPs axis［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2024，282：136720.

[8] LI H W， YANG X T， SONG Y Z，et al.PRRSV infection activates NLRP3 inflammasome through inducing cytosolic mitochondrial DNA stress［J］.Veterinary Microbiology，2023，279：109673.

[9] FAN J， LV H， LI J，et al.Roles of Nrf2/HO‐1 and HIF‐1α/VEGF in lung tissue injury and repair following cerebral ischemia/reperfusion injury［J］.Journal of Cellular Physiology，2019，234（6）：7695-7707.

[10] HU L， ZENG Z， XIA Q，et al.Metformin attenuates hepatoma cell proliferation by decreasing glycolytic flux through the HIF-1α/PFKFB3/PFK1 pathway［J］.Life Sciences，2019，239：116966.

[11] ZHUANG X， PEDROZA-PACHECO I， NAWROTH I，et al.Hypoxic microenvironment shapes HIV-1 replication and latency ［J］. Commun Biol，2020，3（1）：376.

[12] MOIN S M， CHANDRA V， ARYA R，et al.The hepatitis E virus ORF3 protein stabilizes HIF-1alpha and enhances HIF-1-mediated transcriptional activity through p300/CBP［J］.Cellular Microbiology，2009，11（9）：1409-1421.

[13] MORRIS D R， QU Y， AGRAWAL A，et al.HIF-1alpha modulates core metabolism and virus replication in primary airway epithelial cells infected with respiratory syncytial virus ［J］.Viruses，2020，12（10）：1088.

[14] SÁNCHEZ-CARVAJAL J M， RODRÍGUEZ-GÓMEZ I M， RUEDAS-TORRES I，et al.Activation of pro-and anti-inflammatory responses in lung tissue injury during the acute phase of PRRSV-1 infection with the virulent strain Lena［J］.Veterinary Microbiology，2020，246：108744.

[15] EATON C W， VU H L， HODGES A L，et al.Host-genetic-based outcome of co-infection by PCV2b and PRRSV in pigs［J］.Journal of Animal Science，2023，3（101）：1-10.

[16] 段滇宁，李雅楠，梁燕娇，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导巨噬细胞糖酵解促进病毒复制［J］.生物工程学报，2024，40（12）：4546-4556.

[17] DUAN D N， LI Y N， LIANG Y J，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces macrophage glycolysis to promote virus replication［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2024，40 （12）：4546-4556.

[18] LIU J K， LIU C， XU Y，et al.Molecular characteristics and pathogenicity of a novel recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain from NADC30-，NADC34-，and JXA1-like strains that emerged in China［J］.Microbiology Spectrum，2022，10（6）：e02667-02622.

[19] HAN D， HU Y， LI L，et al.Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection results in acute lung injury of the infected pigs［J］.Veterinary Microbio-logy，2014，169（3/4）：135-146.

[20] GUO B， LAGER K M， HENNINGSON J N，et al.Experimental infection of United States swine with a Chinese highly pathogenic strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Virology，2013，435（2）：372-384.

[21] 孙盼盼，曹志刚，凌小雅，等.苦参碱联合不同抗生素抗炎作用比较研究［J］.畜牧兽医学报，2023，54（10）：4411-4421.

[22] SUN P P， CAO Z G， LING X Y，et al.Comparative study on the anti-inflammatory effects of matrine combined with different antibiotics［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2023，54（10）：4411-4421.

[23] HOTAMISLIGIL G S.Inflammation，metaflammation and immunometabolic disorders［J］.Nature，2017，542（7640）：177-185.

[24] MCGETTRICK A F， O’NEILL L A J.The role of HIF in immunity and inflammation［J］.Cell Metab，2020，32（4）：524-536.

[25] REYES A， CORRALES N， GALVEZ N M S，et al.Contribution of hypoxia inducible factor-1 during viral infections［J］.Virulence，2020，11（1）：1482-1500.

[26] TIAN M， LIU W， LI X，et al.HIF-1α promotes SARS-CoV-2 infection and aggravates inflammatory responses to COVID-19［J］.Signal Transduction and Targeted Therapy，2021，6（1）：308.

[27] ZHU B， WU Y， HUANG S，et al.Uncoupling of macrophage inflammation from self-renewal modulates host recovery from respiratory viral infection［J］.Immunity，2021，54（6）：1200-1218.e1209.

[28] PANG Y， ZHOU Y， WANG Y，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp1β stabilizes HIF-1α to enhance viral replication［J］.Microbiology Spectrum，2022，10（6）：e03173-03122.

[29] SHI L Z， WANG R， HUANG G，et al.HIF1alpha-dependent glycolytic pathway orchestrates a metabolic checkpoint for the differentiation of TH17 and Treg cells［J］.Journal of Experimental Medicine，2011，208（7）：1367-1376.

[30] WEI R， ZHANG X， WANG X，et al.PDCD4 restricts PRRSV replication in an eIF4A-dependent manner and is antagonized by the viral nonstructural protein 9［J］.Journal of Virology，2024，98（5）：e00060-00024.

[31] SAXTON R A， SABATINI D M.mTOR signaling in growth，metabolism，and disease［J］.Cell，2017，169（2）：361-371.

基金资助

国家自然科学基金项目(32102628)

福建省自然科学基金项目(2022J011157)

龙岩学院博士科研启动基金项目(LB2022009)