茶梅花叶病病毒种类鉴定及多重PCR检测技术建立

Identification of virus species of Camellia sasanqua mosaic disease and establishment of multiplex PCR detection technology

摘要

目的 明确引起茶梅（Camellia sasanqua）花叶病的病毒种类和主要病毒的全基因组序列，建立可靠的病毒分子检测技术，为茶梅病毒病的早期诊断和抗病毒育种提供参考。 方法 以2022年7月至2024年3月，采自陕西、浙江、福建和江苏地区具有黄化、褪绿、植株矮小等症状的茶梅叶片为材料，通过小RNA（sRNA）测序技术鉴定茶梅花叶病的病毒种类，并克隆病毒的全基因组序列，研究其分子变异情况。建立茶梅3种病毒一步法多重RT-PCR（mRT-PCR）快速诊断技术并进行优化。 结果 在表现花叶症状的茶梅叶片中检测到山茶环斑相关病毒3 （camellia ringspot-associated virus 3，CRSaV-3）、山茶黄化环斑病毒（camellia yellow ringspot virus，CaYRSV）和山茶乙型线形相关病毒3（camellia japonica associated metaflexid virus 3，CjBV-3）3种病毒。系统发育结果显示，茶梅3种病毒分子变异较小，但与来源于山茶花（C. japonica）的分离物相比，仍然存在较大的分子变异。建立了3种茶梅病毒一步法mRT-PCR检测技术，该检测技术具有快速、高效、操作简便等优点。 结论 首次鉴定了茶梅花叶病的病毒种类，克隆获得3种茶梅病毒的11条全基因组序列，建立了茶梅病毒mRT-PCR检测技术，该技术具有快速、高效、操作简便等特点，可用于CRSaV-3、CaYRSV和CjBV-3的快速检测。

Abstract

Objective This research aims to determine the species of viruses that cause Camellia sasanqua mosaic disease and the complete genome sequences of the main viruses，and develop reliable molecular detection protocols to facilitate early disease diagnosis and support antiviral breeding. Method C.sasanqua leaves were collected from symptomatic plants exhibiting yellowing，chlorosis，and dwarf in Shaanxi，Zhejiang，Fujian，and Jiangsu from July 2022 to March 2024.Small RNA （sRNA） sequencing was used to identify the virus species，and the complete genome sequence was obtained to study its molecular variation.A one-step multiplex RT-PCR （mRT-PCR） rapid diagnosis technology for three viruses of C.sasanqua mosaic disease was established and optimized. Result Three viruses，including camellia ringspot-associated virus 3 （CRSaV-3），camellia yellow ringspot virus （CaYRSV） and camellia japonica associated metaflexid virus 3 （CjBV-3），were identified in C. sasanqua with mosaic symptoms.The phylogenetic analysis revealed that these three viruses in C.sasanqua exhibited relatively low levels of molecular variation，but significant difference still can be observed compared to the isolates derived from C.japonica.In addition，a one-step mRT-PCR detection technique for these three viruses of C.sasanqua mosaic disease was established with advantages of rapidity，high efficiency and simple operation. Conclusion This work firstly identified the viruses associated with C. sasanqua mosaic disease，and 11 complete genome sequences of them were cloned successfully.A mRT-PCR detection technology for these virus was established，which was fast，efficient，and easy to operate for detection of CRSaV-3，CaYRSV，and CjBV-3.

Graphical abstract

关键词

茶梅花叶病 / 病毒鉴定 / 多重RT-PCR（mRT-PCR）

Key words

Camellia sasanqua mosaic disease / virus identification / multiplex RT-PCR（mRT-PCR）

茶梅（Camellia sasanqua Thunb.）是山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）的一种园艺观赏植物^［1］。据史书记载，茶梅原产于中国，因其树形优美、花叶繁盛、着花量多且花期长而备受人们喜爱，既可孤植于庭院和草坪中，也可与其他花灌木配置花坛、花境，具有很高的经济效益和社会效益。然而，随着茶梅栽培面积扩大，一些茶梅病害相继被报道，叶片病害的发生降低了茶梅的观赏性，给生产带来严重的经济损失^［2-4］。茶梅花叶病是一类由植物病毒引起的病害，受病毒侵染的茶梅叶片主要表现为花叶、黄化、褪绿等症状，严重影响茶梅的观赏价值。

二代测序技术（next-generation sequencing technology，NGS）以其高通量、不依赖已知核酸序列、高灵敏度等优点，在新病毒发现、已知病原识别、基因组遗传多样性与演化分析等方面得到了广泛的应用^［5-6］。陈方淇等^［7］利用小RNA测序技术在紫花苜蓿中检测到5种病毒；李梦^［8］利用小RNA测序技术明确了侵染兰州百合的病毒种类；荆陈沉等^［9］利用小RNA测序技术结合RT-PCR，明确了侵染山西番茄的病毒种类及其复合侵染类型。

目前，引起茶梅花叶病的病毒种类尚未见报道，严重阻碍了该病的快速检测、生物学、基因组学和流行病学相关研究。为了广泛推广栽培茶梅，减轻或避免病毒病的发生为害，本研究通过小RNA测序技术鉴定茶梅花叶病的病毒种类，明确主要病毒的全基因组序列，并建立灵敏度高、特异性强的检测技术，为茶梅花叶病的预测预报和综合防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 茶梅叶片收集

2022年7月至2024年3月，在陕西、浙江、福建和江苏收集叶片黄化、褪绿、植株矮小等疑似病毒侵染的茶梅植株叶片，置于-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

2×Taq MasterMix、OmniPlant RNA Kit（DNase I）、Gel Extraction Micro Kit，均购自北京康为世纪；pBM16A Toposmart Cloning Kit，购自北京博迈德；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、Phusion™Plus DNA Polymerase，购自Thermo Fisher Scientific；HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit（Dye Plus），购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；SMARTer RACE 5' 3' Kit（TaKaRa），购自宝生物工程（大连）有限公司；其他试剂均为实验室常规试剂。

1.3 小RNA（sRNA）测序

将采集的具有花叶、褪绿、植株矮小等症状的茶梅叶片，送至北京百迈客生物科技有限公司进行高通量测序。

1.4 病毒特异性检测和全基因组扩增引物设计

根据小RNA测序结果，通过Blast比对找到sRNA在病毒基因组中的位置，设计病毒特异性检测引物，用于验证sRNA测序数据及病毒基因组扩增。引物信息详见表1，引物由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。

1.5 茶梅总RNA提取及cDNA合成

取100 mg茶梅叶片，在液氮中迅速研磨成粉状，使用OmniPlant RNA Kit（DNase I）提取茶梅总RNA；取3 μL RNA，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA。

1.6 PCR检测及克隆测序

PCR反应体系：cDNA 1 μL，正、反向引物各1 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，ddH₂O 9.5 μL。反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火温度（详见表1）下退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；72 ℃终延伸5 min。目的条带经Gel Extraction Micro Kit回收后连接至pBM16A载体上，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，每个基因挑取3个阳性克隆，送西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行测序。

1.7 病毒全基因组扩增与分析

选择来自陕西、浙江、江苏和福建的茶梅花叶样本，待RT-PCR确认阳性后，病毒基因组采用长链PCR进行扩增，病毒末端序列采用SMARTer RACE 5' 3' Kit进行扩增。PCR反应体系（50 μL）： 5× Phusion™ Plus Buffer 10 μL，正、反向引物各2.5 μL， dNTPs 1 μL， cDNA 2 μL， Phusion™ Plus DNA Polymerase 0.5 μL， ddH₂O 31.5 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸2 min，循环30次；72 ℃终延伸5 min。长链PCR产物直接测序，RACE产物回收连接pBM16A载体，经转化后测序。使用ContigExpress软件，将测序得到的序列进行拼接，获得病毒全基因组序列。使用MEGA 7.0，采用Neighbor-Joining （NJ）法构建病毒系统发育树，各分支置信度（Bootstrap）进行10 000次重复分析。

1.8 茶梅病毒mRT-PCR检测技术的建立与优化

根据病毒全基因组比对结果，在其保守区域设计3种茶梅病毒及内参基因的特异性检测引物，引物信息详见表2。先用单一RT-PCR检测引物的特异性，然后利用HiScript One Step RT-PCR Kit初步建立以RNA为模板的mRT-PCR多重检测技术。基础反应体系： 茶梅总RNA 2.5 μL， 2×One Step Mix 25 μL， One Step Enzyme Mix 2.5 μL，正、反向引物各2 μL，RNase-free H₂O 16 μL。反应程序：50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸7 min。取3 μL PCR产物进行凝胶电泳检测。

在初步建立的mRT-PCR检测方法基础上，分别对反应体系中的引物浓度和反应程序中的退火温度、延伸时间、循环次数进行优化。其中引物浓度设0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 μmol/L 5个处理，退火温度设50，52，54，56，58和60 ℃ 6个处理，延伸时间设30，45，60，75和90 s 5个处理，循环次数设25，30，35，40和45共5个处理，最终确定多重PCR反应的最佳反应体系和反应程序。

1.9 多重PCR检测技术的灵敏度测定

以同时携带CRSaV-3、CjBV-3和CaYRSV 3种病毒的茶梅总RNA为模板，对模板进行10倍梯度稀释，比较单重PCR和多重PCR检测的灵敏度。

1.10 多重PCR检测技术的应用

从陕西省安康市陕南花木大世界收集茶梅样本44份，编号依次为1~44，其中2，6，9，29，36叶片褪绿；3，4，5，11，13，15，17，19，21，22，23，28，32，34，37，38，39，42，44叶片边缘黄花；1，12，14，18，20，25，35，40，43叶片褪绿且边缘黄化；16和27植株矮小，新叶轻微坏死斑；7，8，10，24，26，41，30，31，33无明显症状。利用建立好的一步法mRT-PCR体系对其茶梅病毒进行检测，以评价该方法的稳定性和准确性。

2 结果与分析

2.1 茶梅花叶病sRNA测序结果分析

茶梅花叶病叶片样品经sRNA测序获得22 661 329条raw reads，去除不合格reads，得到19 580 971条clean reads。利用Velnet软件将测序获得的sRNA拼接组装成病毒的重叠群，共获得4 540 contigs，contigs长度主要集中在30~60 nt，之后与NCBI RNA病毒数据库进行比对，结果显示采集的茶梅花叶病叶片样本中可能存在CRSaV-3、CjBV-3和CaYRSV 3种病毒。RT-PCR均能扩增到与预期大小一致的单一条带，经克隆测序后证实，茶梅花叶病样本中存在CRSaV-3、CjBV-3和CaYRSV病毒。

2.2 3种茶梅病毒全基因组扩增与系统发育分析

根据sRNA测序结果，分析sRNA在病毒基因组的位置，设计特异性扩增引物，使用RT-PCR对病毒基因组进行长片段扩增，获得与预期大小一致的片段（图1）。

在基因组末端设计RACE引物，分别以3′RACE-ready cDNA 和 5′RACE-ready cDNA为模板，使用特异性引物和UPM通用引物进行扩增，得到的扩增条带与预期引物设计的大小相符合。经测序拼接后共获得完整病毒基因组序列11条，上传GenBank并获得Access number：PQ741448-PQ741462。

CRSaV-3属于乙型线形病毒科（Betaflexiviridae）发状病毒属（Capillovirus）成员，基因组属于+ssRNA，本研究共获得5个分离物，分别来自陕西、江苏、福建、浙江，其全基因组大小为7 375~7 451 nt，与已报道的来自美国的CRSaV-3山茶分离物核苷酸一致性为92%~93%。以同属成员苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus，ASGV）为外部根，系统发育树结果（图2）显示，CRSaV-3山茶分离物和茶梅分离物之间存在较大的分子变异，且不同地理来源CRSaV-3均为单独分支。这表明CRSaV-3的群体遗传结构与地理位置有一定相关性，还需要更多的基因组序列共同分析才能证实。

CjBV-3属于乙型线形病毒科（Betaflexiviridae）李病毒属（Prunevirus）成员，是山茶环斑相关病毒2（camellia ringspot-associated virus 2，CRSaV-2）的一个突变体，本研究获得了CjBV-3陕西和浙江茶梅分离物序列信息，其基因组全长分别为7 794和7 795 nt，不包含Poly（A），与已报道的意大利和美国山茶分离物核苷酸一致性为84%~96%。以同属成员猕猴桃种传潜隐病毒（actinidia seed borne latent virus，ASbLV）为外部根，系统发育树结果（图3）显示，CjBV-3茶梅分离物与意大利山茶分离物之间的亲缘关系较近，而与美国山茶分离物之间存在较大的分子变异。

CaYRSV属于悬钩子病毒属（Idaeovirus），该属暂没有科的分类阶元。本研究共获得了陕西、江苏和浙江共4个分离物序列信息。CaYRSV基因组为三分子线形+ssRNA，其中RNA1长5 321~5 331 nt；RNA2长2 215~2 253 nt；RNA 3是亚基因组片段，编码病毒外壳蛋白，基因大小为813 nt。以该属模式种悬钩子丛矮病毒（raspberry bushy dwarf virus， RBDV）为外部根构建进化树，结果（图4）显示CaYRSV的RNA1和RNA2基因组似乎存在一定的地理位置相关性，不同地理位置来源的病毒分离物均处于单独分支，且RNA1和RNA2进化似乎是独立的，来源于陕西的CaYRSV RNA1与重庆的山茶分离物关系最近，而来源于浙江的CaYRSV RNA2与重庆的山茶分离物关系最近。

2.3 茶梅病毒病一步法mRT-PCR快速检测技术的建立与优化

本研究针对茶梅3种病毒设计多重检测引物，首先利用单一PCR检测引物的特异性，经验证，3种病毒和茶梅内参基因EF-1α的扩增条带单一，无其他杂带，可用于多重检测（图5）。

以mRT-PCR基础反应参数为初始条件，通过单一条件优化，确定多重PCR的最佳反应体系和反应程序。结果（图6）表明，当反应体系引物浓度为0.2 μmol/L时，3种病毒的扩增片段及内参基因条带亮度最高且均一；当退火温度为54 ℃时，3种病毒目的片段及内参基因条带最清晰；延伸时间对体系影响较小，在30~90 s均能扩增出清晰的条带，当延伸时间高于45 s时，条带亮度无变化，因此确定最优延伸时间为45 s；循环次数为35次时，所有条带最清晰。最终确定mRT-PCR反应条件及参数为：茶梅总RNA 2.5 μL，各引物浓度0.2 μmol/L，50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃终延伸7 min。

2.4 RT-PCR和mRT-PCR灵敏度比较

对同时携带CRSaV-3、CjBV-3和CaYRSV 3种病毒的茶梅总RNA进行10倍梯度稀释，采用单一引物和多重引物进行灵敏度检测，结果（图7）显示，mRT-PCR检测灵敏度与RT-PCR相当。

2.5 茶梅样品的mRT-PCR检测

从陕南花木大世界收集到44份茶梅叶片样品，多重PCR检测结果（图8）表明，茶梅病毒病田间复合侵染普遍，但在无症状的叶片中未检测到病毒。

3 讨论

中国是许多山茶属植物的原产地，规模化种植为病害的发生流行创造了有利条件。植物病毒病是一类重要病害^［10］，几乎在所有园艺作物上都有发生，对世界农业和园艺生产造成持续性为害。茶梅是当今山茶属中四大观赏树种之一，有着“阳光茶花”的美誉，广泛应用于园林绿化工程中^［11］。山茶科植物病毒病相关研究有限^［12-14］，目前仅在茶树^［15］、油茶^［16］和山茶^［17］上有病毒病的报道，共涉及16种病毒，分布于9科12属。截至目前，尚未见侵染茶梅的病毒种类报道，但茶梅花叶病在田间发生普遍。由于不清楚病毒种类以及病毒为害特征、传播方式等基础信息，加之茶梅生产中多采用扦插繁殖，种质资源的国际交流日益频繁，病毒传播速度快、面积广，无法开展有针对性的防治工作。为了解决这一问题，本研究运用小RNA深度测序技术对茶梅病毒病进行种类鉴定，并对3种茶梅病毒的全基因组进行克隆分析，建立了一步法mRT-PCR快速高效检测技术，为茶梅病害的分子检测、病害测报、抗病毒育种等研究提供科学依据。

小RNA测序技术在植物病毒的鉴定中发挥着重要作用^［18-19］。当病毒侵染植物后，可诱导产生双链小分子RNA（dsRNA）；dsRNA在Dicer酶的作用下，加工得到小干扰RNA（small interfere RNA，siRNA）；siRNA渗入RNA诱导沉默复合物去识别目标病毒序列，并与之结合，降解病毒片段。因此，对小RNA进行高通量测序，获得与病毒序列高度一致的siRNA序列，再通过重新组装获得病毒基因组信息，为植物病毒鉴定提供证据。

多重PCR检测技术可同时扩增多个目的基因，具有高效、方便、省时省工等优势，广泛应用于植物病毒病害检测^［20-23］。周涛等^［24］基于二代测序技术，发现5种病毒侵染雪茄烟，并成功建立了雪茄烟病害多重RT-PCR检测方法；丁超^［25］依据病毒编码的外壳蛋白编码序列，设计针对辣椒病毒的3对PCR检测引物，建立了可同时检测TMV、PMMoV和CMV的多重RT-PCR技术。传统的mRT-PCR设计多采用反转录和PCR分开进行，且多以cDNA为模板进行优化，虽然cDNA模板不易降解，但试验步骤较多，耗时较长，反转录和PCR分开操作也容易带来污染问题。本研究优化了检测步骤，直接以茶梅总RNA为模板，开发了一步法mRT-PCR检测技术，节约了时间，简化了试验步骤，同时降低了污染风险。另外，由于RNase广泛存在于环境中，茶梅总RNA在提取过程中可能因为操作不当或环境问题导致RNA降解，从而影响病毒检测的准确性。对此，快速检测体系引入了茶梅内参基因EF-1α，最大限度避免了检测中出现的假阴性问题。

4 结论

本研究首次鉴定了茶梅花叶病的病毒种类，克隆了CRSaV-3、CaYRSV和CjBV-3病毒的全基因组序列，并建立了这3种茶梅病毒一步法mRT-PCR检测技术，为茶梅病毒病预测预报和有效防治提供参考。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32000123)

陕西省重点研发计划项目(2024NC-YBXM-058)

陕西省高校青年创新团队项目(2023AYTD01)

陕西省教育厅协同创新中心项目(23JY003)

国家级大学生创新训练项目(202211397007)

国家级大学生创新训练项目(202411397014)