4种牛呼吸道病毒多重TaqMan RT-qPCR检测方法的建立及初步应用

摘要

【目的】建立牛冠状病毒（BCoV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛副流感病毒3型（BPIV-3）及牛腺病毒3型（BAdV-3）等4种可引起牛呼吸道疾病（BRD）病毒的多重TaqMan RT-qPCR检测方法，为BCoV、BRSV、BPIV-3和BAdV-3的检测提供技术支持。【方法】针对BCoV、BRSV、BPIV-3的N基因和BAdV-3的Hexon基因保守片段设计特异性引物及探针，对引物和探针浓度、退火温度等条件进行优化，建立四重TaqMan RT-qPCR检测方法，并对该方法的特异性、敏感性及重复性进行评价。用建立的方法对248份临床样品进行检测，同时与常规RTPCR检测方法的结果进行比较。【结果】建立的检测方法标准曲线线性关系良好，可特异性地检测BCoV、BRSV、BPIV-3和BAdV-3，检测敏感性均为1×10～3拷贝/μL；批内重复变异系数均小于3%，批间重复变异系数均小于5%。248份临床样品检测结果显示，四重TaqMan RT-qPCR检测BCoV、BRSV、BPIV-3及BAdV-3的阳性率分别为12.5%,14.9%,3.63%和5.65%，与常规RT-PCR检测结果符合率分别为97.18%,95.56%,97.58%和97.98%。【结论】建立了BCoV、BRSV、BPIV-3和BAdV-3四重TaqMan RT-qPCR检测方法，该方法具有良好的敏感性、特异性及重复性，检测结果稳定可靠。

关键词

牛冠状病毒 / 牛呼吸道合胞体病毒 / 牛腺病毒3型 / 牛副流感病毒3型 / 多重TaqMan实时荧光定量PCR