4种牛呼吸道病毒多重TaqMan RT⁃qPCR检测方法的建立及初步应用

Establishment and preliminary application of a quadruplex TaqMan RT⁃qPCR assay for detection of 4 bovine respiratory viruses

摘要

目的 建立牛冠状病毒（BCoV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛副流感病毒3型（BPIV-3）及牛腺病毒3型（BAdV-3）等4种可引起牛呼吸道疾病（BRD）病毒的多重TaqMan RT-qPCR检测方法，为BCoV、BRSV、BPIV-3和BAdV-3的检测提供技术支持。 方法 针对BCoV、BRSV、BPIV-3的N基因和BAdV-3的Hexon基因保守片段设计特异性引物及探针，对引物和探针浓度、退火温度等条件进行优化，建立四重TaqMan RT-qPCR检测方法，并对该方法的特异性、敏感性及重复性进行评价。用建立的方法对248份临床样品进行检测，同时与常规RT-PCR检测方法的结果进行比较。 结果 建立的检测方法标准曲线线性关系良好，可特异性地检测BCoV、BRSV、BPIV-3和BAdV-3，检测敏感性均为1×10³ 拷贝/µL；批内重复变异系数均小于3%，批间重复变异系数均小于5%。248份临床样品检测结果显示，四重TaqMan RT-qPCR检测BCoV、BRSV、BPIV-3及BAdV-3的阳性率分别为12.5%，14.9%，3.63%和5.65%，与常规RT-PCR检测结果符合率分别为97.18%，95.56%，97.58%和97.98%。 结论 建立了BCoV、BRSV、BPIV-3和BAdV-3 四重TaqMan RT-qPCR检测方法，该方法具有良好的敏感性、特异性及重复性，检测结果稳定可靠。

Abstract

Objective This research aims to establish a multiplex TaqMan RT-qPCR assay for simultaneous detection of four viruses that causes bovine respiratory disease （BRD）：bovine coronavirus （BCoV），bovine respiratory syncytial virus （BRSV），bovine parainfluenza virus type 3 （BPIV-3），and bovine adenovirus type 3 （BAdV-3），providing technical support for the diagnosis of such viruses. Method Specific primers and probes were designed for conserved regions of the N gene of BCoV，BRSV，BPIV-3，and the Hexon gene of BAdV-3.Reaction conditions，including primer and probe concentrations and annealing temperature，were optimized to establish a quadruplex TaqMan RT-qPCR assay.The specificity， sensitivity， and repeatability of the assay were then evaluated.The established assay was applied to test 248 clinical samples，and the results were compared with those obtained by conventional RT-PCR. Result The standard curves of the established assay demonstrated good linearity，and the assay specifically detected BCoV，BRSV，BPIV-3，and BAdV-3 with a sensitivity of 1×10³ copies/µL for each target.Intra-assay coefficients of variation （CVs） were less than 3%，and inter-assay CVs were less than 5%.The detection results of 248 clinical samples showed that the positive rates of the quadruplex TaqMan RT-qPCR assay for BCoV，BRSV，BPIV-3，and BAdV-3 were12.5%，14.9%，3.63%，and 5.65%，respectively.The concordance rates of these results with conventional RT-PCR assays were 97.18%，95.56%，97.58%，and 97.98% respectively. Conclusion A quadruplex TaqMan RT-qPCR assay for detecting BCoV，BRSV，BPIV-3，and BAdV-3 was established，which exhibited good sensitivity，specificity，repeatability，and reliable performance.

Graphical abstract

关键词

牛冠状病毒 / 牛呼吸道合胞体病毒 / 牛腺病毒3型 / 牛副流感病毒3型 / 多重TaqMan实时荧光定量PCR

Key words

bovine coronavirus / bovine respiratory syncytial virus / bovine adenovirus type 3 / bovine parainfluenza virus type 3 / multiple TaqMan RT-qPCR

牛呼吸道疾病是一种影响所有年龄段牛群的多因素疾病，病毒、细菌、支原体等病原体单独或合并感染都可导致发病^［1］。牛冠状病毒（bovine coronavirus，BCoV）、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3）和牛腺病毒3型（bovine adenovirus type 3，BAdV-3）感染是引发牛呼吸道和消化道疾病的常见病毒，给牛群健康带来严重威胁^［2-3］。BCoV感染症状具有年龄差异性，犊牛主要表现为水样腹泻、脱水和食欲减退，成年牛则以呼吸道症状（如咳嗽、流涕）为主，该病毒在低温环境下传播尤为迅速^［4-5］。BRSV感染常诱发高热、咳嗽及呼吸困难，犊牛因免疫系统不完善，易继发细菌性肺炎，导致生长停滞，呈秋末至早春地方性流行特征^［6-7］。BAdV-3感染可引起呼吸道症状、腹泻或结膜炎，该病毒易在应激或免疫抑制条件下爆发，给养殖管理带来诸多风险^［8-9］。BPIV-3感染后，牛只以发热、呼吸急促及支气管炎为典型特征，重症病例可发展为间质性肺炎，该病在冬春季节的高密度牛群中传播迅速，常与其他病原体协同作用，加剧混合感染风险^［10-12］。

目前，针对牛呼吸道病毒性疾病的检测方法仍存在诸多局限性。传统的病毒分离鉴定方法虽为检测的“金标准”^［13］，但其操作流程极为复杂繁琐，需要耗费大量时间，对实验设备及专业技术人员的要求高且检测灵敏度有限，难以满足快速、高效检测的实际需求^［14］。分子生物学检测方法，如普通聚合酶链反应（PCR）^［15］，虽然检测时间较短，但敏感性相对较低，低病毒载量的样本可能出现假阴性结果。血清学检测方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）等，操作相对简便，适合大规模样本的初步筛查^［16-17］，然而该法存在窗口期漏检的问题，即在病毒感染初期，机体尚未产生足够可检测到的抗体或抗原时，容易出现假阴性结果^［18］。多重实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测方法直接针对病毒的基因序列进行检测，在感染早期甚至潜伏期就能检测到病毒核酸，能够更精准地反映病毒感染的真实情况，特异性更强，降低了假阳性和假阴性结果出现的概率^［19］。为改善现有牛呼吸道病毒性疾病检测方法的不足，本研究建立了一种TaqMan RT-qPCR检测方法，旨在全面、快速、准确地检测上述4种牛呼吸道病毒，为牛呼吸道病毒性疾病的早期诊断、精准治疗以及科学防控策略的制定提供技术支撑与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材　料

1.1.1 生物材料

用于检测BAdV-3和BPIV-3的标准质粒，由北京擎科生物公司合成。用于构建BCoV和BRSV标准质粒的cDNA，由BCoV和BRSV核酸阳性鼻拭子RNA反转录获得。用于TaqMan RT-qPCR方法特异性检测的牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒cDNA及多杀性巴氏杆菌（ATCC12948）、溶血性曼氏杆菌（ATCC33396）、牛支原体（Y98），由甘肃农业大学动物医学院兽医微生物实验室保存。临床样本为甘肃省不同养殖场采集的235份牛鼻拭子和13份肛拭子。

1.1.2 主要试剂

大肠杆菌DH5α感受态细胞，购自生工生物（上海）股份有限公司；反转录试剂，购自武汉塞维尔生物科技有限公司；pMD19-T载体、单重TaqMan RT-qPCR试剂盒等，均购自Takara公司。病毒核酸提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒及多重TaqMan RT-qPCR试剂盒，均购自南京诺维赞生物科技股份有限公司。

1.1.3 主要仪器

凝胶成像分析系统：Bio-Rad Gel Doc XR+；Eppendorf PCR 仪，德国Eppendorf公司产品；LightCycler 96，瑞士罗氏公司产品；Pultton超微量紫外分光光度计，美国Plextech公司产品；CFX 96 Real-Time System，美国伯乐公司产品。

1.2 方　法

1.2.1 标准质粒的构建

利用病毒核酸提取试剂盒（货号：DC201）提取BCoV及BRSV核酸阳性鼻拭子RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用表1中的引物进行靶基因（N基因）扩增，扩增程序为：72 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，58 ℃（BCoV）、56 ℃（BRSV）退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，利用胶回收试剂盒（货号：DC301）回收目的基因。将回收后的目的片段克隆至pMD-19T载体，并转化至DH5α感受态细胞，过夜培养后进行菌落PCR检测，阳性克隆委托西安擎科生物有限公司鉴定，鉴定正确后提取质粒并测定浓度，分别命名为BCoV-19T、BRSV-19T。

为了获得BAdV-3及BPIV-3的标准质粒，选择BAdV-3 Hexon基因（GenBank登录号：OQ594952.1）的保守序列（890 bp）和BPIV-3 N基因（GenBank登录号：OM621819.1）保守序列（990 bp），委托北京擎科生物科技股份有限公司合成，并连接至pMD-19T载体，分别命名为BAdV-3-19T、BPIV-3-19T。

根据下式计算4种重组质粒含量：质粒含量（拷贝/μL）=（6.02×10²³）［质粒质量浓度（ng/μL）×10^-9］/（质粒长度×660）。

1.2.2 TaqMan RT-qPCR方法引物及探针的设计

根据制备的标准质粒序列，利用Oligo 6.0软件分别设计BCoV、BRSV、BPIV-3、BAdV-3的TaqMan RT-qPCR引物（F/R）及探针（P），探针5' 端设有发光基团，3' 端设有淬灭基团。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成，相关信息见表2。

1.2.3 单重TaqMan RT-qPCR方法引物及探针浓度的优化

分别以梯度稀释的BCoV-19T、BRSV-19T、BPIV-3-19T、BAdV-3-19T标准质粒为阳性对照，无菌无酶水为阴性对照，对单重荧光定量反应体系中不同引物和探针浓度的组合进行优化。试验设A~F共6组反应体系，具体如表3所示。扩增程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，40个循环。通过比较不同浓度引物探针组合标准曲线的相关系数（R²），筛选出最适探针引物浓度。

1.2.4 四重TaqMan RT-qPCR方法退火温度的优化

将BCoV-19T、BRSV-19T、BPIV-3-19T、BAdV-3-19T标准质粒分别10倍梯度稀释后等体积混合，使其含量为（1×10⁸）~（1×10¹） 拷贝/µL。以混合标准质粒作为模板进行四重TaqMan RT-qPCR扩增。按照已优化好的单重荧光定量引物及探针浓度，配制四重TaqMan RT-qPCR反应体系，设置不同退火温度，扩增程序为：37 ℃污染消化2 min；95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，55，56，57，58，60 ℃退火30 s，40个循环。根据循环阈值（Ct）构建标准曲线，选择R²最接近1组的退火温度为最佳退火温度。

1.2.5 四重TaqMan RT-qPCR方法标准曲线的建立

将BCoV-19T、BRSV-19T、BPIV-3-19T、BAdV-3-19T标准质粒分别10倍梯度稀释后等体积混合，使其含量为（1×10⁸）~（1×10³） 拷贝/µL，根据已优化的反应体系及条件进行扩增，利用CFX 96 Real-Time System扩增仪及软件生成4种病毒的标准曲线及扩增曲线。

1.2.6 四重TaqMan RT-qPCR方法敏感性检测

将BCoV-19T、BRSV-19T、BPIV-3-19T、BAdV-3-19T标准质粒分别10倍梯度稀释后等体积混合，使其含量为（1×10⁸）~（1×10¹） 拷贝/µL，进行四重TaqMan RT-qPCR扩增，通过分析不同含量标准质粒的Ct值，确定该方法能够检测到的最低模板含量，即为敏感性。

1.2.7 四重TaqMan RT-qPCR方法特异性检测

将BCoV-19T、BRSV-19T、BPIV-3-19T、BAdV-3-19T标准质粒分别10倍梯度稀释后等体积混合，选取1×10⁶ 拷贝/µL的混合标准质粒作为阳性标准对照，以无菌无酶水为阴性对照，以牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒cDNA及多杀性巴氏杆菌（ATCC12948）、溶血性曼氏杆菌（ATCC33396）、支原体（Y98）基因组DNA为模板，用所建立的四重TaqMan RT-qPCR方法进行扩增，观察特异性扩增曲线和Ct值。

1.2.8 四重TaqMan RT-qPCR方法重复性检测

将构建的BCoV-19T、BRSV-19T、BPIV-3-19T、BAdV-3-19T标准质粒分别10倍梯度稀释后等体积混合，使其含量为（1×10⁸）~（1×10³） 拷贝/µL，进行四重TaqMan RT-qPCR扩增，每个含量梯度设置3个重复，用于计算批内变异系数；上述方法分别独立重复3次，用于计算批间变异系数。变异系数（coefficient of variation，CV）＝（标准差/平均值）×100%。

1.2.9 临床样本检测

利用本研究所建立的四重TaqMan RT-qPCR方法，检测2024年从甘肃省各地区牛场采集的疑似或出现BRD症状牛的的235份鼻拭子和13份肛拭子中BCoV、BRSV、BPIV-3、BAdV-3的感染情况，同时进行常规RT-PCR检测，对比检测结果。

2 结果与分析

2.1 标准质粒的鉴定

利用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，对构建的标准质粒进行验证，结果表明，获得的特异性条带与预期大小（BCoV-19T为735 bp、BRSV-19T为769 bp）一致（图1），菌液PCR产物经擎科生物公司测序后结果正确，无突变。

2.2 单重TaqMan RT-qPCR方法引物及探针浓度优化

试验结果为：BCoV-19T的引物和探针浓度分别为0.2和0.1 µmol/L，BRSV-19T的引物和探针浓度均为0.2 µmol/L，BPIV-3-19T的引物和探针浓度分别为0.4和0.2 µmol/L，BAdV-3-19T的引物和探针浓度均为0.2 µmol/L。

2.3 四重TaqMan RT-qPCR方法退火温度优化

试验结果表明，在所有设定的退火温度下，4种标准质粒扩增曲线均表现良好，但退火温度为56 ℃时，其相关系数R²值最接近1，扩增曲线的线性关系最为理想，因此确定56 ℃作为四重TaqMan RT-qPCR方法的最佳退火温度。

2.4 四重TaqMan RT-qPCR方法反应体系与程序的建立

根据2.2和2.3节结果，可确定四重TaqMan RT-qPCR的反应体系和条件。反应体系优化参数如下：2×All-Powerful qPCR Premix 10 μL，BCoV、BRSV、BAdV-3 10 μmol/L上下游引物均各0.4 μL，BPIV 10 μmol/L的上下游引物各 0.8 μL，BCoV 10 μmol/L探针0.2 μL，BRSV、BPIV、BAdV 10 μmol/L探针各0.4 μL，混合cDNA模板2.0 μL，加无菌无酶水至20 μL。反应程序为：37 ℃污染消化2 min；95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，56 ℃退火30 s，40个循环。

2.5 四重TaqMan RT-qPCR方法标准曲线的建立

四重TaqMan RT-qPCR标准曲线如图2所示。

由图2可知，BCoV标准曲线R²为0.998 0，扩增效率为103.1%，线性方程为y=-3.269 1 x＋28.852；BRSV标准曲线R²为0.998 6，扩增效率为95.0%，线性方程为y=-3.447 1 x＋33.102；BPIV-3标准曲线R²为0.995 4，扩增效率为107.7%，线性方程为y=-3.136 0x＋33.243；BAdV-3标准曲线R²为0.998 6，扩增效率为105.7%，线性方程为y=-3.176 3x＋32.355。4种病毒的标准曲线R²均大于0.995，扩增效率均在90%~110%，表明标准质粒含量的常用对数值与循环阈值（Ct）呈现了良好的线性关系，引物与探针扩增效率较高，建立的四重TaqMan RT-qPCR反应体系稳定。

2.6 四重TaqMan RT-qPCR方法敏感性检测

由图3可知，四重TaqMan RT-qPCR方法检测BCoV-19T的最低模板浓度为1×10¹ 拷贝/μL，检测BRSV-19T和BAdV-3-19T的最低模板浓度均为1×10² 拷贝/μL，检测BPIV-3-19T的最低模板浓度为1×10³ 拷贝/μL。受样本复杂背景的干扰，不同靶标的扩增效率及信号稳定性具有差异性，在多重检测体系中，统一敏感性指标可有效避免因背景干扰导致的假阴性，为确保四重检测体系的可靠性并平衡多靶标同步检测的稳定性，本研究将最低检测限设定为1×10³ 拷贝/μL。

2.7 四重TaqMan RT-qPCR方法特异性检测

特异性检测结果（图4）显示， BCoV、BRSV、BPIV-3和BAdV-3均呈现典型的S型扩增曲线，而牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌及支原体等其他非靶标病原体均无扩增曲线。根据ISO 16140-2：2016计算交叉反应率^［21］，结果表明四重TaqMan RT-qPCR的交叉反应率为0%，证实该方法在复杂样本背景下仍能精准地区分目标病原，具有较强的特异性。

2.8 四重TaqMan RT-qPCR方法重复性检测

四重TaqMan qPCR方法的重复性验证结果表明，批内CV均≤2.02%，批间CV均≤4.38%（表4）。批内和批间CV均低于ISO 16140-2：2016的阈值要求（批内CV<5%，批间CV<10%）^［21］，证实该方法在不同病毒载量下均具有较高的可靠性，表明该方法重复性较好。

2.9 四重TaqMan RT-qPCR法对临床样本的检测

临床样本检测结果显示，四重TaqMan RT-qPCR方法对BCoV、BRSV、BPIV-3、BAdV-3的检出率分别为12.50%，14.90%，3.63%和5.65%，常规RT-PCR检出率分别为9.68%，10.48%，1.21%和3.63%，2种检测方法的符合率分别为97.18%，95.56%，97.98%和97.58%（表5）。

3 讨 论

本研究建立了一种可同步检测BCoV、BRSV、BPIV-3及BAdV-3的四重TaqMan RT-qPCR方法，填补了现有技术中针对这4种病毒多靶标同步筛查的技术空白，其核心在于靶基因的精准选择及反应体系的优化。选择BCoV、BRSV、BPIV-3的N基因与BAdV-3的Hexon基因作为特异性靶标，所设计的引物探针组可精准地区分目标病毒与其他病原体，避免了交叉反应导致的假阳性^［22］。其中，BCoV的N基因在病毒复制中起关键作用，其高度保守的序列特征确保了检测的特异性^［23］；BRSV的N基因与病毒核衣壳的形成与复制有关，可作为感染状态的分子标识^［24］；BAdV-3的Hexon基因作为病毒颗粒组装的核心结构，其保守性可确保检测的灵敏性^［25］；BPIV-3的N基因因其高度特异性而成为检测该病毒的重要分子标记^［26］。此外，通过对引物、探针浓度及退火温度等关键参数的优化，成功实现了单管四靶标的高效扩增，显著提升了多重检测的效能。

相较于现有的BCoV^［27］、BRSV^［28］、BPIV-3^［29］及BAdV-3^［30］单靶标检测技术，本研究通过设计多荧光通道探针，显著降低了背景荧光的干扰效应，突破了病原的样本限制，可以兼容鼻拭子及肛拭子等多样化样本，并显著缩短了检测周期。该方法可精准地区分4种目标病毒，扩增曲线峰型明确，且与其他常见牛病原体无交叉反应；灵敏度可达1×10³ 拷贝/μL，虽略低于部分单靶标检测技术的灵敏度，但符合世界动物卫生组织对临床样本病毒载量检测的实用性要求（≥10³ 拷贝/μL，可覆盖99%的阳性样本）^［31］；批内与批间重复性变异系数分别低于3%和5%。临床样本检测中，该方法阳性检出率较常规RT-PCR提升显著，符合率≥95.56%。在实际应用中，该方法能够迅速且准确地识别牛呼吸道样本中的病毒，有助于及时实施针对性治疗，降低疾病传播的风险。同时，该方法操作简便，对实验人员的专业技能要求不高，便于在基层兽医站和养殖场广泛推广使用。

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基金资助

国家自然科学青年基金项目(3240190813)

甘肃省高等学校创新基金项目(2022A-049)