人参(
Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科人参属多年生药用植物,是我国名贵的中药材,具有大补元气、固脱生津和安神益智等功效,药用价值广泛
[1],主要分布在中国东北长白山脉
[2]。人参性喜阴凉,由于生长环境的特殊且种植周期长,导致病害发生严重,对人参品质和产量造成严重影响
[3-4]。由恶疫霉(
Phytophthora cactorum)侵染引起的人参疫病是人参生产中一种重要病害
[5],该病在我国吉林、辽宁、黑龙江等人参主产区常年普遍发生,严重时发病率高达70%
[6]。该病不仅为害植株茎叶使其提前枯萎,而且还能引起人参根腐烂,造成严重的经济损失,且田间具有极强的流行性,防治起来极为困难
[7-9]。目前对于人参疫病的防治仍以化学防治为主,已正式登记用于人参疫病防治的药剂主要有烯酰吗啉、双炔酰菌胺、甲霜·霜霉威、霜脲·锰锌等化学药剂,截至目前尚无微生物菌剂正式登记用于人参疫病的防治。但化学药剂的长期大量使用极易造成人参农药残留超标,病原菌产生抗药性,环境污染等问题,基于环境保护和绿色人参产业发展的需要,利用拮抗微生物创制新型高效生物农药防治人参疫病是有效手段和产业发展方向
[10-11]。目前关于人参疫病生物防治的研究报道相对较少,尤其是能应用于田间防治的生防菌剂更是鲜有报道,生防资源极为匮乏,因此筛选高效的生防菌株,创制微生物制剂产品,明确其应用技术,对人参疫病的生物防治具有重要意义。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Y426-7为吉林农业大学药用植物有害生物绿色防控实验室分离自人参根际土壤的一株生防细菌,课题组前期研究发现,该菌株对人参疫病菌及多种作物疫病菌拮抗效果显著,具有一定的生防潜力。为加速其产业化进程,使其更加高效地应用于人参疫病的生物防治,本研究将以该菌株为对象,通过对载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂及其复配比例的筛选优化,创制贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂,并明确其对人参疫病的预防效果和治疗效果,以期为贝莱斯芽孢杆菌Y426-7的开发利用及人参疫病的生物防治提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Y426-7、人参恶疫霉(Phytophthora cactorum),均由吉林农业大学药用植物有害生物绿色防控实验室保存并提供。
1.1.2 供试药剂
载体:高岭土(kaolinite)、硅藻土(diatomite)、白炭黑(white carbon black)、滑石粉(talc)、膨润土(bentonite)、轻质碳酸钙(light calcium carbonate)和凹凸棒土(concave convex rod soil);润湿剂:木质素磺酸钠(sodium lignosulfonate)、可溶性淀粉(soluble starch)、十二磺基苯磺酸钠(sodium dodecyl benzenesulfonate)和拉开粉(nekal BX);分散剂:羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose)、木质素磺酸钙(calcium lignosulfonate)、NNO(dispersant NNO)和聚乙二醇PEG8000(polyethylene glycol);紫外保护剂:抗坏血酸(ascorbic acid)、羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose)、糊精(dextrin)、海藻酸钠(sodium alginate)和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)。上述所有试剂均为工业级,购自石家庄市灵寿县佰顺矿产品有限公司。
对照药剂:23.4%双炔酰菌胺悬浮剂,购自先正达南通作物保护有限公司;1×1010 CFU/mL枯草芽孢杆菌悬浮剂,购自江苏省扬州绿源生物化工有限公司。
1.1.3 供试培养基
PDA培养基、LB培养基、NA培养基、LA培养基和V8培养基,其具体配方参考文献[
12];Y426-7菌株发酵液体培养基:可溶性淀粉25 g、胰蛋白胨15 g、NaCl 10 g,蒸馏水定容至1 000 mL,调整pH 6.5。
1.2 贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂研制
1.2.1 种子液和发酵液制备
种子液制备。将培养好的贝莱斯芽孢杆菌Y426-7菌株用接种针划线接种于NA固体培养基上,28 ℃倒置培养24 h,获得单菌落,接种于LB液体培养基,28 ℃、180 r/min振荡培养24 h,得到种子液。
发酵液制备。将贝莱斯芽孢杆菌Y426-7种子液,以5%接种量接入Y426-7菌株发酵液体培养基,装瓶量为125 mL,30 ℃、180 r/min振荡培养72 h,制得1×1010 CFU/mL菌株发酵液。
1.2.2 载体、助剂与菌株生物相容性测定
将Y426-7菌株发酵液用无菌蒸馏水稀释107倍后,取0.1 mL分别涂布在含不同添加剂的平板上。将载体按50 g/L、润湿剂0.25 g/L、分散剂1.5 g/L、保护剂0.05 g/L的比例与LA培养基混合,灭菌后制成平板,以不含添加剂的LA平板为对照,每个处理设3次重复。置于28 ℃培养3 d。记录活菌数,筛选对Y426-7生长无影响的载体及各种助剂。
1.2.3 可湿性粉剂载体筛选及母粉制备
分别准确称取5.0 g 7种载体于烧杯中,逐渐加入Y426-7发酵液,不断搅拌使载体充分吸附,当载体不结块且烧杯中无流水时停止加入滤液,记录添加发酵液用量,并计算最大吸附量。将发酵液分别与7种供试载体混合均匀后放入鼓风干燥箱50 ℃烘至质量恒定后研磨成粉末,完成母粉制备。综合考虑芽孢含量、悬浮率、润湿时间、吸附容量4个因素,选择最优载体
[13]。
1.2.4 助剂种类、配比及用量的筛选
分别将具有相容性的2种润湿剂和4种分散剂按10%添加量加入到等量母粉中,混合均匀,经气流粉碎机粉碎后测定制剂的悬浮率、润湿时间以及芽孢含量,确定润湿剂和分散剂的种类。将上述筛选出的最适润湿剂和分散剂分别按照1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,5∶5,6∶4,7∶3,8∶2和9∶1的质量比与等量母粉混合均匀,其添加量均为10%,通过测定不同配比条件下制剂的悬浮率和润湿时间,确定润湿剂和分散剂的最佳配比。在此基础上,将上述所筛选出的润湿剂和分散剂按最优配比混合后,使二者的总含量分别为2%,4%,6%,8%,10%,12%,14%和16%,之后与等量母粉混匀,测定不同含量制剂的悬浮率和润湿时间及芽孢含量,确定助剂的用量。
1.2.5 紫外保护剂的筛选
将1%紫外保护剂分别添加到初加工的母粉中,设未添加紫外保护剂为对照组(紫外灯不照射为CK1,紫外灯照射为CK2),稀释后,涂布在平板上,在距离40 cm处用254 nm紫外灯(20 W)分别照射12和24 h后,统计活菌落数,计算存活率,筛选最适紫外保护剂。试验设置3个重复。测定各处理的芽孢含量和存活率。
存活率=紫外处理后总活菌数/紫外处理前总活菌数×100%。
1.3 贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂质量检测
参照《中华人民共和国国家标准》测定制备的可湿性粉剂各项指标。润湿时间测定参照GB 5451-2001
[14],悬浮率测定参照GB/T 14825-2023
[15],细度测定参照GB/T 16150-1995
[16],pH测定参照GB/T 1601-1993,干燥减量测定参照NY/T 2293.1-2012,活菌数和杂菌率根据文献[
17-
18]进行测定。
1.4 贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂贮存稳定性检测
将贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂分别在低温(4 ℃)和室温(25 ℃)条件下连续贮存180 d,期间每隔10 d采用平板计数法检测1次活菌数,并计算存活率。
1.5 贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂对人参疫病的生防效果
1.5.1 药剂及处理剂量
将贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂分别配制成2.0×107,1.0×107和5.0×106 CFU/mL 3个浓度,对照药剂23.4%双炔酰菌胺悬浮剂和枯草芽孢杆菌悬浮剂含量分别配制成0.4 μL/mL和5.0×107 CFU/mL。
1.5.2 预防效果
将3年生健康人参用质量分数1% NaClO表面消毒3 min,用无菌水冲洗3次后无菌条件下风干,将参根置于不同浓度药液中浸泡20 min后在超净工作台中风干。待参根干燥后将配置好的人参疫病菌孢子悬浮液(10
6 个/mL)均匀喷雾接种于参根表面,每株人参均匀喷雾接种2 mL,以清水喷雾处理作为空白对照,每处理3次重复,每个重复6根人参。所用接种处理的人参均放于垫有保湿无菌滤纸的无菌盘中,用塑料膜封闭保湿培养。接种后第7天和第10天分别调查发病情况,计算病情指数和预防效果。参根疫病分级标准参考赵曰丰等
[19]的分级标准。0级,无可见病斑;1级,发病面积占参根的1%~5%;2级,发病面积占参根的6%~25%;3级,发病面积占参根的26%~50%;4级,发病面积占参根的51%~75%;5级,发病面积占参根的76%~95%;6级,发病面积占参根的96%~100%。
病情指数=∑(各级数×各级代表值)/(调查总数×最高级代表值)×100;
防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%。
1.5.3 治疗效果
首先将人参根喷雾接种人参疫病菌孢子悬浮液(106 个/mL),每株人参均匀喷雾接种2 mL孢子悬浮液,风干备用。24 h后用不同浓度药液喷雾处理,每株人参均匀喷雾2 mL,每处理3次重复,每个重复6根人参,以喷雾清水处理作为空白对照。喷药处理后第7天和第10天调查发病情况,计算病情指数及防治效果,计算方法同1.5.2节。
1.6 数据处理与分析
试验数据采用SPSS 27.0进行统计分析,采用单因素方差分析法分析组间差异显著性(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 载体和助剂与贝莱斯芽孢杆菌Y426-7菌株的生物相容性
由
图1可知,除拉开粉、十二烷基苯磺酸钠和十二烷基硫酸钠3种添加剂添加后导致菌株Y426-7不能正常生长外,其他供试载体和助剂添加后菌株均可正常生长。与对照相比,部分载体和助剂对Y426-7菌体生长还表现出一定的促进作用,可作为备选材料。
2.2 贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂的研制
2.2.1 载体的筛选
以吸附容量、悬浮率、湿润时间和芽孢含量为评价指标筛选最适载体。结果(
表1)表明,供试7种载体各方面性能存在显著差异。其中白炭黑、凹凸棒土和硅藻土的吸附性表现良好,吸附容量分别达到4.73,2.79和2.04 mL/g;硅藻土的润湿时间最短,仅为11.25 s;以硅藻土和凹凸棒土为载体时悬浮率相对较高,分别为48.47%和54.04%;且以硅藻土作为载体时芽孢含量最高,达到4.08×10
9 CFU/g。综合各项评价指标,最终选择硅藻土作为创制贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂的载体。
2.2.2 润湿剂和分散剂的筛选
以悬浮率、湿润时间以及芽孢含量为评价标准,筛选最适润湿剂和分散剂种类。由
表2可知,以木质素磺酸钠作为润湿剂时湿润时间最短,为26.17 s,以NNO和羟丙基纤维素作为分散剂时,其湿润时间分别为40.86和36.22 s;以NNO为分散剂时的悬浮率最高,达到77.93%;木质素磺酸钙和木质素磺酸钠的悬浮率分别为71.83%和70.01%;可溶性淀粉的悬浮率最低,为20.72%。以木质素磺酸钠作为润湿剂时,芽孢含量达到4.59×10
9 CFU/g;以NNO作为分散剂时,芽孢含量为5.57×10
9 CFU/g。综合上述结果,选择NNO作为分散剂,木质素磺酸钠作为润湿剂。
2.2.3 润湿剂和分散剂最佳配比的筛选
由
表3可知,随着润湿剂木质素磺酸钠含量的增多,制剂的湿润时间显著延长,芽孢含量缓慢下降,但差异不显著。当木质素纤维素钠与NNO质量比为7∶3,4∶6,6∶4时,悬浮率相对较高;当木质素磺酸钠与NNO 质量比为1∶9,2∶8,3∶7和4∶6时,湿润时间均小于25 s;当木质素磺酸钠与NNO质量比为1∶9,2∶8和4∶6时,其芽孢含量相对较高,分别为3.06×10
9,3.11×10
9和2.89×10
9 CFU/g。综合湿润时间、悬浮率及芽孢含量结果,确定木质素磺酸钠与NNO的最佳配比为4∶6。
2.2.4 润湿剂和分散剂含量的筛选
由
表4可知,随着润湿剂和分散剂含量的增加,贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂的湿润时间逐渐缩短,悬浮率逐渐提高,表明增加润湿剂和分散剂含量对制剂的湿润性能和悬浮率均有促进作用;但制剂中的芽孢含量有下降趋势。结合湿润时间、悬浮率以及芽孢含量,选择润湿剂和分散剂含量为12%,该处理贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂的湿润时间为13.27 s,悬浮率为85.24%,芽孢含量为2.80×10
9 CFU/g。
2.2.5 紫外保护剂的筛选
由
表5和
图2可知,与CK1(未添加保护剂,紫外灯不照射)和CK2(未添加保护剂,紫外灯照射)相比,紫外保护剂的添加可降低紫外胁迫对芽孢存活率的影响,其中以1%抗坏血酸作为紫外保护剂时芽孢存活率最高,照射12和24 h后芽孢存活率分别为93.44%和45.58%,明显高于其他紫外保护剂效果。因此选择1%抗坏血酸作为创制贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂的紫外保护剂。
2.2.6 贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂制备及质量检测
按上述试验筛选结果,将贝莱斯芽孢杆菌Y426-7发酵液与粉碎后的载体(硅藻土)、润湿剂(木质素磺酸钠)、分散剂(NNO)和紫外保护剂(抗坏血酸)混合,边搅拌边进行喷雾干燥,制得贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂,对其各项性能指标进行质量检测,结果(
表6)表明,贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂的细度为92%,润湿时间为14.7 s,悬浮率为85%,干燥减量为2%,pH 7.4,活菌数为2.5×10
9 CFU/g,杂菌率为0。表明研制的贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂各项指标均符合国家质量检测标准。
2.3 贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂的贮存稳定性
将制备的贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂分别置于室温(25 ℃)和低温(4 ℃)条件下,连续贮存180 d,期间每隔10 d测定1次该菌剂中的芽孢含量,计算芽孢存活率。结果(
图3)表明,贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂在低温(4 ℃)条件下贮存180 d后,其芽孢存活率仍可达到88.45%;在室温(25 ℃)条件下贮存180 d,其芽孢存活率也可达到80.37%,说明研制的贝莱斯芽孢杆菌Y426-7 可湿性粉剂具有一定的贮存稳定性。
2.4 贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂对人参疫病的防效
2.4.1 预防效果
由
表7可知,喷药后第7天调查时发现,各处理对人参根疫病的预防效果并不明显,防治效果仅为15.78%~50.87%;但随着病情的扩展,该菌剂的预防效果逐渐增强,第10 天调查时5.0×10
6 CFU/mL Y426-7可湿性粉剂对人参疫病的防治效果高达81.01%,显著高于对照的化学药剂和生物菌剂,表明该菌剂对人参疫病具有较好的预防作用。
2.4.2 治疗效果
由
表8可知,从整体来看,Y426-7可湿性粉剂对人参疫病的治疗作用低于预防作用,且与预防作用相比,其对人参疫病的治疗作用主要表现在发病前期,在第7天调查时,5.0×10
6 CFU/mL Y426-7可湿性粉剂在离体条件下对人参根疫病的防治效果高达66.36%,但与对照的化学药剂防治效果差异不显著;随着病情扩展,Y426-7可湿性粉剂对人参疫病的防效逐渐下降,第10天调查时发现其对人参疫病的防效低于50%,表明该菌剂对人参疫病的治疗作用持效期低于其预防作用的持效期。
3 讨 论
近年来,随着人参种植面积逐年增多,病害问题日趋严重
[20],其中人参疫病具有极强的流行性,田间一旦发生很难控制,会对人参产量和品质造成严重影响
[21]。生物防治因其安全无残留等特点,在药用植物病害防治上具有明显优势
[22-24]。国内外关于辣椒疫病、马铃薯晚疫病、大豆疫霉病等作物疫病生防细菌筛选的报道较多
[25-28],但目前对于人参疫病生物防治的研究报道相对较少,且仅是在生防菌株筛选过程中以人参疫病菌为靶标进行了室内抑菌活性测定
[29-30],但对于其生防产品的开发利用及其对人参疫病的生防效果评价及抑菌机制尚无深入研究。本研究在获得高效生防菌株的基础上创制其可湿性粉剂产品,并评价其对人参根疫病的离体生防效果,初步明确其生防潜力,但对于该制剂田间的应用效果及其抑菌机制有待进一步深入研究。
与液体制剂和其他固体制剂相比,可湿性粉剂剂型具有生产成本低、有效成分含量高、湿润性好、便于运输与贮存等诸多优点,在生产中得到广泛应用
[31]。本研究创制的贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂对人参疫病具有明显的离体生防效果,在人参疫病的科学防控中具有一定的应用潜力。作为可湿性粉剂配方中的主要组成部分,载体具有重要作用。本研究发现,载体在可湿性粉剂中的占比较高,且不同载体对可湿性粉剂的性能有显著影响。综合相容性、吸附容量、悬浮率和润湿时间等多项指标,确定贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂的最适载体为硅藻土,这与已有研究
[32-33]略有不同,可能是不同菌株对不同载体的适应能力不同,且同种载体对不同菌株的生物相容性亦存在差异。与其他载体相比,硅藻土具有高吸附性,良好悬浮性、分散性和流动性,且成本低等优点,是生物农药可湿性粉剂制备的重要填料。
本研究还发现,Y426-7可湿性粉剂在试验剂量下对人参根疫病的预防作用明显高于治疗作用,且随着病情的扩展,该菌剂的预防效果表现愈加明显,且具有一定的持效期。已有研究表明,微生物菌剂的作用机制一方面是在病原菌入侵前即可通过快速繁殖占据植物根际或叶面生态位,形成物理屏障,进而抑制病原菌的定殖和侵染,如哈茨木霉菌通过分泌几丁质酶降解病原菌细胞壁
[34],同时竞争营养和空间资源;另一方面可通过激发植物的系统抗性(SAR),提升防御相关酶的活性水平,从而达到增强植物的抗病能力,如淡紫拟青霉可激活植物茉莉酸信号通路
[35]。关于贝莱斯芽孢杆菌Y426-7对人参疫病的作用机制还有待后续研究。
4 结 论
本研究以悬浮率、芽孢含量、湿润时间等为评价指标,对可湿性粉剂的载体、润湿剂、分散剂和紫外保护剂的类型及用量进行筛选,确定贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂的最佳配方为:母粉(87%,硅藻土与贝莱斯芽孢杆菌发酵液质量比1∶2),润湿剂木质素磺酸钠(4.8%),分散剂NNO(7.2%),紫外保护剂抗坏血酸(1%)。检测发现该制剂的细度为92%,润湿时间为14.7 s,悬浮率为85%,干燥减量为2%,pH 7.4,活菌数为2.5×109 CFU/g,杂菌率为0,符合国家质量控制标准。室内活体组织试验结果表明,在使用剂量为(5.0×106 ~2.0×107) CFU/mL时,贝莱斯芽孢杆菌Y426-7可湿性粉剂对人参根疫病具有良好的预防作用和治疗作用,且预防作用明显高于治疗作用。
吉林省科技发展计划项目(20220101308JC)