TRIM21调控Ⅱ型干扰素信号通路抑制脑心肌炎病毒在RAW264.7巨噬细胞中的增殖

Regulatory effect of TRIM21 on the type Ⅱ interferon signaling pathway to inhibit the proliferation of encephalomyocarditis virus in RAW264.7 cells

摘要

目的 探究TRIM21调控脑心肌炎病毒（EMCV）复制增殖机制与JAK1-STAT1信号通路的关系。 方法 用Western Blot和RT-qPCR，检测EMCV感染小鼠RAW264.7巨噬细胞后内源性TRIM21的变化；Western Blot、RT-qPCR和TCID₅₀法检测RAW264.7巨噬细胞过表达或敲低表达TRIM21的效果，以及对EMCV复制增殖的影响；半定量PCR和ELISA法检测固有免疫应答中细胞因子的变化；采用半定量PCR和Western Blot法，检测RAW264.7巨噬细胞过表达或敲低表达TRIM21并感染EMCV后对JAK-STAT信号通路的影响。 结果 EMCV感染RAW264.7巨噬细胞后，内源性TRIM21表达增加，说明TRIM21参与EMCV的复制增殖过程；Western Blot、RT-qPCR和病毒滴度检测结果表明，TRIM21过表达抑制EMCV复制增殖；TRIM21未参与病毒的吸附和侵入过程，但可抑制病毒释放；EMCV感染RAW264.7巨噬细胞后可诱导产生IFN-γ，并促进JAK1、STAT1和IRF9表达。 结论 TRIM21通过抑制子代病毒释放并诱导RAW264.7巨噬细胞分泌IFN-γ，激活JAK1-STAT1信号通路，以抑制EMCV病毒蛋白的复制增殖。

Abstract

Objective This research aims to investigate the relationship between the mechanism by which TRIM21 regulates the replication and proliferation of encephalomyocarditis virus （EMCV） and JAK1-STAT1 signalling pathway. Method Western Blot and RT-qPCR were used to detect the changes of endogenous TRIM21 after the mouse RAW264.7 macrophages were infected by EMCV.Western Blot，RT-qPCR，and TCID₅₀ were used to detect the effects of overexpression or knockdown of TRIM21 and their impact on EMCV replication and proliferation.Semi-quantitative PCR and ELISA were used to detect the changes of cytokines in the intrinsic immune response；semi-quantitative PCR and Western Blot were used to detect the effect of overexpression or knockdown of TRIM21 in RAW264.7 macrophages infected with EMCV on the JAK-STAT signalling pathway. Result Endogenous TRIM21 expression was upregulated after EMCV infection of RAW264.7 macrophages，suggesting that TRIM21 was involved in the replication and proliferation process of EMCV.Western Blot，RT-qPCR and viral titre assay showed that TRIM21 overexpression inhibited the replication and proliferation of EMCV.TRIM21 was not involved in the adsorption and invasion process of virus， but it inhibited virus release.EMCV infection of RAW264.7 macrophages induced the production of IFN-γ and promoted the expression of JAK1，STAT1 and IRF9. Conclusion TRIM21 inhibited the replication and proliferation of EMCV viral proteins by inhibiting the release of progeny virus and inducing RAW264.7 macrophages to secrete IFN-γ，thereby activating the JAK1-STAT1 signalling pathway.

Graphical abstract

关键词

脑心肌炎病毒 / 固有免疫应答 / TRIM21 / IFN-γ

Key words

Encephalomyocarditis virus / intrinsic immune response / TRIM21 / IFN-γ

脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）是无囊膜的单股正链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科，心病毒属^［1］。EMCV是一种人畜共患病原体，感染后可引起心肌炎、脑炎、生殖障碍和糖尿病等疾病。EMCV基因组长度约为7.8 kb，编码4种结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）和8种非结构蛋白（2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D），其中衣壳蛋白VP1抗原性最强，与病毒粒子表面的拓扑结构、抗原性、受体吸附及脱壳有关，且与病毒基因组的复制有密切关系^［2］。

三基序蛋白家族（tripartite motif，TRIM）属于E3泛素连接酶家族成员之一，在多细胞真核生物中均有表达，TRIM基因总数与生物进化程度相关，生物进化程度越高，TRIM家族蛋白成员越多。目前，人类表达近80个TRIM家族蛋白成员，小鼠表达64种TRIM家族蛋白^［3］。TRIM家族蛋白N端包括3个保守结构域（RING结构域、1~2个B-box结构域和Coiled-coil（CC）结构域），以及从N端到C端的高度可变的羧基末端结构域，因此TRIM家族蛋白又被称为RBCC蛋白。TRIM21参与信号转导及细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，同时还参与蛋白的翻译后修饰和自噬过程，调控宿主的免疫信号通路以及抗病毒免疫应答^［4］。有研究发现，TRIM-21通过多种机制抑制甲型流感病毒^［5］、猪流行性腹泻病毒^［6］、乙型肝炎病毒^［7］和猪繁殖与呼吸综合征病毒^［8］复制。WANG等^［9］研究表明，TRIM家族蛋白在传染性法氏囊病毒吸附、侵入、基因组复制以及病毒释放等阶段发挥作用。目前，TRIM21在EMCV感染免疫细胞过程中的潜在影响尚不明确。本试验探究了TRIM21在EMCV感染小鼠RAW264.7巨噬细胞中的作用和机制，以期为抗EMCV药物靶点的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材　料

1.1.1 细胞、毒株和质粒

EMCV（GenBank登录号：X74312），由西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室提供。小鼠RAW264.7巨噬细胞、BHK-21细胞、空载体质粒pcDNA3.1、pcDNA3.1-TRIM21等，均由西北民族大学甘肃省动物细胞技术创新中心提供。大肠杆菌感受态细胞Trans 5α，购于北京全式金生物技术股份有限公司。

1.1.2 主要试剂

DMEM高糖培养基、胰蛋白酶，购自兰州百灵生物技术有限公司；胎牛血清、新生牛血清，均购自兰州民海生物工程有限公司；Opti-MEM、Lipofectamine^TM 2000、BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自赛默飞世尔科技公司；无酶无菌水，购自北京索莱宝科技有限公司；Evo M-MLV反转录预混型试剂盒、Evo M-MLV RT-PCR试剂盒，购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；TransStart^® Top Green qPCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司；CCK-8试剂盒，购自上海碧云天生物技术股份有限公司；ECL特超敏发光检测试剂盒，购自深圳市尚唯生物科技有限公司；TRIM21兔单克隆抗体、GAPDH小鼠抗单克隆抗体，购自Abcam公司；JAK1兔抗单克隆抗体、STAT1兔抗单克隆抗体、IRF9兔抗单克隆抗体，购自CST公司；辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG（H+L）、HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L），购自Jackson Immunoresearch公司；RNAiso plus Total RNA提取试剂、TaKaRa Ex Taq^® PCR酶，购自宝日医生物技术（北京）有限公司；Endo-free小提质粒提取试剂盒，购自Omega公司；Mouse IFN-γ ELISA试剂盒，购自酶联生物科技有限公司。

1.2 方　法

1.2.1 小鼠RAW264.7巨噬细胞对EMCV的易感性

用感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.1的EMCV感染RAW264.7巨噬细胞，以未感染细胞为对照组（0 h），分别在病毒感染后3，6，9和12 h收集细胞上清液样本，设置3组重复。采用TCID₅₀法测定细胞上清液的病毒滴度，以BHK-21细胞为阳性对照，绘制RAW264.7巨噬细胞的生长动力学曲线。用MOI为0.1的EMCV感染RAW264.7巨噬细胞，以未感染细胞为对照组（0 h），分别在病毒感染后1，3，6和9 h收集细胞样本，设置3组重复。利用RNAiso plus Total RNA提取试剂提取细胞总RNA，使用Evo M-MLV反转录预混型试剂盒进行反转录。以β-actin为内参基因，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测EMCV VP1基因mRNA表达水平；利用NP40细胞裂解液提取细胞总蛋白，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）为内参蛋白，采用Western Blot法检测EMCV VP1蛋白表达水平。RT-qPCR试验所用引物如下，VP1 Forward序列：5′-TCGGCACCGGGTTCTTTG-CT-3′，VP1 Reverse序列：5′-AATCTTGTCAA-CGGAAGT-GG-3′；β-actin Forward序列：5′-TGGCACCCAG-CACAATGAA-3′，β-actin Reverse序列：5′-CT-AAGTCATAGTCCGCCTAGAAG-CA-3′。

1.2.2 EMCV感染对TRIM21表达的影响

用0.1 MOI EMCV感染RAW264.7巨噬细胞，以未感染细胞为对照组，分别在病毒感染后3，6和9 h收集细胞样本，设置3组重复。以β-actin为内参基因，采用RT-qPCR法检测TRIM21和EMCV VP1基因mRNA表达水平；以GAPDH为内参蛋白，采用Western Blot法检测TRIM21和EMCV VP1蛋白表达水平。RT-qPCR试验所用引物及其序列为：TRIM21 Forward序列：5′-CCTCAGACCACCC-TCCACA-3′；TRIM21 Reverse序列：5′-CAGCCTCATAGTCCACAAAGAT-3′。

1.2.3 TRIM21过表达对EMCV复制增殖的影响

采用脂质体介导法将pcDNA3.1空载体质粒（对照）和TRIM21过表达质粒pcDNA3.1-TRIM21瞬时转染至RAW264.7巨噬细胞，设置3组重复。以β-actin为内参基因，采用RT-qPCR检测TRIM21基因mRNA表达水平；以GAPDH为内参蛋白，采用Western Blot法检测TRIM21蛋白表达水平。以未转染细胞为对照组（CK），采用CCK-8试剂盒检测外源质粒对细胞活力（OD₄₉₀）的影响。

设置RAW264.7巨噬细胞未接毒对照组（CK）和EMCV接毒组，EMCV接毒组细胞先转染1.0 μg的pcDNA3.1空载体质粒（EV）和不同剂量（0.5和1.0 μg）的pcDNA3.1-TRIM21重组质粒，分别记为pcDNA3.1-TRIM21（0.5 μg）和pcDNA3.1-TRIM21（1.0 μg），然后感染0.1 MOI EMCV。在病毒感染后9 h收集细胞和细胞上清液样本，设置3组重复。以β-actin为内参基因，采用RT-qPCR法检测EMCV VP1和TRIM21基因mRNA表达水平；以GAPDH为内参蛋白，采用Western Blot法检测EMCV VP1和TRIM21蛋白表达水平；采用TCID₅₀法测定各组细胞上清液的病毒滴度。

1.2.4 TRIM21敲低对EMCV增殖的影响

采用脂质体介导法将阴性对照siRNA-NC以及3对siRNA-TRIM21（siRNA1-TRIM21、siRNA2-TRIM21和siRNA3-TRIM21）瞬时转染至RAW264.7巨噬细胞，设置3组重复。以β-actin为内参基因，采用RT-qPCR法检测TRIM21基因mRNA表达水平；以GAPDH为内参蛋白，采用Western Blot法检测TRIM21蛋白表达水平；以未转染细胞为对照组（CK），采用CCK-8试剂盒检测外源质粒对细胞活力（OD₄₉₀）的影响。

设置未接毒对照组（CK）和EMCV接毒组，接毒组转染siRNA-NC和siRNA3-TRIM21，设置3组重复。在病毒感染后9 h收集细胞和细胞上清液样本，设置3组重复。以β-actin为内参基因，采用RT-qPCR法检测EMCV VP1和TRIM21基因mRNA表达水平；以GAPDH为内参蛋白，采用Western Blot法检测EMCV VP1和TRIM21蛋白表达水平；采用TCID₅₀法测定各组细胞上清液的病毒滴度。siRNA-TRIM21由广州锐博生物科技有限公司设计并合成，siRNA1-TRIM21序列：5′-GGAGCCT-ATGAGTATCGAA-3′；siRNA2-TRIM21序列：5′-CCTGGACACGTTAGATATT-3′；siRNA3-TRIM21序列：5′-GCTCCCTCATTTACACCT-T-3′。

1.2.5 TRIM21对EMCV吸附、侵入和释放的影响

在RAW264.7巨噬细胞中瞬时过表达和敲低表达TRIM21，在病毒吸附试验中，接种3 MOI EMCV并在4 ℃条件下孵育1 h；在病毒侵入试验中，接种2 MOI EMCV并在37 ℃条件下孵育1 h；在病毒释放试验中，接种0.1 MOI EMCV并在37 °C条件下孵育9 h，分别收集细胞和细胞上清液样本。以β-actin为内参基因，采用RT-qPCR法检测EMCV VP1基因mRNA表达水平；采用TCID₅₀法测定细胞内和细胞上清液的病毒滴度。

1.2.6 TRIM21过表达对IFN-γ的影响

在RAW264.7巨噬细胞中瞬时过表达TRIM21并感染0.1 MOI EMCV，在病毒感染后9 h收集细胞和细胞上清液样本，设置3组重复。使用ELISA试剂盒检测IFN-γ蛋白表达水平；以GAPDH为内参基因，采用半定量PCR法检测TRIM21、EMCV VP1和IFN-γ基因mRNA表达水平。半定量PCR所用引物及其序列为：IFN-γ Forward序列：5′-TGGCTGT-TTCTGGCTGTTACTGC-3′，IFN-γ Reverse序列：5′-AATGACGCTTATGTTGTTGCTGATGG-3′；GAPDH Forward序列：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，GAPDH Reverse序列：5′-CT-CGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。

1.2.7 TRIM21对IFN-γ介导的JAK1-STAT1信号通路的影响

在RAW264.7巨噬细胞中瞬时过表达和敲低表达TRIM21并感染0.1 MOI EMCV，设置未接毒对照组（CK），分别在病毒感染0，6和9 h收集细胞样本，设置3组重复。以GAPDH为内参基因，采用半定量PCR法检测TRIM21、EMCV VP1、IFN-γ、STAT1和IRF9基因mRNA表达水平；以GAPDH为内参蛋白，采用Western Blot法检测TRIM21、EMCV VP1、JAK1、STAT1和IRF9蛋白表达水平。半定量PCR所用引物及其序列为：STAT1 Forward序列：5′-ATCCGCTTCCATG-ACCTCC-TCTC-3′，STAT1 Reverse序列：5′-A-CCATTGGCTTCACCTTCTCTGTTC-3′；IRF9 Forward序列：5′-ATCGTGGAGCAGGTGGAG-AGTG-3′，IRF9 Reverse序列：5′-GCACAGCGT-AGGCGAGTCTTC-3′。

1.3 数据统计分析

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析并绘图，具体包括学生t检验（Student’s t-test）、单因素方差分析（One-Way ANOVA）和双因素方差分析（Two-Way ANOVA）。数据采用“平均值±标准差”表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 小鼠RAW264.7巨噬细胞对EMCV的易感性

图1显示，小鼠RAW264.7巨噬细胞的生长趋势与BHK-21细胞相似，在感染早期（0~3 h），两种细胞的病毒滴度均较低；随着感染时间的延长（3~9 h），病毒滴度迅速上升；到了感染后期（9~12 h），病毒滴度趋于稳定（图1-A）。

基因表达水平检测结果显示，VP1基因mRNA表达水平极显著高于对照组，病毒感染9 h时的VP1基因mRNA表达水平显著低于6 h试验组（图1-B）。Western Blot结果进一步验证了这一现象，病毒感染9 h时的VP1蛋白表达水平极显著低于6 h试验组（图1-C，D）。上述结果表明，EMCV可感染RAW264.7巨噬细胞，且可在其中有效复制并释放子代病毒。

2.2 EMCV感染对TRIM21表达的影响

图2表明，EMCV感染RAW264.7巨噬细胞3 h时，TRIM21蛋白表达水平极显著低于对照组，未检测到VP1蛋白；在感染6 h时，TRIM21和VP1蛋白表达水平均极显著高于对照组，并达到峰值；而在感染9 h时，TRIM21和VP1蛋白表达水平仍极显著高于对照组（图2-A，B，C）。基因表达水平检测结果显示，EMCV感染后6和9 h，TRIM21和VP1基因mRNA表达水平较对照组均显著或极显著提高（图2-D，E）。上述结果表明，EMCV感染RAW264.7巨噬细胞后，促进了内源性TRIM21的表达。

2.3 TRIM21过表达对EMCV复制增殖的影响

由图3可知，转染pcDNA3.1-TRIM21重组质粒的RAW264.7巨噬细胞中，TRIM21蛋白及其基因mRNA表达水平均极显著高于pcDNA3.1空载体质粒对照组（图3-A，B，C）；转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-TRIM21质粒的细胞活力与CK组相比无统计学差异（图3-D）。试验结果表明，TRIM21在小鼠RAW264.7巨噬细胞中成功过表达，且转染的外源质粒对细胞活力无显著影响。

图4显示，转染0.5和1.0 μg的pcDNA3.1-TRIM21重组质粒后，TRIM21基因mRNA表达水平均显著或极显著提高，VP1基因mRNA表达水平均极显著低于CK组（图4-A，B）；转染1.0 μg的pcDNA3.1-TRIM21重组质粒能够更有效地抑制细胞上清液的病毒滴度（图4-C）；Western Blot结果显示，转染0.5和1.0 μg的pcDNA3.1-TRIM21重组质粒后，TRIM21和VP1蛋白表达水平与CK组相比均极显著升高（P<0.01）；转染1.0 μg的pcDNA3.1-TRIM21重组质粒后，TRIM21蛋白表达水平与CK组相比极显著升高，VP1蛋白表达水平极显著降低（图4-D，E，F）。综合RT-qPCR和Western Blot结果，高剂量的pcDNA3.1-TRIM21重组质粒对EMCV增殖的抑制作用更为明显。

2.4 TRIM21敲低对EMCV复制增殖的影响

由图5可知，转染siRNA1-TRIM21、siRNA2-TRIM21和siRNA3-TRIM21的RAW264.7巨噬细胞中，TRIM21基因mRNA表达水平均显著低于阴性对照siRNA-NC（图5-A）；Western Blot结果显示，TRIM21蛋白表达水平均极显著低于阴性对照siRNA-NC组，其中siRNA3-TRIM21的敲低效果最为明显（图5-B，C）。转染siRNA3-TRIM21的细胞活力与对照组相比无统计学差异（图5-D）。试验结果表明，TRIM21敲低成功，且转染的外源质粒对细胞活力无显著影响。

图6结果显示，转染siRNA3-TRIM21的RAW264.7巨噬细胞中，TRIM21蛋白与VP1蛋白的表达水平均极显著高于CK组（图6-A，B，C）；TRIM21基因mRNA表达水平极显著低于CK组，VP1基因mRNA表达水平极显著高于CK组（图6-D，E）；细胞上清液的病毒滴度极显著高于CK组（图6-F）。该结果表明，TRIM21敲低显著上调了EMCV VP1的表达水平，促进了EMCV的复制增殖。

2.5 TRIM21对EMCV吸附、侵入和释放的影响

图7显示，TRIM21过表达EMCV吸附阶段VP1基因mRNA表达水平有所升高，但无统计学差异（图7-A）；细胞表面吸附的病毒滴度与对照组相比无统计学差异（图7-B）。TRIM21敲低表达EMCV吸附阶段VP1基因mRNA的表达水平与对照组相比有所升高，但无统计学差异（图7-C）；细胞表面吸附的病毒滴度与对照组相比有所降低，但无统计学差异（图7-D）。TRIM21过表达EMCV侵入阶段VP1基因mRNA表达水平与对照组相比有所升高，但无统计学差异（图7-E）；侵入细胞内的病毒滴度与对照组相比有所下降，但无统计学差异（图7-F）。TRIM21敲低表达EMCV侵入阶段VP1基因mRNA的表达水平与对照组相比无统计学差异（图7-G）；侵入细胞内的病毒滴度与对照组相比有所升高，但无统计学差异（图7-H）。TRIM21过表达EMCV释放阶段RAW264.7巨噬细胞释放到上清液中的病毒滴度极显著低于对照组（图7-I），细胞内的病毒滴度极显著高于对照组（图7-J）。TRIM21敲低表达试验中，细胞释放到上清液中的病毒滴度显著高于对照组（图7-K），细胞内的病毒滴度极显著低于对照组（图7-L）。上述结果表明，TRIM21过表达显著抑制了病毒粒子的释放，TRIM21敲低表达显著促进了EMCV病毒粒子的释放，但无论TRIM21过表达或敲低表达对EMCV的吸附和侵入均未表现出显著的调控作用。

2.6 TRIM21过表达对IFN-γ的影响

TRIM21过表达对IFN-γ的影响结果如图8所示。

图8显示，TRIM21过表达极显著抑制了VP1基因mRNA表达水平，同时极显著上调了IFN-γ基因mRNA表达水平（图8-A，B）；ELISA结果显示，TRIM21过表达极显著提高了IFN-γ蛋白表达水平（图8-C）。上述结果表明，TRIM21过表达显著促进了IFN-γ的表达。

2.7 TRIM21对JAK1-STAT1信号通路的影响

TRIM21表达改变对JAK1-STAT1信号通路分子mRNA水平的影响如图9所示。

图9-A结果表明，在TRIM21过表达试验组，EMCV感染6 h时，EMCV VP1、IFN-γ和转录因子STAT1基因mRNA表达水平均极显著上调（P<0.01），转录因子IRF9基因mRNA表达水平极显著下调（P<0.01）；EMCV感染9 h时，VP1基因mRNA表达水平极显著下调（P<0.01），IFN-γ、STAT1和IRF9基因mRNA表达水平极显著上调（P<0.01）。图9-B结果显示，在TRIM21敲低试验中，EMCV感染6 h时，EMCV VP1、IFN-γ和STAT1基因mRNA表达水平极显著下调（P<0.01），IRF9基因mRNA表达水平极显著上调（P<0.01）；EMCV感染9 h时，EMCV VP1基因mRNA表达水平极显著上调（P<0.01），IFN-γ、STAT1和IRF9基因mRNA表达水平极显著下调（P<0.01）。

TRIM21表达改变对JAK1-STAT1信号通路分子蛋白水平的影响结果见图10。

图10-A显示，在TRIM21过表达试验组，EMCV感染6 h时，EMCV VP1、JAK1和STAT1蛋白表达水平极显著上调（P<0.01），IRF9蛋白表达水平极显著下调（P<0.01）；EMCV感染9 h时，VP1蛋白表达水平极显著下调（P<0.01），JAK1、STAT1和IRF9蛋白表达水平极显著上调（P<0.01）。图10-B结果显示，在TRIM21敲低试验中，EMCV感染6 h时，EMCV VP1、JAK1和STAT1蛋白表达水平极显著下调（P<0.01），IRF9蛋白表达水平极显著上调（P<0.01）；EMCV感染9 h时，VP1蛋白表达水平极显著上调（P<0.01），JAK1、STAT1和IRF9蛋白表达水平极显著下调（P<0.01）。上述结果表明，EMCV感染6 h时，TRIM21过表达对EMCV复制具有促进作用，TRIM21敲低表达对EMCV复制有抑制作用；随感染时间增长至9 h，TRIM21过表达对EMCV复制有抑制作用，TRIM21敲低表达对EMCV复制有促进作用。

3 讨 论

大量研究表明，TRIM蛋白在病毒感染中具有双重作用，如在乙型肝炎病毒感染中，TRIM21可抑制病毒的复制^［10］；而在盖塔病毒感染中，TRIM21可促进病毒复制^［11］。TRIM蛋白通过直接识别病毒组分或调节固有免疫反应，抑制病毒复制并增强宿主防御能力^［12］。然而，某些病毒能够劫持TRIM蛋白，利用其E3泛素连接酶活性修饰病毒蛋白或宿主因子，从而促进病毒复制或逃避免疫监视^［13］。本研究结果发现，TRIM21蛋白可抑制EMCV粒子的释放，并通过IFN-γ介导的JAK1-STAT1信号通路负调控EMCV的感染，这为EMCV防治提供了新的策略和思路。

TRIM家族蛋白在炎症、病毒感染和癌症等不同类型疾病中发挥重要作用^［14-15］。为了探究TRIM21是否影响EMCV的增殖，对EMCV感染的RAW264.7巨噬细胞进行测定，发现EMCV感染后细胞内源性TRIM21显著上调，说明TRIM21参与了EMCV的增殖过程。VP1作为EMCV的主要结构蛋白，TRIM21过表达可下调VP1基因mRNA和蛋白表达水平，VP1表达水平的变化可能与病毒自身的复制调控机制相关。在HBV感染中，TRIM21对DNA聚合酶（DNA Pol）蛋白水平具有剂量依赖性的负向调控作用，TRIM21表达量增加可显著降低DNA Pol蛋白水平，进而抑制HBV复制^［10］。在本研究中，TRIM21过表达程度越大，EMCV增殖受到的抑制作用越强。

有研究表明，TRIM家族蛋白在病毒的生命周期中发挥不同作用^［16］。TRIM11和TRIM31可抑制人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的侵入，TRIM25、TRIM31和TRIM62基因的沉默可抑制HIV的释放^［17］。WEI等^［8］研究证实，TRIM21通过RING结构域的E3泛素连接酶抑制PRRSV的复制，但不影响病毒的吸附和侵入。为进一步探究TRIM21对EMCV复制增殖的影响，分别测定EMCV吸附、侵入以及释放阶段VP1基因mRNA表达水平以及病毒滴度的变化，发现TRIM21过表达显著抑制了EMCV病毒粒子的释放。这一发现提示，TRIM21作为细胞内的一种重要免疫因子，其主要功能可能集中在细胞质和细胞核内，对进入细胞的病毒进行识别和调控，而不是直接参与细胞表面的病毒吸附和侵入。

TRIM家族蛋白因参与细胞固有免疫应答而被广泛研究。TRIM7通过调控IFN-β启动子活性并与MAVS相互作用，激活RIG-I/MDA5/MAVS介导的IFN-β信号通路^［18］。本课题组前期研究发现，TRIM13可抑制由MDA5、MAVS和TBK1介导的IFN-β的表达^［19］，TRIM21过表达能够显著促进HEK293细胞中IFN-β和IL-6的表达，激活IFN-Ⅰ信号通路和炎症信号通路，增强宿主细胞的抗病毒能力^［20］。本研究发现，EMCV感染RAW264.7小鼠巨噬细胞后IFN-γ表达水平上调。病毒感染诱导IFN-γ的产生是机体抗病毒反应激活的标志，IFN-γ通过多种机制参与抗病毒防御，包括直接抑制病毒复制、激活和调节免疫细胞、增强抗原递呈能力等^［21］。IFN-γ与其细胞表面受体结合后，激活JAK1-STAT1信号通路，调控下游抗病毒基因的转录，诱导抗病毒蛋白的表达^［22］。有研究表明，ZIKV的NS4B蛋白通过抑制STAT1磷酸化来逃避宿主免疫^［23］；PEDV感染可显著降低JAK1、STAT1、IRF9和磷酸化STAT1的表达，并抑制了STAT1的核转位，促进病毒复制^［24］。本研究发现，TRIM21过表达显著增强了RAW264.7巨噬细胞中IL-6和IFN-γ的表达水平，在感染6 h，TRIM21过表达通过抑制IRF9的表达动态调控JAK1-STAT1信号通路。但TRIM21与JAK1-STAT1信号通路中具体分子的相互作用还有待进一步研究。未来的研究需要深入探索TRIM21与JAK1、STAT1、IRF9等分子之间的直接或间接作用，以及这些相互作用如何影响宿主细胞的抗病毒免疫应答。

4 结 论

TRIM21过表达能够显著抑制EMCV病毒粒子的释放过程，并促进RAW264.7巨噬细胞分泌IFN-γ，通过调控JAK1-STAT1信号通路，有效抑制EMCV的复制增殖。这一机制的阐明，为深入理解TRIM21在抗病毒免疫中的作用机制奠定了基础，也为后续相关研究提供了重要的参考。

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基金资助

甘肃省自然科学基金项目(23JRRA720)