TaMKK9调控小偃6号高温抗条锈性研究

Study on TaMKK9 in regulating the high-temperature resistance of wheat cultivar Xiaoyan 6 to stripe rust

摘要

目的 探究TaMKK9在小偃6号高温抗条锈病过程中发挥的功能，揭示MAPK级联参与小麦高温抗条锈病的分子机理，完善小麦高温抗病调控网络。 方法 在烟草叶片中进行TaMKK9亚细胞定位；利用病毒诱导的基因沉默和病毒诱导的基因过表达，研究TaMKK9在小麦高温抗条锈病中发挥的作用；采用实时荧光定量PCR，检测TaMKK9及抗病相关基因的表达量；通过酵母双杂交筛选TaMKK9下游互作靶标，并运用双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）及GST Pull-down试验验证TaMKK9与TaMPK3的互作关系。 结果 TaMKK9是定位于细胞膜、细胞质和细胞核的蛋白激酶。实时荧光定量PCR结果表明，受条锈菌和高温双重诱导，小偃6号TaMKK9的表达上调5.17倍；与对照组相比，沉默TaMKK9的小偃6号植株接种条锈菌后，叶片表面的条锈菌夏孢子堆显著增多，防御相关基因TaPR1的表达降低66.9%~94.4%，转高温24和48 h后叶片H₂O₂积累量分别下降29.9%和59.5%；过表达TaMKK9的小偃6号植株接种条锈菌后，条锈菌生物量降低60.5%~72.0%，小麦植株抗病性显著增强。TaMKK9与TaMPK3互作验证结果表明，TaMKK9与TaMPK3存在互作。 结论 在小偃6号高温抗条锈病过程中，受条锈菌和高温双重诱导，导致TaMKK9表达量显著增加。TaMKK9与下游TaMPK3互作传递免疫信号，参与ROS信号通路，通过影响小麦植株H₂O₂的积累正调控小麦植株对条锈菌的抗性。

Abstract

Objective This study aims to explore the function of TaMKK9 in the process of high-temperature induced stripe rust resistance in Xiaoyan 6，and to elucidate the molecular mechanism underlying the involvement of the MAPK （mitogen-activated protein kinase） cascade in wheat’s high-temperature induced stripe rust resistance，in order to refine the regulatory network for disease resistance in wheat under high-temperature conditions. Method Virus-induced gene silencing and virus-induced gene overexpression were used to explore the role of TaMKK9 in wheat’s resistance to stripe rust under high-temperature conditions.Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression levels of TaMKK9 and other genes related to disease resistance.Downstream interaction targets of TaMKK9 were screened by yeast two-hybridization，and the interaction relationship was verified by BiFC，Co-IP，and GST Pull-down. Result TaMKK9 was a protein kinase loca-lized to the cell membrane，cytoplasm，and nucleus.Real-time quantitative PCR validation showed that the expression level of TaMKK9 in Xiaoyan 6 was upregulated by 5.17 times，which was induced by stripe rust and high temperature.Compared to the control，Xiaoyan 6 plants with TaMKK9 silenced exhibited more uredinium on leaf surfaces after stripe rust inoculation，accompanied by a 66.9%-94.4% reduction in the expression of the defense-related gene TaPR1.After exposure to high temperature for 24 and 48 hours，H₂O₂ accumulation in leaves decreased by 29.9% and 59.5%，respectively.Overexpression of the TaMKK9 gene in Xiaoyan 6 plants resulted in a 60.5%-72.0% reduction in stripe rust fungus biomass and significantly enhanced disease resistance in wheat plants.The interaction verification results between TaMKK9 and TaMPK3 indicated that TaMKK9 interacted with the downstream TaMPK3. Conclusion During the resistance process against stripe rust in Xiaoyan 6 under high-temperature conditions，the expression level of TaMKK9 increased due to dual induction by stripe rust and temperature.TaMKK9 interacted with the downstream TaMPK3 to transmit immune signals and positively regulates the resistance of wheat plants to stripe rust by affecting H₂O₂ accumulation in plants.

Graphical abstract

关键词

条锈菌 / 小偃6号 / 高温抗条锈性 / MAPK

Key words

stripe rust / Xiaoyan 6 / high temperature resistance to stripe rust / MAPK

作为我国第二大粮食作物，小麦是保障粮食安全的重要支柱。小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f.sp.tritici，Pst.）引起的危害小麦生产的重要病害^［1］。据统计，20世纪40年代至今，小麦条锈病在中国发生了8次大流行，累计造成小麦产量损失近140亿kg^［2］。种植抗病品种是防控小麦条锈病流行最有效的方法之一，但由于条锈菌毒性变异频繁，导致小种专化型小麦抗病品种的抗性丧失^［3］。因此，选育具有非小种专化型的持久抗病品种是防治小麦条锈病的重要举措^［4］。

高温抗条锈性是指在相对较高环境温度下表现的一种低反应型抗病性，具有持久性和非小种专化性的特点^［5］。根据高温诱导产生抗条锈性的时期不同，可分为成株期高温抗病性（HTAP）和全生育期高温抗病性（HTAS）^［6-7］。小偃6号是典型的全生育期高温抗病小麦品种，由长穗偃麦草与普通小麦杂交育成^［8］。在常温（15 ℃）下小偃6号对条锈菌为感病反应，在潜育后期经高温（18~21 ℃）诱导6~12 h后，转变为抗病反应^［9］。进一步研究发现，诱导小偃6号高温抗条锈病的最佳条件为花斑期（接菌后8 d）20 ℃处理24 h^［10］。

为探究小偃6号与条锈菌、温度互作的分子机制，对小偃6号进行转录组测序分析，共检测到1 395个差异表达基因^［11］。其中，转录因子TaWRKY70、TaWRKY62和TaWRKY45，均含有LRR-RLK类受体激酶TaXa21和TaSERK1，NBS-LRR免疫受体TaRPM1和TaRPS2，富含半胱氨酸类受体激酶TaCRK10和胞质类受体激酶TaRIPK，正向调控小麦高温全生育期抗条锈病过程^［12-19］；TaWRKY49负向调控小麦高温全生育期抗条锈病过程^［13］。另外，条锈菌效应子也参与小偃6号全生育期高温抗病性过程。其中PSTG_11208能增强小麦对条锈菌的抗性，PstCEP1则通过与PSTG_11208互作抑制PSTG_11208对小麦条锈病的抗性，增强条锈菌的致病性，进而影响小偃6号的高温抗病性^［20］；PSTG_01766通过抑制TaRIPK诱导的TaPLCP1磷酸化降低小麦对条锈菌的抗性^［16］。关于MAPK级联通路参与小偃6号高温抗条锈病的研究还相对空白。从小偃6号的1 395个差异表达基因中鉴定到1个MAPK级联信号通路成员TaMKK9，前期研究发现，接菌后高温处理能使TaMKK9的表达上调4.82倍。本研究通过TaMKK9基因沉默与过表达、下游互作靶标筛选等，探索TaMKK9参与小麦高温抗条锈病的功能，以期为完善小偃6号高温抗条锈病分子调控网络奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

植物材料为小偃6号、铭贤169小麦品种以及本氏烟草，均由本实验室保存。小麦生长条件为白天15 ℃、黑夜12 ℃，光周期为16 h光照、8 h黑暗；烟草生长条件为25 ℃恒温培养，光周期为16 h光照、8 h黑暗。条锈菌为32号生理小种（CYR32），在条锈菌感病品种铭贤169上进行扩繁。

1.2 试验方法

1.2.1 亚细胞定位

将TaMKK9基因ORF区全长构建到pCAMBIA1302-eGFP载体中，获得带有eGFP标签的重组质粒，利用农杆菌介导的瞬时表达法，分别与带有RFP标签的细胞核定位Marker TaWRKY33-RFP^［21］、膜定位Marker TaPsIPK1-RFP^［22］共同转化烟草。2~3 d后制作烟草叶片切片，在激光共聚焦显微镜下观察eGFP与RFP蛋白的荧光情况。

1.2.2 TaMKK9基因表达检测

将小偃6号小麦植株分为4组，设置4个处理，分别为：不接菌常温培养（N Mock）、接菌常温培养（N）、接菌转高温（接菌8 d后20 ℃处理24 h）培养（NHN）和不接菌转高温培养（NHN Mock）。分别在接菌后0，72，192，204，216，240，264，312 h取小麦叶片，检测TaMKK9基因在小偃6号高温抗条锈病过程中的表达情况。

1.2.3 病毒诱导基因沉默（VIGS）

比对小麦基因组A、B、D 3个拷贝中的TaMKK9序列，选取ORF区特异性基因片段，通过同源重组连接构建到BSMV：γ载体中，得到重组质粒BSMV：目的基因。将病毒骨架载体BSMV：α、BSMV：β、BSMV：γ、BSMV：TaPDS（八氢番茄红素脱氢酶，类胡萝卜素生物合成途径关键基因）、BSMV：TaMKK9进行线性化，使用RiboMAX^TM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录，摩擦接种小偃6号小麦叶片。空白对照（MOCK）不接种，对照组BSMV：00接种BSMV：α、BSMV：β和BSMV：γ空载体，试验组BSMV：TaMKK9接种BSMV：α、BSMV：β和BSMV：TaMKK9，阳性对照BSMV：TaPDS接种BSMV：α、BSMV： β和BSMV：TaPDS。当阳性对照出现光漂白现象时，接种条锈菌。分别在接菌后0，12，24和48 h取小麦叶片，检测TaMKK9表达量；接菌8 d后转高温处理（20 ℃处理24 h），分别在高温处理0，12，24和48 h后取小麦叶片，检测防御相关基因TaPR1的表达量。分别取高温处理后24和48 h小麦叶片样品约0.1 g，使用过氧化氢（H₂O₂）含量试剂盒检测叶片的H₂O₂积累量。

1.2.4 病毒诱导基因过表达（VOX）

将TaMKK9基因ORF区全长序列构建到BSMV：γ₂载体中，得到VOX：TaMKK9。将病毒骨架载体BSMV：α、BSMV：β、BSMV：γ₁、BSMV：γ₂、VOX：TaMKK9进行线性化和体外转录，接种小偃6号小麦植株的第二叶，空白对照MOCK不接种；对照组VOX：00接种BSMV：α、BSMV：β、BSMV：γ₁和BSMV：γ₂空载体；试验组VOX：TaMKK9接种BSMV：α、BSMV：β、BSMV：γ₁和BSMV：TaMKK9。当小麦叶片出现褪绿现象后接种条锈菌。分别在接菌0，24，48和120 h后取小麦叶片，用于TaMKK9基因表达量检测；分别在接菌后9和14 d取小麦叶片，用于条锈菌生物量检测。

1.2.5 酵母双杂交筛选互作蛋白

参考上海欧易生物核体系的酵母双杂系统，将TaMKK9基因ORF区全长序列构建到pGBKT7载体中，转化酵母感受态细胞Y2H Gold（上海唯地公司），进行TaMKK9基因自激活与毒性检测。克隆得到小偃6号基因组中的6个MAPKs，并构建到pGADT7载体中，与TaMKK9进行一对一互作验证，筛选TaMKK9下游靶标。

1.2.6 双分子荧光互补

将诱饵基因ORF全长序列连接至CeYFP载体中，候选靶标连接到NeYFP载体中，进行双分子荧光互补（BiFC）试验。利用农杆菌介导的瞬时表达法在烟草中进行瞬时表达，2~3 d后，制作烟草叶片切片，在激光共聚焦显微镜下观察YFP蛋白的荧光情况。

1.2.7 免疫共沉淀与GST Pull⁃down试验

将诱饵基因和靶标基因分别构建到pCAMBIA1302-eGFP和pCAMBIA1302-RFP载体中，分别获得带有eGFP和RFP蛋白标签的重组质粒；利用农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草，3~4 d后使用NP40裂解液提取烟草叶片总蛋白。参考GFP trap琼脂糖珠（武汉三鹰公司）使用说明进行免疫共沉淀（Co-IP）试验，分别用GFP Tag Monoclonal antibodies和Flag Tag Monoclonal antibodies（武汉三鹰公司）进行检测。

构建诱饵基因和靶标基因的原核表达载体，获得带有6×His和GST蛋白标签的重组蛋白，参考BeyoGold™ GST-tag Purification Resin（上海碧云天公司）说明书进行GST Pull-down试验，分别用GST Tag Monoclonal antibodies和His Tag Monoclonal antibodies（武汉三鹰公司）进行检测。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 基因表达量检测

使用植物总RNA提取试剂盒（上海Promega公司）提取小麦叶片总RNA，使用Primer Script RT Master Mix（日本TaKaRa公司）进行反转录合成cDNA。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）进行基因表达量检测，qRT-PCR试剂使用UltraSYBR Mixture（泰州康为世纪公司），基因相对表达量使用2^-∆∆Ct 法进行计算。

1.3.2 H₂O₂含量检测

称取约0.1 g小麦叶片，液氮研磨后加入1 mL丙酮，充分混匀后在4 ℃、8 000 g离心10 min，取上清，使用过氧化氢含量（H₂O₂）试剂盒（苏州科铭公司）检测H₂O₂含量。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2019对试验数据进行统计及绘图，采用SPSS 26.0进行差异显著性检验，图中数据以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 TaMKK9基本信息及其亚细胞定位

TaMKK9编码343个氨基酸，相对分子质量为36.38 ku，理论等电点为8.44。TaMKK9结构域预测结果（图1-A）表明，该蛋白有1个蛋白激酶结构域。以TaPsIPK1-RFP作为细胞膜定位Marker，TaWRKY33-RFP作为细胞核定位Marker，在烟草叶片中进行TaMKK9亚细胞定位，结果（图1-B）发现，TaMKK9的定位与TaPsIPK1和TaWRKY33均有重合，表明TaMKK9定位于细胞质、细胞核和细胞膜。

2.2 TaMKK9正调控小偃6号高温抗条锈性

采用实时荧光定量PCR验证TaMKK9在小偃6号植株高温抗条锈病过程中的表达模式。结果（图2）表明，与不接菌常温培养（N Mock）相比，接菌192 h后进行转高温（20 ℃处理24 h）诱导（NHN），诱导24 h后（即接菌后216 h）TaMKK9的表达水平上调5.17倍；而转高温不接菌组（NHN Mock），TaMKK9基因的表达水平仅上调1.77倍，表明TaMKK9的表达受条锈菌和高温的双重诱导。

病毒诱导小偃6号TaMKK9基因沉默后，观察小麦叶片的发病情况，发现转高温处理组（NHN），沉默TaMKK9基因后小麦叶片条锈菌夏孢子堆明显增多（图3-A）。TaMKK9基因表达量的实时荧光定量PCR检测结果（图3-B）表明，与对照组相比，接种BSMV：γ-TaMKK9的小麦植株基因表达量降低了31.6%~61.9%。在转高温24和48 h分别检测小麦叶片中的H₂O₂积累量，结果（图3-C）发现，与对照组相比，沉默TaMKK9基因后小麦植株中H₂O₂的积累量分别显著下降29.9%和59.5%。未沉默TaMKK9基因的小麦植株经高温诱导后防御相关基因TaPR1表达上调2.77倍，而沉默TaMKK9基因小麦植株中TaPR1的表达量显著低于未沉默组66.9%~94.4%（图3-D）。上述结果表明，TaMKK9基因沉默显著降低了小偃6号的高温抗条锈性。

将TaMKK9基因ORF区全长构建到载体BSMV：γ₂中，诱导小偃6号小麦植株TaMKK9基因过表达。接种条锈菌后，过表达植株叶片表面条锈菌夏孢子堆数量明显少于对照组（图4-A），TaMKK9表达量检测结果（图4-B）表明，过表达植株TaMKK9基因相对表达量较对照组植株上调1.98~4.27倍，另外，过表达TaMKK9植株条锈菌生物量显著低于对照组60.5%~72.0%（图4-C）。进一步说明TaMKK9在小偃6号高温抗条锈病中发挥正调控作用。

2.3 TaMKK9与TaMPK3互作验证

由图5-A可知，转入pGBKT7-TaMKK9的酵母在SD-Trp上生长正常，在SD-Trp/X-α-gal上不会变蓝，在SD-Trp/X-α-gal/ABA上无法生长，说明TaMKK9无自激活活性且无毒性。克隆得到6个小麦TaMAPKs，构建重组质粒pGADT7-TaMAPKs，通过酵母双杂交系统验证其与TaMKK9互作关系，结果（图5-B）表明，在SD-Leu-Trp（DDO）培养基上所有组合均能正常生长，在SD-Leu-Trp-His-Ade（QDO）培养基上只有共转TaMKK9与TaMPK3的酵母和阳性对照能够生长，说明TaMKK9与TaMPK3存在互作。

烟草叶片中BiFC结果（图6）显示，共注射TaMKK9-YFP^N+TaMPK3-YFP^C的烟草叶片细胞，可以在细胞质和细胞膜上观察到黄色荧光，表明TaMKK9与TaMPK3在细胞质和细胞膜上发生互作。

为证明TaMKK9与TaMPK3是否存在直接的物理互作，原核表达GST蛋白、TaMKK9重组融合蛋白His-TaMKK9和TaMPK3激酶结构域的重组融合蛋白GST-TaMPK3-KD，GST-Pull-down结果（图7-A）发现，GST无法下拉His-TaMKK9，GST-TaMPK3-KD能够下拉His-TaMKK9，说明TaMKK9与TaMPK3可以在体外发生直接的物理互作。在烟草叶片中共表达RFP-TaMPK3与GFP-TaMKK9，提取发光烟草叶片总蛋白，Co-IP结果（图7-B）发现，GFP不能共沉淀RFP-TaMPK3，而重组蛋白GFP-TaMKK9能够共沉淀到RFP-TaMPK3，表明TaMKK9与TaMPK3能够在体内互作。

3 讨论与结论

本研究聚焦于MAPK级联中的MAPKK即TaMKK9，探究TaMKK9参与小麦高温抗条锈的分子机理。依据系统发育分析MAPKK可分为4组：A组包括MKK1、MKK2和MKK6，B组包括MKK3，C组包括MKK4和MKK5，D组包括MKK7、MKK8、MKK9和MKK10^［23］。已有研究发现，MKK1和MKK2作用于MPK4，负向调控植物免疫过程^［24-25］；MKK3能够通过调控MPK6，参与JA信号通路的调节，进而影响植物对病原物的响应^［26］；MKK4和MKK5在MPK3和MPK6的上游调控植物免疫反应^［26-27］，在MPK1和MPK2的上游调控植物的生长发育等^［28］。TaMKK9为D组成员，目前研究较少。有研究表明，水稻D组的OsMKK10-2作用于OsMPK3，调控转录因子OsWRKY31的稳定性，进而影响水稻对稻瘟病的抗性及生长发育表型^［29］。

本研究结果表明，TaMPK3与TaMKK9互作，可能参与TaMKK9正向调节小麦高温抗条锈病过程。已有研究表明，MAPK家族成员可以分成A、B、C、D共4组^［30］，其中A组包括MPK3和MPK6，不仅参与调控植物的生长发育过程，也参与生物胁迫的响应过程。WRKY33能够被MPK3/MPK6磷酸化以促进ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid）合成酶ACS2和ACS6以及植保素（camalexin）生物合成基因的表达^［31-32］；MPK3/MPK6与转录因子WRKY18相互作用并磷酸化，促进WRKY18调节蛋白磷酸酶基因AP2C1和PP2C5的表达，从而达到调节PTI和ETI的作用^［33］；MPK3/MPK6在响应灰芽孢杆菌感染过程中增加了ERF6蛋白在体内的稳定性，进而增强植物免疫^［34］。在细胞质和细胞膜中，TaMKK9通过与TaMPK3的互作传递免疫信号，而在细胞核中也存在TaMKK9定位，能够通过其他途径将信号传递到细胞核，进而启动一系列防卫反应。

已有研究发现，小偃6号高温抗条锈过程与H₂O₂信号通路相关^{［14，17］}。本研究结果表明，TaMKK9基因沉默会降低小麦叶片H₂O₂积累量，可能通过调节ROS信号通路调控小偃6号抗病过程。ROS包括超氧阴离子（O₂⋅^-）、过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（⋅OH）和一氧化氮（NO），其不仅可以作为信号分析激活植物防御反应，也能抑制或直接杀死病原菌^［35-36］。其中H₂O₂反应性较低，可以跨膜扩散，使其成为一种重要的信号分子^［37］。植物免疫中的ROS信号主要由呼吸爆发氧化酶同源蛋白RBOHs产生，RBOH酶将电子从细胞质中的NADPH转移到质外体中的氧气产生O₂⋅^-，进而通过质外体中的超氧化物歧化酶（SOD）转化为H₂O₂，H₂O₂可以被过氧化氢酶（CAT）清除^［37-38］。推测TaMKK9可能通过影响ROS信号通路中关键酶的活性来影响H₂O₂的积累量。

MAPK级联中MAPKKK磷酸化S/TXXXX-XS/T基序中的丝氨酸或苏氨酸残基激活MAPKK，MAPKK再通过磷酸化TEY或TDY的苏氨酸和酪氨酸残基激活MAPK，MAPK将信号传递到下游转录因子、酶或其他蛋白，实现逐级活化，从而将胁迫信号传递并放大，引起细胞内一系列生理生化反应，实现细胞抗逆功能^［39-40］。后续研究将验证TaMKK9对TaMPK3的磷酸化，同时寻找与TaMKK9互作的MAPKKK和TaMPK3下游靶标，结合生物信息学预测与蛋白质谱分析等方法寻找磷酸化位点，利用位点突变探究磷酸化修饰对蛋白功能的影响，将参与调控小偃6号高温抗锈性MAPK级联信号通路补充完整。

本研究对MAPK级联通路成员TaMKK9参与调控小偃6号高温抗条锈病的功能进行了探究，发现在小偃6号高温抗条锈过程中，条锈菌与高温的双重诱导导致TaMKK9表达量增加，TaMKK9与TaMPK3互作传递免疫信号，参与ROS信号通路，通过影响叶片中的H₂O₂积累来调控小麦高温抗条锈过程。

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基金资助

科技部国际合作项目(KY202002018)

科技部国际合作项目(G2023172013L)

国家现代农业（小麦）产业技术体系项目(CARS-03-37)

国家自然科学基金项目(31972219)

西北农林科技大学推广项目(TGZX2021-13)

西北农林科技大学高水平创新团队项目(XYTD2023-04)