金黄色葡萄球菌外囊泡对奶牛乳腺上皮细胞炎症的诱导作用

摘要

【目的】探究金黄色葡萄球菌外囊泡（EVs）对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）炎症的影响，为系统阐述金黄色葡萄球菌EVs诱导BMECs炎性损伤的分子机制奠定基础。【方法】通过差速+超速离心法分离纯化金黄色葡萄球菌的EVs，利用透射电镜和纳米颗粒跟踪分析对EVs进行鉴定；用DIO荧光染料示踪金黄色葡萄球菌EVs，观察BMECs对金黄色葡萄球菌EVs的内化情况；用0,5,10,20,25μg/mL EVs处理BMECs，测定EVs对BMECs增殖活力的影响；将20μg/mL EVs与BMECs共孵育0,1,3 h，通过Western Blot、RT-qPCR测定NLRP3信号通路炎性因子表达量；用NLRP3抑制剂MCC950预处理BMECs 3 h后，用20μg/mL EVs与BMECs共孵育1 h,Western Blot测定NLRP3信号通路炎性因子表达量。【结果】成功从金黄色葡萄球菌培养上清液中获得纯化的EVs，其具有双层膜和典型的杯盘状结构，粒径大小为80～320 nm，符合革兰氏阳性菌EVs特征。EVs可被BMECs内化至胞内。0～25μg/mL EVs对BMECs的活性无显著影响。经20μg/mL EVs处理后，BMECs IL-18、IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA相对表达量在1 h时均较对照极显著上升（P<0.01）,IL-18、IL-1β基因mRNA相对表达量在3 h时也较对照分别极显著和显著升高；Western Blot结果显示，与0 h处理组相比，EVs处理1,3 h BMECs NLRP3信号通路中NLRP3、GSDMD、N-GSDMD、caspase1、IL-18、IL-1β等炎性因子蛋白表达量大多显著或极显著上升；与EVs处理组相比，MCC950+EVs处理组BMECs NLRP3信号通路中NLRP3、GSDMD、N-GSDMD、c-caspase1、IL-18、IL-1β等炎性因子蛋白表达量均显著或极显著下调。【结论】金黄色葡萄球菌在正常增殖过程中能分泌EVs，可被BMECs内化。EVs通过NLRP3信号通路诱导BMECs发生炎症反应，表明EVs在金黄色葡萄球菌感染BMECs的过程中有重要作用。

关键词

金黄色葡萄球菌 / 外囊泡 / 奶牛乳腺上皮细胞 / NLRP3信号通路