青海省设施辣椒根结线虫病分布与病原鉴定

Distribution and pathogen identification of root-knot nematode disease in facility pepper cultivation in Qinghai Province

摘要

目的 明确青海省主要农业区设施辣椒根结线虫的分布及其种类，为针对性防治根结线虫病提供依据。 方法 2024年对青海省主要农业区设施辣椒上根结线虫病害的发生情况进行调查。在青海省4市（州）12县（区）的设施辣椒栽培区采集疑似感染根结线虫病的病根328份，带回实验室分离根结线虫，在显微镜下观察和测量根结线虫2龄幼虫及雌虫的体长、体宽、尾长和口针长等形态特征。并采用蛋白酶K法提取其DNA，利用根结线虫rDNA-ITS及28S rDNA引物进行PCR扩增，通过国内常见的4种根结线虫特异性引物（inc-K14-F/R、Far/Rar、Mh-F/R、Fjar/Rjar）进行鉴定。将分离获得的根结线虫悬浮液接种于真叶为6 叶的健康辣椒根部，接种40 d后取辣椒根部进行染色，观察根结线虫的感染性。 结果 调查发现青海省海东市平安区、循化撒拉族自治县及海西蒙古族藏族自治州格尔木市的设施辣椒根结线虫病发生最为严重，病情指数分别为70.00，55.08和67.69，根结线虫检出率分别为75.00%，61.54%和73.08%；青海省西宁市湟中区设施辣椒根结线虫病的病情较为严重，病情指数为41.60，根结线虫检出率为56.00%；黄南藏族自治州尖扎县设施辣椒根结线虫病的病情较轻，病情指数为19.52，根结线虫检出率为38.10%；海东市民和回族土族自治县及互助土族自治县的病情指数分别为8.89和5.38，根结线虫检出率分别为27.78%和19.23%；其余县（区）均未检出根结线虫。对采集的328份疑似根结线虫病样进行检测，共检出阳性样本111份，阳性检出率为33.84%。分离所得根结线虫群体在形态学特征及体测值上均与南方根结线虫（Meloidogyne incognita）和花生根结线虫（Meloidogyne arenaria）一致。利用4种根结线虫SCAR序列特异性引物进行PCR扩增，检出南方根结线虫82份，检出率为25.00%；花生根结线虫34份，检出率为10.37%；病情严重地区存在2种线虫交叉感染现象，12份分子鉴定样本中，南方根结线虫和花生根结线虫复合侵染的占比为33.33%；北方根结线虫（Meloidogyne hapla）与爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica）均未被检出。 结论 青海省主要农业区设施辣椒已有根结线虫发生，部分地区病情严重，病情指数达到55以上。青海省设施辣椒根结线虫病病原为南方根结线虫和花生根结线虫，且南方根结线虫为该省设施辣椒根结线虫病的病原优势种。

Abstract

Objective This research aims to investigate the distribution pattern and identify the species of Meloidogyne spp.in the major agricultural regions of Qinghai Province，specifically in pepper crops，to provide a basis for the development of targeted control measures for root-knot nematode diseases in the province. Method In 2024，a survey was conducted to assess the occurrence of root-knot nematode （Meloidogyne spp.） disease in facility-grown pepper （Capsicum annuum L.） across major agricultural regions of Qinghai Province，China.A total of 328 suspected infected root samples were collected from pepper production greenhouse in 12 counties/districts across 4 prefecture-level regions.Root-knot nematodes were isolated from di-seased roots，and the morphological characteristics of 2nd-instar larvae and females，including body length，body width，tail length，and stylet length，were examined under a microscope.Genomic DNA was extracted by using the proteinase K method，and PCR amplification was performed with universal primers targeting the rDNA-ITS and 28S rDNA regions，followed by validation using species-specific primers （inc-K14-F/R，Far/Rar，Mh-F/R，and Fjar/Rjar） for four common root-knot nematode species in China.Pathogenicity was confirmed by inocula-ting nematode suspensions onto roots of six-leaf-stage healthy pepper plants，with the infection condition verified through root staining approximately 40 days post-inoculation. Result The highest incidence of root-knot nematode disease in facility-cultivated peppers was recorded in Ping’an district and Xunhua Salar Autonomous county of Haidong city，as well as Golmud city of Haixi Mongol and Tibetan Autonomous Prefecture，with di-sease index of 70.00，55.08，and 67.69，and root-knot nematode detection rates of 75.00%，61.54%，and 73.08%，respectively.A moderately high disease incidence was observed in Huangzhong district of Xining city，with a disease index of 41.60 and a detection rate of 56.00%.In Jianzha county of Huangnan Tibetan Autonomous Prefecture，the disease incidence was relatively low，with a disease index of 19.52 and a detection rate of 38.10%.In Minhe Hui and Tu Autonomous county and Huzhu Tu Autonomous county of Haidong city，the di-sease indices were 8.89 and 5.38，with corresponding detection rates of 27.78% and 19.23%，respectively.No root-knot nematode disease was detected in the remaining surveyed regions.Among a total of 328 suspected pepper root samples，111 were tested as positive for root-knot nematodes，resulting in an overall detection rate of 33.84%.The morphological characteristics of the isolated nematodes，including measurements，were consistent with those of M.incognita （southern root-knot nematode） and M.arenaria （peanut root-knot nematode）.SCAR-specific primers for root-knot nematodes were used for PCR amplification，and 82 positive samples of M.incognita （detection rate was 25.00%） and 34 positive samples of M.arenaria （detection rate was 10.37%） were identified.Co-infection of both nematode species was observed in regions with severe infection conditions.Among the 12 molecular identification samples，the samples co-infected by M.incognita and M.incognita accounted for 33.33 %.Neither Meloidogyne hapla （northern root-knot nematode） nor Meloidogyne javanica （java root-knot nematode） was detected. Conclusion Root-knot nematodes have been identified in facility vegetable-growing regions of Qinghai Province，with severe infection conditions observed in certain areas，where the disease index exceeds 55.Morphological and molecular analyses confirmed that the root-knot nematode disease in facility-grown peppers across Qinghai Province was caused by M.incognita and M.arenaria，with M.incognita identified as the predominant species.

Graphical abstract

关键词

设施辣椒 / 根结线虫 / 病原鉴定 / 青海省

Key words

facility peppers / Meloidogyne spp. / pathogen identification / Qinghai Province

近年来，我国辣椒种植面积和总产量呈逐年上升趋势，其消费量在国内蔬菜消费中居首位^［1］。设施辣椒栽培可采用错季生产技术，实现春季提前上市和秋季延后采收，从而有效延长生产周期，显著提高单位面积产量，并为农户带来较高的经济效益^［2］。

根结线虫属（Meloidogyne spp.）具有全球性分布特征，可寄生于所有维管植物^［3］。其中南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica）、北方根结线虫（Meloidogyne hapla）和花生根结线虫（Meloidogyne arenaria）是目前我国最主要的4种根结线虫^［4］，广泛分布于北方温带地区和南方热带地区。其寄主范围极广，包括蔬菜、水果及多种园林植物^［5-7］。根结线虫原本广泛分布于我国热带和亚热带地区^［8-10］，但随着设施蔬菜产业的迅速发展，尤其是日光温室的大面积推广，以及复种指数提高和重茬种植的普遍发生，为根结线虫提供了适宜的生长和繁殖环境，导致土壤中线虫数量剧增，并呈现逐渐向北扩散的趋势^［11-12］。郭靖宇等^［13］报道了2012-2021年内蒙古自治区赤峰市设施蔬菜大棚内南方根结线虫在土壤内的动态发生规律。2018-2019年宫远福^［14］针对东北地区根结线虫发生情况进行调查及种类鉴定，发现东北地区有南方根结线虫、北方根结线虫及花生根结线虫发生。马少军等^［15］于2020年9月至2021年5月鉴定出新疆兵团第十四师四十七团设施蔬菜根结线虫种类均为南方根结线虫，不存在其他线虫复合侵染的情况。旺珍^［16］在2021年发现西藏林芝市设施蔬菜上有南方根结线虫发生，并总结了根结线虫的生物学特征、传播途径及防治措施。上述研究说明根结线虫的发生逐渐向高纬度高海拔地区扩散。

青海省因其特殊的地理位置和气候条件，露地作物中鲜有根结线虫发生。茄科作物多为喜温性作物，适宜生长温度为25 ℃，空气相对湿度需保持在60%~70%^［17-18］，这一环境条件与根结线虫最适生长温湿度相近^［19］，这为根结线虫的侵染和繁殖提供了有利条件。近年来，随着设施蔬菜产业的不断发展，根结线虫病在青海省呈逐年加重趋势。目前缺乏针对青海省设施辣椒根结线虫病分布及种群鉴定的系统性研究。为此，本研究对青海省4市（州）12县（区）设施辣椒的根结线虫发生情况进行调查，并对其种类进行鉴定，旨在明确危害青海省设施辣椒的主要根结线虫种类，为后续开展有针对性的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 青海省设施辣椒根结线虫病害调查

2024年5月对青海省主要农业区设施辣椒基地开展根结线虫病害调查。每个调查基地随机选择6个种植大棚，每棚随机抽查15株辣椒。调查内容包括：观察辣椒植株地上部生长状况；挖开表层土壤检查根系是否形成根结；采集具有典型发病症状的植株完整根系，置于自封袋内带回实验室备用。样品采集于西宁市、海东市、黄南藏族自治州和海西蒙古族藏族自治州，采集样本数分别为46，148，42和92份，合计328份。

根据刘伟中等^［20］的分级标准统计根结线虫发病情况，具体分级标准如下。

0级，整个根系没有根结；1级，根系轻微感染，根结数少于10个，根结百分率小于10%；2级，根系根结明显，根结数10~50个，根结百分率11%~25%；3级，根结百分率26%~50%；4级，根结百分率51%~75%；5级，根结百分率75%~100%。

病情指数=100×（∑（各级病株数×各级代表值））/（调查总株数×最高级代表值）。

1.2 根结线虫的分离、纯化及扩繁

参考刘丽等^［21］的方法分离、收集根结线虫雌虫、2龄幼虫及卵囊。将卵囊置于超纯水中，28 ℃恒温培养箱中培养孵化，2~3 d后可观察到2龄幼虫。参考石明明等^［22］的方法将其接种到具有6片真叶且长势一致的健康辣椒植株根部，用以纯化及扩繁。

1.3 根结线虫的形态学鉴定

根结线虫雌虫会阴花纹样片制作：参考段玉玺^［23］的方法，将根结线虫雌虫置于含45%乳酸的载玻片上，使用手术刀小心切下虫体后部，清洗内部内容物。随后将处理过的虫体后部移至另一滴纯甘油上，铺平并展开，制成临时玻片^［24］，在显微镜下进行观察并拍照及体值测量。

根结线虫2 龄幼虫形态观察：参考1.2节中的纯化方法，培养卵囊2~3 d后随机挑取20条2龄幼虫置于载玻片上，以超纯水作为浮载剂。将载玻片置于70 ℃恒温金属加热板上处理10 s，显微镜下观察虫体形态变化。若虫体由弯曲状态恢复为直线形态，则判定为死亡。随后立即加入一滴等量的TAF固定液进行固定，制成临时玻片^［25］。参考谢辉^［26］的方法进行形态学观察和体值测量。

1.4 根结线虫的分子生物学鉴定

参照杨艳梅等^［27］的蛋白酶K法提取根结线虫DNA，以DNA粗提液为模板，根据魏佩瑶等^［28］和陈京环等^［29］报道的根结线虫通用引物rDNA-ITS（TTGATTACGTCCCTGCCCTTT/TTTCAC-TCGCCGTTACTACGG）和28S rDNA D2A/D3B（ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG/TCGG-AAGGAACCAGCTAC）分别进行扩增。回收阳性扩增产物并送至杨凌天润奥科生物科技有限公司测序，将测序结果上传至GenBank数据库与根结线虫序列进行比对。利用国内常见的4种根结线虫SCAR序列的特异性引物^［30］进行验证，引物信息详见表1。

1.5 接种验证

选取具有6片真叶且生长势一致的健康辣椒幼苗，移栽于18 cm×19 cm的塑料盆中，每盆栽植2株，共10盆，在温室自然光条件下培养（温度范围20~25 ℃）1周后，将从新鲜根结中分离纯化的根结线虫悬浮液（2 000条/mL）以每盆2 mL的接种量进行接种，共接种6盆，其余4盆以无菌水处理作为空白对照，观察植株发病情况。接种40 d后，参考段玉玺等^［23］的方法，利用体积分数0.15%酸性品红溶液对发病植株的根部进行染色，以确定接种成功。从发病根系中重新分离线虫，并进行种群鉴定，以验证其与接种线虫群体一致。

1.6 数据处理

利用Excel 2019及SPSS 27.0进行试验数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 青海省设施辣椒根结线虫病害的发生情况

调查发现，与健康辣椒植株（图1-A）相比，根结线虫侵染初期辣椒植株地上部表现出类似于缺素的症状（图1-B），主要表现为叶片黄化，茎秆细长，整体生长缓慢，并在中午出现萎蔫症状。挖取根系发现主根较弱或不明显，须根与毛细根异常增生，根系表面分布有大小不等的球形根结（图1-C）。发病初期，根结表面光滑且呈白色瘤状；随着病程发展，由于线虫侵入引发其他病原交叉感染，根部逐渐褐变腐烂（图1-E）。剖开根结，可观察到乳白色或半透明针头状的雌成虫。

对青海省主要农业区设施辣椒的调查结果（表2）表明，海东市平安区、循化撒拉族自治县以及海西蒙古族藏族自治州格尔木市设施辣椒根结线虫病发生最为严重，检出率分别为75.00%，61.54%和73.08%，病情指数分别为70.00，55.08和67.69；西宁市湟中区的设施辣椒根结线虫病病情较重，病情指数为41.60，检出率为56.00%；黄南藏族自治州尖扎县的设施辣椒根结线虫病病情较轻，病情指数为19.52，检出率为38.10%；海东市民和回族土族自治县及互助土族自治县的设施辣椒根结线虫病病情指数分别为8.89和5.38，检出率分别为27.78%和19.23%；其余各县（区）均未发现根结线虫病。

2.2 青海省设施辣椒根结线虫的形态学特征

民和回族土族自治县及尖扎县分离所得的设施辣椒根结线虫群体2龄幼虫整体呈细长的蠕虫状，平均体长为456.05 μm；头部圆、尾部尖（图2-A），平均尾长为32.01 μm；口针发达，平均口针长为10.95 μm，口针基部球明显。雌虫整体呈梨形，颈部突出，主体呈椭圆状（图2-C），腔内含有卵囊，平均体长和平均体宽分别为529.52和418.82 μm。中食道球前可见排泄孔，通常位于口针基部球附近。其会阴花纹表现为高而方的背弓，由平滑的线纹构成，部分线纹在侧面呈分叉状，但无明显侧线，且部分线纹弯向阴门（图2-E），基本符合谢辉^［26］所描述的南方根结线虫的形态特征（表3）。

互助土族自治县设施辣椒根结线虫群体2龄幼虫形态（图2-B）与尖扎县设施辣椒根结线虫群体类似，平均体长为413.53 μm。其雌虫虫体（图2-D）较民和群体偏圆，平均体长和平均体宽分别为571.33和403.45 μm；会阴花纹特征略有不同，表现为低背弓，肛尾间无点斑，侧面具有分叉的破碎纹（图2-F），基本符合谢辉^［26］所描述的花生根结线虫的形态特征（表4）。

2.3 青海省设施辣椒根结线虫的分子生物学鉴定

经扩增与测序，得到所分离线虫群体的rDNA-ITS和28S rDNA D2A/D3B片段单一序列，并分别上传至GenBank数据库获取登录号。通过BLAST与数据库内根结线虫序列进行比对，并利用国内4种常见根结线虫的特异性SCAR引物进行验证。结果（图3）表明，民和回族土族自治县设施辣椒根结线虫群体与尖扎县设施辣椒根结线虫群体仅检测出南方根结线虫；互助土族自治县设施辣椒根结线虫群体仅检测出花生根结线虫；西宁市湟中区，海东市平安区、循化撒拉族自治县，海西蒙古族藏族自治州格尔木市、德令哈市设施辣椒根结线虫群体则检测出南方根结线虫和花生根结线虫复合侵染。

本研究共采集青海省设施辣椒根结线虫疑似病样328份，其中通用引物检出根结线虫阳性样本111份，阳性检出率为33.84%。其中南方根结线虫特异性引物检测阳性样本数82份，检出率为25.00%；花生根结线虫阳性样本34份，检出率为10.37%（表5）。

由表6可知，12份分子鉴定样本中，南方根结线虫和花生根结线虫复合侵染占比为33.33%，仅有南方根结线虫或花生根结线虫侵染的占比分别16.67%和8.33%。表明南方根结线虫是青海省设施辣椒根结线虫病的优势病原种，而北方根结线虫和爪哇根结线虫均未被检出。

2.4 接种症状观察

接种40~60 d后，所有接种组辣椒植株的根系均出现典型根结症状（图4-A，B），其形态特征与田间发病植株完全一致，染色后在体式显微镜下可清晰发现虫体（图4-D~F）。相比之下，对照组健康辣椒植株根系发育正常，未见任何根结形成（图4-C，G）。从接种发病根系中分离获得的根结线虫，经形态学与分子生物学鉴定，其特征与接种线虫完全一致。表明所采集病根上的根结线虫病病原为南方根结线虫和花生根结线虫。

3 讨论与结论

本研究采用形态学与分子生物学相结合的方法，对青海省主要农业区4市（州）12县（区）设施辣椒根结线虫病的发生情况进行了系统调查。结果表明南方根结线虫和花生根结线虫在调查区域内均有检出，其中南方根结线虫为青海省设施辣椒根结线虫病的病原优势种；北方根结线虫和爪哇根结线虫均未检测到。

本课题组于2015年对青海省设施辣椒根结线虫病发生情况进行了系统调查，未发现根结线虫危害症状。但近年来随着种苗跨区域调运频率增加，根结线虫病害在青海省的发生程度明显加重。本次调查发现，海西蒙古族藏族自治州格尔木市、海东市平安区及循化撒拉族自治县为根结线虫病害重发区，普遍存在南方根结线虫与花生根结线虫复合侵染现象。调查结果表明，携带病原的种苗是青海省设施辣椒根结线虫病的主要初侵染源。因此，加强种苗检疫、规范种苗调运管理，对于遏制该病害的蔓延具有重要意义。根结线虫作为设施蔬菜的重要病原之一，在青海省设施蔬菜栽培区具有持续扩散与蔓延的潜在风险。本次调查还发现，即使在弃耕6~12个月后的严重发病土壤中，仍可分离出活体根结线虫，说明根结线虫在土壤中具有较强的存活能力。因此，有必要进一步扩大普查与监测范围，评估其潜在扩散区及危害风险区，为制定科学有效的防控策略提供依据。

辣椒作为青海省重要的经济作物之一，具有较高的经济效益。由于辣椒株型较高且养分需求量大，其正常生长发育直接取决于根系对水分和矿质营养的有效吸收与转运。一旦根系严重受损会导致植株因水分和养分供应不足而生长受阻，甚至死亡。根结线虫2龄幼虫侵染根系后，会通过取食活动引起根系组织破坏，导致植株生长缓慢、果实发育不良，从而造成减产并严重影响经济效益^［31］。2008年张峰等^［32］针对陕西省设施蔬菜上根结线虫进行种类鉴定及分布调查，发现南方根结线虫为棚室蔬菜致病的绝对优势种；2015-2017年张丽等^［33］在河北省设施蔬菜主产区进行根结线虫普查，发现南方根结线虫为河北省蔬菜上主要发生的种群；2016-2017年蔡毓新等^［34］针对河南设施蔬菜主产区进行土壤采样及线虫病害调查鉴定，结果表明侵染河南省设施保护地香茄、黄瓜、甜瓜的主要根结线虫种群属于南方根结线虫1号小种。综上所述，南方根结线虫在北方多省设施蔬菜中均为优势病原种，其危害呈加剧趋势。

目前，国内对根结线虫的防治仍以化学农药为主。杨甜等^［35］研究表明，41.7%氟吡菌酰胺对甜瓜苗期根结线虫具有较好的防治效果；凌文政等^［36］利用静电纺丝技术制备的氟吡菌酰胺纳米纤维剂对南方根结线虫2龄幼虫及卵均表现出较高活性，具有较大的应用潜力。与此同时，生防菌剂作为环境友好且不易产生抗性的防治措施也逐渐成为研究热点。吴蔚然等^［37］研究表明，芽孢杆菌Sneb2550和Sneb2556不仅可以促进黄瓜植株生长，而且对南方根结线虫2龄幼虫具有较强触杀活性，并能有效抑制其卵的孵化，为根结线虫的生物防治提供了新的潜在资源；匡超等^［38］研究发现，淡紫紫孢菌可作为根结线虫的生防菌，且可通过水肥系统实现应用，为构建水肥药一体化的绿色防控模式提供了新思路。

根结线虫传播速度快、寄主范围广，可通过农事操作在设施内扩散至其他大棚，并迅速蔓延至整个种植区域。因此，应加强农户对根结线虫防控知识的宣传与普及，定期开展农业技术培训，同时规范化学药剂的使用，结合绿色防控措施，以有效遏制其传播与危害。

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基金资助

青海省中央引导地方科技发展资金项目(2024ZY025)