METTL3基因在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的表达及功能分析

Analysis on the expression and function of METTL3 gene in the inflammatory response of bovine mammary epithelial cells

摘要

目的 探讨甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase-like 3，METTL3）基因在奶牛乳腺上皮细胞（bovin mammary epithelial cells， bMECs）炎症反应中的表达及功能，为解析奶牛乳房炎分子调控机制奠定基础。 方法 采用生物信息学方法分析奶牛METTL3蛋白质的结构特征；采用50 μg/mL的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）构建bMECs炎症模型，在此基础上通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测LPS诱导不同时间点（0，3，6，12和24 h）炎症因子基因（IL-6和IL‑8）及METTL3基因的表达水平，并利用CCK-8和RT-qPCR检测干扰METTL3基因后bMECs的细胞活力、炎症因子、细胞增殖及凋亡相关基因表达的变化。 结果 生物信息学分析结果表明，METTL3基因的开放阅读框（ORF）长度为1 743 bp，编码一个由580个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白存在59个潜在的翻译后修饰位点，可能通过表观转录调控机制参与细胞炎症进程。在LPS诱导bMECs的不同时间点，IL‑6和IL‑8表达量随诱导时间延长而升高，于24 h达到表达峰值（P<0.01），表明成功建立了bMECs炎症模型。与0 h相比，METTL3在LPS刺激3，6，12和24 h的表达水平均极显著上调（P<0.01），其中6 h表达量最高，呈现炎症早期响应特征。在干扰METTL3表达后，bMECs内促炎因子IL-6的表达水平极显著下调（P<0.01），IL‑8显著下调（P<0.05），IL‑1β亦呈现下降趋势，细胞增殖基因CDK2、CDK4和PCNA的表达水平均极显著升高（P<0.01），而细胞凋亡基因CASP3、CASP9和BAX的表达水平均极显著降低（P<0.01）。干扰METTL3后，bMECs细胞活力显著升高（P<0.05）。 结论 METTL3通过加剧炎症反应、促进细胞凋亡并抑制细胞增殖而加重LPS诱导的bMECs炎症损伤，提示METTL3是调控奶牛乳腺炎进程的关键分子。

Abstract

Objective This study aimed to investigate the expression and function of methyltransferase-like 3 （METTL3） in the inflammatory response of bovine mammary epithelial cells （bMECs），so as to lay a foundation for elucidating the molecular regulatory mechanisms of bovine mastitis. Method The structure cha-racteristics of the bovine METTL3 protein were analyzed by using bioinformatics methods. An inflammatory model of bMECs was established based on 50 μg/mL LPS treatment.On this basis，RT-qPCR was used to detect the expression levels of inflammatory factors （IL‑6 and IL‑8） and the METTL3 gene at different time points （0，3，6，12，and 24 h） after LPS induction.CCK-8 assay and RT-qPCR were employed to examine cell viability，the expression of inflammatory factors，and the expression of cell proliferation and apoptosis-related genes after METTL3 knockdown. Result Bioinformatics analysis results indicated that the open reading frame （ORF） of the METTL3 gene was 1 743 bp in length，encoding a protein of 580 amino acids.This protein contained 59 potential post-translational modification sites and might be involved in cellular inflammatory processes through epitranscriptional regulatory mechanisms.At different time points after LPS induction，the expression levels of IL-6 and IL-8 continued to increase over time，peaking at 24 h （P<0.01），indicating the successful establishment of an inflammatory model of bMECs.The expression level of METTL3 was highly significantly upregulated at 3，6，12，and 24 h after LPS stimulation （P<0.01） compared with that at 0 h，with the highest expression level observed at 6 h，demonstrating the characteristic of early inflammatory response.After METTL3 knockdown，the expression level of the pro-inflammatory factor IL-6 was highly significantly downregulated （P<0.01），IL-8 was significantly downregulated （P<0.05），and IL‑1β also showed a downward trend.The expression levels of cell proliferation-related genes CDK2，CDK4，and PCNA were highly significantly increased （P<0.01），while the expression levels of apoptosis-related genes CASP3，CASP9，and BAX were highly significantly decreased （P<0.01）.In addition，cell viability was significantly increased after METTL3 knockdown （P<0.05）. Conclusion METTL3 aggravates LPS-induced inflammatory injury in bMECs by exacerbating the inflammatory response，promoting cellular apoptosis，and inhibiting cell proliferation.This finding identifies METTL3 as a key regulator in the progression of bovine mastitis.

Graphical abstract

关键词

奶牛 / 奶牛乳腺上皮细胞 / 炎症反应 / METTL3

Key words

dairy cows / bovin mammary epithelial cells / inflammatory response / METTL3

奶牛乳房炎是全球乳业面临的最具破坏性的疾病之一，其发病机制涉及病原-宿主-环境的复杂互作网络。流行病学数据显示，我国规模化牧场乳房炎发病率为46%~70%，夏季高发期可导致单产下降10%~15%，并伴随20%的奶牛被淘汰^［1-2］。值得注意的是，奶牛乳房炎约60%的病例为亚临床型，其特征性的体细胞数（somatic cell count，SCC）升高与乳汁成分改变不仅严重影响乳的加工特性，更可能通过携带耐药菌株威胁食品安全^［3-5］。奶牛乳房炎的发生主要是由病原体入侵乳房所导致^［6-7］。在病原学维度，以大肠杆菌（Escherichia coli）为代表的革兰氏阴性菌是奶牛乳房炎的核心病原^［8-9］。这些病原体通过机械挤奶造成的乳头导管微损伤或环境污染物侵入乳腺组织后，其特异性毒力因子启动级联致病机制，大肠杆菌释放的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可与奶牛乳腺上皮细胞表面Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）结合，触发髓样分化初级反应蛋白88（myeloid differentiation primary response 88，MyD88）依赖的核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号通路活化，诱导白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等促炎因子释放^［10-12］。值得注意的是，病原体间存在协同致病现象，如停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）分泌的透明质酸酶可降解细胞外基质，促进其他病原菌的深层组织定植^［13］。

近年来，RNA表观遗传学调控在炎症性疾病防控中的作用逐渐为人们所重视，其中N6-甲基腺苷（m6A）修饰作为最丰富的转录后修饰形式，通过动态调控RNA代谢参与炎症信号网络的重编程^［14］。甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase-like 3， METTL3）作为m6A修饰系统的核心催化元件，其功能已在人类疾病模型中取得突破性发现。例如，METTL3通过介导m6A修饰调控细胞自噬，促进成纤维细胞样滑膜细胞的衰老与骨关节炎进展，这为理解其在关节炎症中的分子作用提供了直接证据^［15］。这一发现提示，METTL3可能通过类似的表观遗传学途径参与炎症相关信号通路的调控。此外，临床研究显示，METTL3在肺腺癌组织中的高表达与肿瘤细胞的糖代谢活性（18F-FDG最大标准摄取值）呈正相关^［16］，表明METTL3可能通过调控细胞能量代谢影响炎症微环境。这些发现提示，METTL3可能是连接表观遗传调控与炎症代谢重编程的关键节点，可能在奶牛乳房炎中具有潜在的调控作用。

目前，METTL3基因的表达及功能在奶牛或其他反刍动物中尚鲜见研究报道。因此，本研究拟通过生物信息学分析、炎症模型构建及功能验证试验，探究METTL3在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的表达变化及其对细胞增殖和凋亡的调控作用，为解析奶牛乳房炎的分子调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材　料

奶牛乳腺上皮细胞（bovin mammary epithelial cells， bMECs），由宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室保存，细胞已经过形态与纯度鉴定^［17］。DMEM/F-12培养基（货号 LA1320）购自Hyclone公司；胎牛血清（FBS，货号 S9029）购自BI公司；2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（货号 06366546001）购自北京聚合美生物科技有限公司；PrimeScript RT逆转录试剂盒（货号 RR047Q）和TRIzol试剂（货号9109）均购自Takara公司；X-tremeGENE HP DNA转染试剂（货号 06366546001）购自Sigma-Aldrich公司；CCK-8检测试剂盒（货号C0038）购自上海碧云天生物科技有限公司；METTL3基因siRNA干扰片段由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。多功能酶标仪、普通PCR仪和CFX96 Touch RT-qPCR仪均购自Bio-Rad公司。

1.2 METTL3基因的生物信息学分析

根据GenBank数据库中的METTL3基因序列（GenBank登录号：NM 001102238.2），利用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在线软件预测基因的开放阅读框，并推导其所编码的氨基酸序列；利用在线工具String（https：//cn.string-db.org/）进行METTL3蛋白的分子互作网络分析。

1.3 bMECs炎症模型构建

将液氮中冻存的bMECs取出，立即放入37 ℃水浴锅中轻轻晃动解冻。将解冻后的bMECs无菌操作接种至含有体积分数10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12细胞培养基中，置于37 ℃，体积分数5% CO₂和100%饱和湿度的培养箱中培养。在单层细胞融合达70%时，利用LPS（终质量浓度为50 µg/mL）诱导bMECs，使其产生炎症反应，构建炎症细胞模型。在LPS诱导的第0，3，6，12和24 h时分别收集细胞，用于RNA提取。

1.4 METTL3干扰片段的合成及转染bMECs细胞

合成奶牛METTL3基因的特异性干扰片段（正义链：5′-AGGAGUUGAUCGAAGUAAATT-3′；反义链：5′-UUUACUUCGAUCAACUCCUTT-3′）。细胞转染方法：将生长状态良好且无污染的bMECs接种至6孔细胞培养板中，当单层细胞融合达70%时，配制甲液［si-干扰组（si-METTL3）：5 μL干扰片段＋100 μL OPTI；NC组（si-NC）：5 μL si-NC＋100 μL OPTI］和乙液［3 μL X-tremeGENE HP转染试剂＋100 μL OPTI］；甲液和乙液均静置5 min后等体积混合，混合液静置20 min后加入到bMECs中，每组进行3次重复。转染42 h后，加入LPS诱导bMECs发生炎症反应，转染48 h时收集细胞进行RNA提取。

1.5 RNA提取及逆转录

收集经过处理的bMECs，加入Trizol裂解后经氯仿分层、异丙醇沉淀及体积分数75%乙醇洗涤，最终用RNase-free水溶解。使用多功能酶标仪测定RNA浓度及纯度（OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.8~2.0），1%琼脂糖凝胶电泳验证其完整性。取1 μg RNA，采用PrimeScript RT试剂盒反转录为cDNA。

1.6 相关基因表达水平的实时荧光定量PCR（RT‑qPCR）检测

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因作为内参基因，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测METTL3、炎症相关基因（IL-6、IL-8、IL-1β）、细胞增殖标志基因（CDK2、CDK4、PCNA）和细胞凋亡标志基因（CASP3、CASP9、BAX）mRNA 表达水平，试验所用引物序列见表1。以逆转录得到的cDNA为模版，利用SYBR^® Premix Ex Taq™Ⅱ qPCR试剂盒检测相关基因的表达量。每个样本均进行3个生物学和3个技术重复，利用2^-∆∆Ct 法计算基因的相对表达量。

1.7 细胞活力CCK-8法检测

采用CCK-8法（cell counting kit-8）检测细胞增殖活性。当bMECs细胞融合度达90%时，以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，细胞贴壁后按试验设计进行转染处理。转染48 h后，每孔加入10 μL CCK-8反应液，继续于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱孵育1 h。利用多功能酶标仪测定450 nm波长的吸光度（OD₄₅₀）。每组设3个生物学重复，结果取平均值。

1.8 数据统计分析

试验数据分析采用标准化流程。所有试验均独立重复3次，数据以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示。使用GraphPad Prism 8.3.0软件对所得数据进行独立样本t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 METTL3蛋白质的理化性质、亲疏水性和磷酸化位点分析

通过生物信息学分析发现，METTL3基因的开放阅读框（ORF）长度为1 743 bp，编码一个由580个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白包含一个甲基转移酶结构域（图1）。NetPhos 3.0磷酸化修饰预测结果表明，METTL3蛋白存在59个潜在的翻译后修饰位点，其中包括32个丝氨酸（Ser）、5个苏氨酸（Thr）和22个酪氨酸（Tyr）残基，这些修饰位点主要富集于N端结构域（1~200氨基酸）和甲基转移酶催化核心区（300~400氨基酸），提示磷酸化修饰可能通过构象调节影响METTL3的酶活性和底物的识别能力。上述参数为深入解析METTL3的结构稳定性及生物学功能提供了重要理论依据。

2.2 METTL3蛋白质分子互作网络分析

利用STRING数据库（v11.5，置信度>0.7）构建METTL3蛋白质的互作网络，结果显示，METTL3作为核心节点，可能与m6A甲基化复合体组分METTL14、去甲基化酶ALKBH5及m6A阅读蛋白YTHDF1等蛋白质形成功能模块（图2）。值得注意的是，该网络还包含锌指CCCH型结构域蛋白13（ZC3H13），该蛋白可调控m6A甲基转移酶复合物的核定位，影响RNA修饰，可能在炎症反应和免疫调控中起重要作用。以上结果提示，METTL3可能通过表观转录调控参与细胞炎症反应进程。

2.3 炎症模型的建立以及METTL3在炎症模型中的表达模式

为了验证LPS诱导的bMECs炎症模型的可靠性，采用RT-qPCR技术检测LPS诱导不同时间bMECs的炎症因子IL‑6和IL‑8的mRNA表达水平。结果显示，与0 h相比，炎症因子IL‑6和IL‑8在LPS诱导后3，6，12和24 h的表达量均极显著上调（P<0.01）（图3-A，B），表明成功构建了bMECs炎症模型。通过RT-qPCR检测METTL3在炎症细胞模型中的时序表达，结果显示，与对照组（0 h）相比，METTL3在LPS诱导3，6，12和24 h时的mRNA表达量均极显著上调（P<0.01），其中6 h表达量最高，为对照组的4.85倍（图3-C），呈现炎症早期响应特征。由于METTL3在LPS诱导6 h时的表达量最高，后续试验LPS诱导时间定为6 h。上述结果表明，METTL3可能在bMECs炎症反应中具有潜在的调控作用。

2.4 干扰METTL3对LPS诱导bMECs炎症因子表达的影响

干扰METTL3对LPS诱导bMECs炎症因子表达的影响结果见图4。

由图4可知，si-METTL3干扰组bMECs中METTL3的表达量较si-NC对照组极显著降低（P<0.01），为对照组的26%，表明通过瞬时转染si-METTL3可使bMECs内的METTL3受到抑制，基因干扰效率良好，说明该细胞转染体系和条件可用于后续的试验。通过qPCR检测干扰METTL3后炎症因子IL‑6、IL‑8和IL‑1β mRNA的表达水平。结果显示，si-METTL3干扰组中炎症因子IL‑6和IL‑8 mRNA的表达量较si-NC对照组分别极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）下降，为对照组的56%和77%；IL‑1β mRNA有下降趋势，但差异不显著（P>0.05）（图4）。上述结果表明，干扰METTL3可抑制bMECs中炎症因子的表达，从而缓解bMECs炎症反应，提示METTL3可促进LPS诱导的bMECs炎症反应。

2.5 干扰METTL3对LPS诱导的bMECs细胞增殖和活力的影响

为探究干扰METTL3对LPS诱导的bMECs的细胞增殖和活力的影响，本研究通过RT-qPCR检测干扰METTL3后细胞增殖标志基因CDK2、CDK4和PCNA mRNA的表达水平，并采用CCK-8试验检测细胞活力。结果（图5）表明，干扰组si-METTL3中细胞增殖标志基因CDK2、CDK4和PCNA mRNA的表达量较si-NC对照组极显著升高，分别为对照的2.39倍、1.51倍和1.88倍（P<0.01）。干扰组si-METTL3中细胞活力（OD₄₅₀为0.657）较对照组（OD₄₅₀为0.566）显著增加，是对照的1.16倍（P<0.05）。上述试验结果表明，干扰METTL3可促进bMECs的增殖，提高bMECs细胞活力。

2.6 干扰METTL3对LPS诱导的bMECs凋亡的影响

为探究干扰METTL3对LPS诱导的bMECs细胞凋亡的影响，本研究利用RT-qPCR技术检测了干扰METTL3后细胞凋亡标志基因CASP3、CASP9和BAX mRNA的表达水平，结果显示，干扰组si-METTL3中细胞凋亡标志基因CASP3、CASP9和BAX mRNA的表达量较si-NC对照组均极显著下调（P<0.01），分别为对照组的51%，60%和38%（图6）。结果表明，干扰METTL3可抑制LPS诱导炎症的bMECs细胞凋亡，从而缓解bMECs的炎症反应。

3 讨 论

奶牛乳房炎是奶牛乳腺组织受物理损伤、细菌感染和化学刺激后产生的炎症性疾病，是奶产业中最为流行和常见的炎症性疾病，是制约奶业发展的主要原因之一^［18-19］。奶牛乳房炎病理机制不仅涉及病原体侵袭，更与宿主免疫调控网络的多层次交互作用密切相关^［20-22］。在病原体侵入奶牛乳腺组织后，乳腺上皮细胞和免疫细胞通过模式识别受体（如Toll样受体）感知外来病原，并迅速激活相关信号通路，启动宿主防御机制^［23-25］。然而，这种防御机制在早期有助于控制感染，但若失控或过度活化，则会导致炎症反应过度，进而加剧奶牛乳腺组织损伤和功能障碍^［9，26］。因此，挖掘和阐明基因在奶牛乳腺炎症中的调控作用，对于奶牛乳房炎抗病分子育种尤为重要。

本研究结果表明，METTL3是LPS诱导炎症的早期响应因子（表达峰值为6 h，早于炎症因子峰值24 h以上），其通过影响炎症反应、细胞增殖、细胞凋亡这3个关键过程，深度参与乳腺炎病理进程。生物信息学分析提示，METTL3可能通过磷酸化修饰发挥动态调控功能，其59个潜在磷酸化位点（Ser 32/Thr 5）的发现提示，当TLR4识别LPS激活下游激酶级联时，METTL3可能通过磷酸化修饰实现酶活性的动态调节，这种翻译后修饰机制使其成为连接病原识别与表观转录调控的关键分子节点。在分子作用方面，本研究通过RNAi试验发现，METTL3是一个促炎因子，可通过促进IL-6、IL-8及IL-1β等主要炎症因子的表达加剧炎症反应，这与HAN等^［27］的研究结果相似。值得注意的是，这种调控可能具有双重机制：一方面METTL3通过m6A修饰直接增强炎症因子mRNA稳定性^［28］，另一方面通过修饰炎症通路关键分子（如TRAF6/MyD88）的mRNA间接放大NF-κB信号^［29］。IL-6作为急性期炎症反应的核心介质^［30］，其受METTL3调控的机制为理解乳腺菌群失调与炎症持续化提供了新的表观遗传视角，提示致病菌可能通过激活METTL3而促进炎性反应。

在细胞增殖调控方面，本研究发现干扰METTL3可使CDK2、CDK4和PCNA的表达量显著上调，表明METTL3具有抑制细胞周期进程的作用。CDK2作为DNA损伤修复的关键启动因子^［31-32］，其表达升高暗示METTL3敲低可能通过维持基因组稳定性增强组织修复能力。在凋亡调控方面，本试验发现干扰METTL3可使BAX、CASP3和CASP9的表达下调，表明METTL3在线粒体凋亡通路中发挥重要作用。有文献报道，METTL3通过调控促凋亡基因表达诱导线粒体膜电位崩溃，而干扰该基因则可有效阻断Caspase激活级联反应，该机制对炎症压力下上皮屏障完整性的维持具有重要的生理意义^［33-34］。这种既调控免疫应答又决定细胞存活的特性，使METTL3成为乳腺炎进程中连接组织损伤与修复的分子节点。

综上，METTL3通过调控LPS诱导的bMECs炎症反应，在奶牛乳腺炎发生发展中发挥着重要作用。本研究表明，METTL3是奶牛乳房炎中潜在的干预靶点，这为深入理解奶牛乳腺炎的分子调控机制提供了新的依据，并为奶牛抗乳房炎的分子育种提供了理论基础。但是，METTL3的分子调控机制还有待于进一步研究，

4 结 论

METTL3表达在LPS诱导的bMECs炎症中显著上调，干扰METTL3可以抑制促炎因子IL-6、IL-8和IL-1β表达，同时下调凋亡基因BAX、CASP3和CASP9的表达，并促进增殖基因CDK2、CDK4和PCNA表达及细胞活力，最终实现对bMECs炎症损伤的缓解，结果提示METTL3可能是缓解奶牛乳房炎的分子靶点。本研究结果为解析奶牛乳房炎的分子调控网络奠定了基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32460826)

国家现代农业产业技术体系项目(CARS-36)

宁夏自然科学基金项目(2024AAC03116)