鸡ELAVL1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要

【目的】建立鸡胚胎致死异常视觉蛋白1基因（ELAVL1）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，为研究鸡ELAVL1基因在肿瘤性疾病发生发展中的作用提供技术支持。【方法】根据鸡ELAVL1基因序列设计特异性荧光定量PCR引物，以pMD19-T-ELAVL1质粒为模板，优化引物浓度和退火温度，进行实时荧光定量PCR扩增，建立鸡ELAVL1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。以pMD19-T-ELAVL1质粒为标准品，进行实时荧光定量PCR扩增，建立标准曲线，检测该方法的特异性、敏感性和重复性。应用该方法检测鸡ELAVL1基因在不同组织中的转录水平及其在鸡淋巴瘤细胞MSB1、鸡成纤维细胞DT40、鸡肝癌细胞LMH和鸡成纤维细胞DF1中的差异表达情况。【结果】鸡ELAVL1基因实时荧光定量PCR检测方法最佳引物浓度为0.2μmol/L，最佳退火温度为60℃；建立的标准曲线循环阈值（Ct）与模板浓度（1.1×10～3～1.1×10～8拷贝/μL）有良好的线性关系（R²=0.993），扩增效率为109.7%。建立的鸡ELAVL1基因实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性；对重组质粒的检测下限为1.1×10～1拷贝/μL，灵敏度是普通PCR的100倍；批内和批间变异系数分别为0.44%～1.92%和0.32%～0.57%，重复性良好。ELAVL1基因在鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺和法氏囊中均有表达，在脾脏中表达水平最高，在肺脏中表达水平最低；在鸡淋巴瘤细胞MSB1、鸡成纤维细胞DT40和鸡肝癌细胞LMH中的表达量显著或极显著高于鸡成纤维细胞DF-1。【结论】建立了鸡ELAVL1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，该方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。

关键词

鸡 / ELAVL1基因 / SYBR GreenⅠ / 实时荧光定量PCR