布鲁氏菌对不同免疫状态小鼠CD4⁺ T细胞基因表达的影响

Effects of Brucella melitensis on gene expression in CD4⁺ T cells of mice with different immune statuses

摘要

目的 揭示不同免疫状态下感染布鲁氏菌（布菌）对小鼠CD4⁺ T细胞基因表达的影响。 方法 将小鼠随机分为对照组（CK）、布菌M5^+gfp组（M5^+gfp组）、环磷酰胺免疫抑制组（CYP组）、CYP+布菌M5^+gfp组（CYP+M5^+gfp组），测定小鼠脾组织相对质量、载菌量，HE染色评估脾脏病理变化；测定半数溶血值以及IFN-γ含量，综合评价模型小鼠机体免疫状态。对4种模型小鼠的CD4⁺ T细胞进行转录组测序，对其差异表达基因进行KEGG分析。选取差异基因Klf4、Elane、Fosb、Fcgr1、Chtf18、Gadd45g进行RT-qPCR验证。 结果 ① M5^+gfp组小鼠脾组织相对质量显著高于CK组（P<0.05），CYP+M5^+gfp组极显著高于CYP组（P<0.01）。CYP+M5^+gfp组载菌量极显著高于M5^+gfp组（P<0.01）。M5^+gfp组和CYP+M5^+gfp组脾组织细菌PCR均扩增出1 000 bp的GFP片段，证实侵染脾组织的菌种为布菌M5^+gfp菌株。HE染色结果显示，M5^+gfp组和CYP+M5^+gfp组脾脏均呈现红白髓分界不清、脾结节减少及淋巴细胞稀疏等病理变化，其中CYP+M5^+gfp组病变程度更重。半数溶血值测定结果显示，M5^+gfp组低于CK组，CYP+M5^+gfp组低于CYP组，但差异均不显著（P>0.05）。IFN-γ含量测定结果显示，M5^+gfp组显著高于CK组（P<0.05），CYP+M5^+gfp组极显著高于CYP组（P<0.01）。② M5^+gfp组较CK组CD4⁺ T细胞上调基因富集于抗原加工和呈递、NOD样受体信号通路，可增强机体对布菌的清除能力；下调基因富集于自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路，可导致NK细胞功能受损，削弱机体抗布菌能力。CYP+M5^+gfp组较CYP组CD4⁺ T细胞上调基因富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、中性粒细胞胞外陷阱形成及造血细胞谱系通路，可协同强化机体免疫能力；下调基因富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路，可导致免疫信号受到干扰。筛选出M5^+gfp 组较CK组和CYP+M5^+gfp组较CYP组均上调的共有基因56个，其中Clca3a1、Trbv19、Gbp2b、Klf1、Serpina3f、Trbv17在M5^+gfp组和CYP+M5^+gfp组小鼠中表达量较高。Klf4、Elane、Fosb、Fcgr1、Chtf18、Gadd45g基因表达水平转录组测序结果与RT-qPCR验证结果吻合，证实转录组测序数据是可靠的。 结论 布菌感染期间，小鼠CD4⁺ T细胞基因表达模式发生了改变；筛选出56个不同免疫状态下均上调的核心基因。

Abstract

Objective This research aims to elucidate the effects of Brucella melitensis infection on CD4⁺ T cell gene expression in mice under different immune statuses. Method Mice were randomly divided into the control group （CK group），Brucella melitensis M5^+gfp group （M5^+gfp group），cyclophosphamide immunosuppression group （CYP group）， and CYP+Brucella melitensis M5^+gfp group （CYP+M5^+gfp group）.Relative mass and bacterial load of mouse spleen tissue were determined，and HE staining was used to assess the pathological changes in the spleen tissue.The half-hemolytic complement activity （CH₅₀） and IFN-γ levels were determined to comprehensively evaluate the immune status of the model mice.Transcriptome sequencing analysis was performed on CD4⁺ T cells from the four groups，and KEGG analysis was performed on differentially expressed genes. The differentially expressed genes Klf4、Elane、Fosb、Fcgr1、Chtf18 and Gadd45g were selected for RT-qPCR validation. Result ① The relative mass of spleen tissue in the M5^+gfp group was significantly higher than that in the CK group （P<0.05），and that in the CYP+ M5^+gfp group was significantly higher than that in the CYP group （P<0.01）.The bacterial load in the CYP+M5^+gfp group was extremely significantly higher than that in the M5^+gfp group （P<0.01）.1 000 bp GFP fragments amplified in bacterial PCR of spleen tissues were obtained both in the M5^+gfp and CYP+M5^+gfpgroups，confirming that the bacterial strain infecting the spleen tissue was the M5^+gfp strain of Brucella melitensis.HE staining results showed that pathological changes such as unclear red-white marrow demarcation，reduced spleen nodules，and sparse lymphocytes were observed in both the M5^+gfp group and the CYP+M5^+gfp group，with the lesions being more severe in the CYP+ M5^+gfp group.The half-hemolytic complement activity measurement results showed that the half value of hemolysin in the M5^+gfp group was lower than that in the CK group，and that in the CYP+M5^+gfp group was lower than that in the CYP group，but the differences were not significant （P>0.05）.IFN-γ level in the M5^+gfp group were significantly higher than that in the CK group （P<0.05），and that in the CYP+M5^+gfp group was extremely significantly higher than that in the CYP group （P<0.01）.② Compared with the CK group， the up-regulated genes of CD4⁺ T cells in the M5^+gfp group were enriched in antigen processing and presentation and NOD-like receptor signaling pathways，enhancing the host’s clearance of Brucella melitensis.The down-regulated genes were enriched in the natural killer cell-mediated cytotoxic pathway， which impaired NK cell function and weakened the antibacterial ability against Brucella melitensis.Compared with the CYP group，the up-regulated genes of CD4⁺ T cells in the CYP+M5^+gfp group were enriched in cytokine-cytokine receptor interaction，neutrophil extracellular traps，and hematopoietic cell lineage，synergistically enhancing the host’s immune capa-city.The down-regulated genes were enriched in the cytokine-cytokine receptor interaction pathway，which led to interference with immune signaling.A total of 56 genes were identified that were upregulated in both the M5^+gfp group compared to the CK group and the CYP+M5^+gfp group compared to the CYP group.Among them，Clca3a1、Trbv19、Gbp2b、Klf1、Serpina3f and Trbv17 exhibited higher expression levels in the M5^+gfp and CYP+M5^+gfp model mice.In addition，the transcriptomic sequencing data of Klf4、Elane、Fosb、Fcgr1、Chtf18 and Gadd45g genes were consistent with the RT-qPCR validation results，confirming the reliability of the transcriptomic sequencing data. Conclusion During Brucella melitensis infection，the gene expression patterns of CD4⁺ T cells in mice changed，and ultimately 56 core genes that were upregulated under different immune conditions were selected.

Graphical abstract

关键词

布鲁氏菌 / CD4⁺ T细胞 / 免疫抑制 / 转录组测序 / 差异表达基因

Key words

Brucella melitensis / CD4⁺ T cells / immunosuppression / transcriptome sequencing / differentially expressed gene

布鲁氏菌病（布病）是人类和动物感染布鲁氏菌（布菌）后引起的一种严重传染病，人类接触患病动物或受污染的动物产品后会引发布病^［1-2］。布病作为全球范围内重要的人兽共患病，其致病机制在免疫正常宿主中已有部分解析，然而免疫抑制人群感染布菌后病情进展迅速且治疗效果差，提示机体免疫防御能力的减弱可能触发布菌独特的致病模式。布菌是一种胞内细菌，能够激活免疫系统，促进CD4⁺和CD8⁺ T细胞的分化^［3］。在机体抵抗布菌感染的过程中，CD4⁺ T细胞发挥多种功能，包括辅助B细胞产生抗体、激活巨噬细胞杀灭胞内细菌以及直接的细胞毒性作用^［4］，因此研究CD4⁺ T细胞基因表达在此过程中的变化对于探讨布菌致病分子机制和药物作用机制具有重要意义。CD4⁺ T细胞作为适应性免疫的核心协调者，通过协调多种免疫细胞的功能，参与对抗病原体、肿瘤以及自身免疫性疾病^［5］。CD4⁺ T细胞活化的关键起始步骤是其表面的T细胞受体特异性识别由抗原递呈细胞加工处理并与主要组织相容性复合体Ⅱ类分子（major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC Ⅱ）结合的抗原肽^［6-7］。抗原肽也称免疫多肽，是抗原蛋白质被抗原递呈细胞（antigen-presenting cell，APC）加工处理后产生的短肽片段，其与MHCⅡ分子的结合是触发CD4⁺ T细胞活化并决定免疫应答性质和强度的基础^［8］。2016年，MOMMEN等^［9］从人类骨髓单核细胞白血病细胞系中鉴定出了近14 000种可与3种人类MHC（HLA-DR异构体蛋白分子）结合的抗原肽，极大地拓展了人们对T细胞表位库的认识。

环磷酰胺（cyclophosphamide，CYP）是一种细胞毒性药物，能够杀死有丝分裂以及进入循环周期的细胞，并对免疫相关的细胞产生强烈的抑制作用，因此被广泛用于建立实验性免疫抑制模型^［10-11］。转录组学分析技术已被广泛应用于炎症和自身免疫疾病的研究，转录组学分析可以揭示免疫细胞在炎症组织中的变化，探索免疫系统的异常激活机制，在感染和疫苗研究中有重要应用。前人对布菌MHC Ⅱ-免疫多肽组的筛选及鉴定已有报道^［12］，但对布菌侵染小鼠后其脾组织中与布菌MHC Ⅱ-免疫多肽组相结合的细胞转录组测序研究报道较少，并且传统研究多聚焦于单一感染模型，忽略了免疫抑制背景下细菌-宿主互作的特异性。本研究探讨正常小鼠和免疫抑制小鼠感染布菌对机体CD4⁺ T细胞基因表达的影响，以期揭示布病免疫调控的核心靶点。

1 材料与方法

1.1 材　料

SPF级KM小鼠160只（体质量约33 g/只），由新疆医科大学提供；布菌M5^+gfp菌株，由本项目组构建^［13］。RPMI 1640培养液，购自美国Sigma公司；TSA和TSB培养基、CYP、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、红细胞裂解液，均购自美国GIBCO公司。

布菌M5^+gfp菌株注射液：将布菌M5^+gfp在含有氯霉素的TSA培养基中于37 ℃下培养72 h后，挑取表面光滑的单个菌落，将其接种到含氯霉素的TSB培养基中，在37 °C下200 r/min振荡培养72 h，然后使用麦士比浊管将菌液的密度调整为5×10⁶ CFU/mL，备用。

CYP注射液：取CYP粉末，用生理盐水溶解配制成13.35 μg/μL的CYP溶液，-20 ℃避光保存，备用。

1.2 试验设计

将160只小鼠适应性饲养7 d后，随机分为对照组（CK组）、布菌M5^+gfp组（M5^+gfp组）、环磷酰胺免疫抑制组（CYP组）、CYP+布菌M5^+gfp组（CYP+M5^+gfp组），每组40只。CK组小鼠连续6 d每日腹腔注射生理盐水200 μL/只；M5^+gfp组小鼠第1~3和5~6腹腔注射生理盐水200 μL/只，第4天腹腔注射上述M5^+gfp注射液200 μL/只；CYP组小鼠连续3 d腹腔注射CYP注射液200 μL/只（CYP剂量约为80 mg/kg），第4~6天腹腔注射生理盐水200 μL/只；CYP+M5^+gfp组小鼠连续3天腹腔注射CYP注射液200 μL/只（CYP剂量约为80 mg/kg），第4天腹腔注射上述M5^+gfp注射液200 μL/只，第5和6天腹腔注射生理盐水200 μL/只。各组小鼠第7天进行试验。

1.3 试验小鼠的免疫功能评估

1.3.1 脾相对质量测定

从每组小鼠中随机选取3只处死，称体质量（m₁），无菌采集脾脏并称质量（m₂），计算脾脏相对质量（脾脏相对质量=m₂/m₁）。

1.3.2 脾脏载菌量检测

从M5^+gfp组、CYP+M5^+gfp组各随机选取3只小鼠处死，无菌采集脾脏并称质量，随后将脾脏转移至无菌研磨器中，加入1 mL无菌生理盐水充分研磨成匀浆，取100 μL匀浆液进行10倍稀释，取100 μL稀释后的匀浆液均匀涂布于含氨苄青霉素的TSA培养基上，将平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h，培养结束后进行计数，计算脾脏载菌量。脾脏载菌量（CFU/g）＝（A×N×V₁）/（V₂×m），其中，A为平板平均菌落数，N为稀释倍数，V₁为脾脏匀浆液总体积（mL），V₂为脾脏匀浆液涂布体积（mL），m为脾脏质量。

1.3.3 脾组织细菌PCR鉴定

采用布菌M5^+gfp菌株，基于GFP基因特有的PMC-221序列，用Primer 5.0软件设计特异性引物，上游引物M13-F序列为5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，下游引物M13-R序列为5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′。对1.3.2节组织培养获得的单菌落样本进行PCR扩增，反应体系为：模板2 μL，上游引物0.3 μL，下游引物0.3 μL，PCR mix 10 μL，ddH₂O 7.4 μL。反应程序为：94 ℃ 1 min；94 ℃ 0.5 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。利用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，观察1 000 bp位置是否有特异性条带出现，若检测到该条带即可确认所培养的组织细菌为布菌M5^+gfp。

1.3.4 脾组织结构检测

从每组小鼠中随机选取3只处死，无菌取脾组织，常规方法制备石蜡切片（厚度为4 μm），HE染色后，光学显微镜下观察脾组织结构。

1.3.5 半数溶血值的测定

从每组中随机选取3只小鼠，腹腔注射绵羊红细胞（sheep red blood cells，SRBC）免疫，4 d后进行眼眶静脉采血，收集血清。设置样品孔与空白对照孔，样品孔加50 μL经SA缓冲液300倍稀释后的血清，空白对照孔加50 μL SA缓冲液；样品孔与空白对照孔均依次加入10%（体积分数）SRBC 25 μL和补体50 μL（SA溶液1∶8倍稀释），37 ℃孵育30 min后冰浴终止反应，1 500 r/min离心10 min；取上清液50 μL转移至新96孔板，加入都氏试剂150 μL。另设半数溶血孔：加入10% （体积分数） SRBC 12.5 μL，以都氏试剂定容至200 μL，振荡混匀后静置10 min，540 nm 波长处测各管吸光度（OD₄₅₀），计算半数溶血值（HC₅₀）：HC₅₀=（样品OD₄₅₀/SRBC半数溶血时的OD₄₅₀）×稀释倍数。

1.3.6 IFN-γ含量测定

从每组中随机选取3只小鼠进行眼眶静脉采血，样品静置1~2 h后3 000 r/min离心10 min，收集血清。采用江苏晶美小鼠干扰素 γ 检测试剂盒测定血清中的IFN-γ含量。

1.4 CD4⁺ T 细胞转录组测序与差异表达基因分析

4组试验小鼠分别随机处死18只，每组设置3个平行组，每个平行组6只小鼠，无菌采集脾脏组织。按照BeaverBeads 小鼠CD4⁺ T细胞分选试剂盒（阴选）分选小鼠CD4⁺ T细胞，随后提取各样本总RNA。利用Illumina平台对4组小鼠CD4⁺ T 细胞进行双末端转录组测序，过滤得有效读段（clean reads）后比对小鼠参考基因组，组装转录本，以DESeq2筛选差异基因（CPM值表征），再用clusterProfiler进行KEGG富集分析。

1.5 CD4⁺ T细胞差异表达基因验证

提取4组小鼠组织样品的总 RNA，并将其质量浓度调整为200 ng/μL进行反转录。选择前期基于转录组表达量筛选的6个候选目标基因Fcgr1、Chtf18、Elane、Gadd45g、Klf4、Fosb，以β‑actin为内参基因进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证。根据各基因的编码序列信息，利用Primer Premier 5软件设计引物，引物信息见表1。RT-qPCR按照TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix荧光定量PCR试剂盒使用说明进行试验操作，反应体系为：Template 2 μL，Forward primer 0.4 μL，Reverse promer 0.4 μL，Passive Rererence Dye（50×） 0.4 μL，Nuclease-free Water 6.8 μL，SuperMix 10 μL。反应程序为：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环。采用2^-ΔΔCt 法计算各基因相对表达量。

1.6 数据统计分析

试验数据使用Excell软件进行基本统计处理，结果用SPSS 26.0 软件进行方差分析和显著性检验并制图。转录组测序数据使用Excell软件进行基本统计处理，使用森恩艾斯科技在线云平台进行制图。

2 结果与分析

2.1 模型小鼠的免疫功能评估

2.1.1 脾脏相对质量测定

脾相对质量检测结果（图1）显示，M5^+gfp组显著高于CK组（P<0.05），表明小鼠在感染布菌后脾组织发生了炎症反应，导致其质量增加，这可能是脾充血、水肿和增生等多种因素造成的。CYP+M5^+gfp组小鼠脾脏相对质量极显著高于CYP组（P<0.01），表明小鼠在免疫抑制状态下感染布菌后，脾组织发生了更为明显的炎症反应与增生。

2.1.2 脾组织载菌量检测

脾组织载菌量检测结果显示，CYP+M5^+gfp组脾组织载菌量（（56 333.33±8 604.90）CFU/g）极显著高于M5^+gfp组（（133 725.67±7 386.46） CFU/g），表明小鼠在免疫抑制状态下布菌的侵染数量极显著增高。

2.1.3 脾组织细菌PCR鉴定

脾组织细菌PCR鉴定结果（图2）显示，M5^+gfp和CYP+M5^+gfp组均扩增出1 000 bp的GFP片段，证明侵染脾组织菌种为布菌M5^+gfp菌株。

2.1.4 脾组织HE染色

脾组织HE染色结果（图3）显示，CK组脾结构清晰，淋巴滤泡密集，红髓与白髓分界明显，白髓面积大，动脉周围淋巴鞘及脾小结正常；其他试验组均呈现白髓模糊且面积缩小、红白髓分界不清、脾小结锐减、红细胞脱落、淋巴细胞稀疏且数量减少、脾索变窄等病理改变，其中CYP+M5^+gfp组病变程度最重。

2.1.5 半数溶血值测定

由图4可知，M5^+gfp组半数溶血值低于CK组，CYP+M5^+gfp组半数溶血值低于CYP组，但差异均不显著（P>0.05），原因可能与机体对抗布菌感染更依赖细胞免疫而非体液免疫的特性有关，或因感染早期体液免疫尚未充分激活。

2.1.6 IFN-γ测定结果

由图5可知，M5^+gfp组IFN-γ含量显著高于CK组（P<0.05），CYP+M5^+gfp组IFN-γ含量极显著高于CYP组（P<0.01）。结果表明，布菌感染触发了强烈的Th1型免疫反应，IFN-γ作为关键细胞因子被大量分泌。

2.2 CD4⁺ T细胞转录组测序分析

2.2.1 测序原始数据及质控数据统计

测序数据如表2所示。由表2可知，试验各组的Q20质量值碱基数≥4.90 G，Q30质量值碱基数≥4.76 G，表明GC含量以及碱基质量分布较为良好，测序数据可以用于后续分析。

2.2.2 测序数据与参考基因组的比对

将经过过滤的测序数据与参考基因组进行比对分析，结果（表3）显示，各样本组中成功映射到基因组的测序序列占比均不低于91.59%。该结果表明，转录组测序数据的质量可以满足后续分析要求。

2.3 CD4⁺ T细胞差异表达基因分析

2.3.1 差异表达基因筛选

对CYP+M5^+gfp组与CYP组进行比较，筛选出了2 866个上调基因和391个下调基因。对M5^+gfp组与CK组进行比较，筛选出了166个上调基因和273个下调基因。

2.3.2 M5^+gfp组较CK组差异表达基因KEGG富集分析

如图6-A所示，M5^+gfp组较CK组小鼠脾组织CD4⁺ T细胞中上调基因显著富集在抗原加工和呈递、NOD样受体信号通路等免疫相关通路。如图6-B所示，M5^+gfp 组较CK组小鼠脾组织CD4⁺ T细胞中下调基因显著富集在自然杀伤细胞介导的细胞毒性免疫相关通路。

2.3.3 CYP+M5^+gfp组较CYP组差异表达基因KEGG富集分析

如图7-A所示，CYP+M5^+gfp组较CYP组小鼠脾组织CD4⁺T细胞中上调基因显著富集在造血细胞谱系、细胞因子-细胞因子受体相互作用和中性粒细胞胞外陷阱形成等免疫相关通路。如图7-B所示，CYP+M5^+gfp组较CYP组小鼠脾组织CD4⁺T细胞中下调基因显著富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用等与免疫相关的通路。

2.3.4 共有差异表达基因分析

对M5^+gfp组与CK组和CYP+M5^+gfp组与CYP组共有差异基因进行分析，筛选出共有差异基因182个。对筛选出来的182个共有差异基因进行进一步分析，筛选出M5^+gfp 组较CK组和 CYP+M5^+gfp 组较CYP组均上调的共有基因56个（图8），均下调的共有基因18个（图9）。从图8可知，在共同上调的基因中，Clca3a1、Trbv19、Gbp2b、Klf1、Serpina3f、Trbv17在M5^+gfp组和CYP+M5^+gfp组小鼠中表达量较高。

2.4 CD4⁺ T细胞差异表达基因的RT-qPCR验证

在M5^+gfp组与CK组比较中，Klf4、Elane、Fosb基因表达水平转录组测序结果与RT-qPCR验证结果一致（图10）；在CYP+M5^+gfp组与CYP组比较中，Fcgr1、Chtf18、Gadd45g基因表达水平转录组测序结果与RT-qPCR验证结果吻合（图11）。上述结果表明，转录组测序数据是可靠的。

3 讨 论

本研究通过构建CK、M5^+gfp、CYP及CYP+M5^+gfp 4组模型，探究布鲁氏菌感染对正常及免疫抑制小鼠CD4⁺ T细胞基因表达的影响。试验结果显示，M5^+gfp和CYP+M5^+gfp组小鼠脾相对质量显著或极显著增加，提示感染诱导脾炎症增生，免疫抑制加剧了此反应，与GÓMEZ等^［14］的研究结果一致；脾载菌量CYP+M5^+gfp组极显著高于M5^+gfp组（P<0.01），与KALLEDA等^［15］研究得出的CYP通过抑制CD4⁺ T细胞功能削弱Th1型免疫，促进细菌增殖的结论相吻合；脾组织细菌PCR证实，感染菌株确为布菌M5^+gfp［13］；M5^+gfp和CYP+M5^+gfp组小鼠脾组织结构受到损伤，其中CYP+M5^+gfp组病变更重，表明免疫抑制加剧了脾组织损伤，此结果与DENG等^［16］的研究结果吻合；感染M5^+gfp小鼠脾脏IFN-γ水平显著或极显著升高，表明布菌感染激活了Th1核心因子IFN-γ，与XU等^［17］的研究结果一致；半数溶血值（HC₅₀）在M5^+gfp及CYP+M5^+gfp组中无显著变化，表明感染以细胞免疫主导。上述结果证实，模型构建成功。

M5^+gfp 组较CK组小鼠CD4⁺ T细胞差异表达基因KEGG富集分析结果显示，上调基因显著富集于抗原加工和呈递通路、NOD样受体信号通路。抗原加工和呈递通路通过增强抗原呈递能力激活特异性免疫反应，从而增强机体清除病原体的能力^［18］；NOD样受体信号通路通过识别PAMPs/DAMPs模式分子而激活炎症反应和免疫防御应答^［19］。M5^+gfp组较CK组下调基因显著富集于自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路，该通路抑制可导致NK细胞功能受损，削弱宿主对布菌的清除能力^［20］。CYP+M5^+gfp 较 CYP组CD4⁺ T细胞差异表达基因KEGG富集分析结果显示，上调基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、中性粒细胞胞外陷阱形成通路和造血细胞谱系通路。细胞因子-细胞因子受体相互作用通路通过激活细胞因子网络而促进免疫细胞间协作，以增强免疫应答^［21］；中性粒细胞胞外陷阱是中性粒细胞释放的网状结构，用于捕获和杀死病原体，该通路的显著上调表明机体中性粒细胞被激活，从而增强机体的抗感染免疫能力^［22］；造血细胞谱系通路可激活造血系统，促进血细胞产生，从而强化免疫应答^［23］。CYP+M5^+gfp 较CYP组CD4⁺ T细胞下调基因显著富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路，其信号失调可能意味着免疫细胞之间的通讯受到干扰，导致免疫应答失调，在布菌侵袭过程中，这种失调可能导致机体对布菌的清除能力下降，增加感染的风险^［24］。

本研究筛选出M5^+gfp组较 CK组、CYP+M5^+gfp组较 M5^+gfp组共有的182个差异基因，这些基因可能是CD4⁺T细胞抗布菌感染的核心基因群。进一步筛选出56个稳定上调的基因，其中Klf1、Trbv17、Gbp2b、Clca3a1、Trbv19、Serpina3f表达量较高。Klf1是一种锌指蛋白转录因子，参与红细胞生成和心脏损伤修复，在布菌感染中，其可能通过调控炎症反应和免疫细胞分化来影响宿主的免疫应答，具体来说，Klf1可能通过促进Th1细胞中IFN-γ的表达来增强巨噬细胞的杀菌能力^［25］。Trbv17、Trbv19可能参与抗原特异性T细胞应答，发挥重要的免疫保护作用^［26］。Gbp2b编码产物是一种GTP酶，可能通过破坏布菌的吞噬小体膜结构来促进溶酶体融合，从而帮助宿主清除布菌^［27］。Clca3a1介导的氯离子通道激活可能改变吞噬小体pH值，抑制布菌在细胞内生存^［28］。Serpina3f编码产物是丝氨酸蛋白酶抑制剂，其可抑制组织蛋白酶G等炎性蛋白酶，减轻炎症损伤，维持组织完整性，从而有利于宿主对抗感染^［29］。这些基因涉及抗原识别、抗菌作用及免疫调节，推测其构成CD4⁺T细胞清除布菌的关键执行网络。

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基金资助

国家重点基础研究发展计划项目(2010CB530200)