基于RNA⁃seq的绵羊肌苷酸代谢相关基因筛选

Screening of IMP metabolism⁃related genes in sheep based on RNA⁃seq

摘要

目的 解析绵羊肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）代谢相关基因及通路，为绵羊肉品质相关的IMP调控研究提供参考。 方法 以杜泊羊、滩羊、小尾寒羊为研究对象，采集其背最长肌样品，测定其IMP和胆固醇的含量。构建羊cDNA文库，进行转录组测序，筛选差异表达mRNAs（DE mRNAs）和差异表达lncRNAs（DE lncRNAs），预测DE lncRNAs的靶基因，对DE mRNAs和DE lncRNAs的靶基因进行GO和KEGG富集分析。对DE mRNAs与DE lncRNAs进行互作分析。采用RT-qPCR方法检测相关DE mRNAs和DE lncRNAs的转录水平，以验证测序数据的可靠性。 结果 3个绵羊品种背最长肌胆固醇含量差异不显著；杜泊羊 IMP含量显著低于滩羊和小尾寒羊（P<0.05），后二者间无显著差异。在杜泊羊与滩羊、杜泊羊与小尾寒羊的比较中选出差异表达mRNA和lncRNA，两组取交集后获得232个DE mRNAs和278个DE lncRNAs。GO富集分析结果显示，DE mRNAs显著富集于92个功能条目，其中包括半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性等；KEGG分析结果表明，DE mRNAs参与159条通路，其中包括色氨酸代谢、TNF信号通路和亚油酸代谢等可能与IMP代谢相关的通路。对DE lncRNAs的靶基因进行预测，共得到1 657个靶基因（803个反式靶基因、854个顺式靶基因）。DE lncRNA反式和顺式靶基因分别显著富集于129和137个GO条目，其中包括rRNA加工、核糖体生物合成和细胞内信号转导等，并且分别富集到228和226条KEGG通路，其中包括RIG-I样受体信号通路、MAPK信号通路、催乳素信号通路等。这些信号通路和生物学过程涉及多个与肌肉发育和IMP代谢密切相关的基因。对6个DE mRNAs和6个DE lncRNAs进行RT-qPCR验证，结果与转录组测序结果一致，表明转录组测序结果是可靠的。 结论 试验揭示了绵羊背最长肌的DE mRNAs和DE lncRNAs及相关信号通路，筛选了部分基因（IGFBP7、CRB1、NRG4等）及lncRNA（TCONS_00048011、TCONS_00062426、TCONS_00039964、TCONS_00076277等）可能与绵羊IMP代谢调控相关。

Abstract

Objective This research aims to analyze genes and pathways related to inosine monophosphate （IMP） metabolism in sheep，to provide a reference for IMP regulation studies concerning sheep meat quality. Method With Dorper sheep，Tan sheep，and Small-tailed Han sheep as research subjects，samples of their longissimus dorsi muscle were collected，and their IMP and cholesterol levels were measured.A cDNA library was constructed for transcriptome sequencing to screen differentially expressed mRNA（DE mRNAs） and defferentially expressed long non-coding RNAs（DE lncRNAs）.Target gene of DE lncRNAs were predicted，and GO and KEGG enrichment analysis were performed on DE mRNAs and the target genes of DE lncRNAs.Interaction analysis was conducted on DE mRNAs and DE lncRNAs. RT-qPCR was used to detect the transcription levels of relevant DE mRNAs and DE lncRNAs，thereby validating the reliability of the sequencing data. Result There were no significant differences in cholesterol content in longissimus dorsi muscles among the three sheep breeds.However，the IMP content in Dorper sheep was significantly lower than those in Tan sheep and Small-tailed Han sheep （P<0.05），while no significant difference was observed between Tan sheep and Small-tailed Han sheep.DE mRNAs and DE lncRNAs were selected from comparisons between Dorper and Tan sheep，and between Dorper and Small-tailed Han sheep.The intersection of these two groups contained 232 DE mRNAs and 278 DE lncRNAs.GO enrichment analysis revealed that DE mRNAs were significantly enriched in 92 functional entries，including cysteine-type endopeptidase inhibitor activity.KEGG analysis indicated that DE mRNAs were involved in 159 pathways，including tryptophan metabolism，TNF signaling pathway，and linoleic acid metabolism，which were potential pathways related to IMP metabolism.Target gene prediction for DE lnc-RNAs yielded 1 657 target genes （803 trans-target genes and 854 cis-target genes）.Enrichment analysis revealed that trans- and cis-acting factors of DE lncRNA were significantly enriched in 129 and 137 GO entries，respectively，including rRNA processing，ribosome biogenesis，and intracellular signal transduction.They were also enriched in 228 and 226 KEGG pathways，respectively，encompassing RIG-I-like receptor signaling pathway，MAPK signaling pathway，and prolactin signaling pathway.These pathways and biological processes involve multiple genes closely related to muscle development and IMP metabolism.RT-qPCR validation of 6 DE mRNAs and 6 DE lncRNAs produced results consistent with the transcriptomic sequencing results， demonstrating the reliability of the sequencing data. Conclusion This study identified the DE mRNAs and DE lncRNAs in sheep longissimus dorsi muscle and the associated signaling pathways.Certain genes （IGFBP7，CRB1，NRG4，etc.） and lncRNAs （TCONS_00048011，TCONS_00062426，TCONS_00039964，TCONS_00076277，etc.） were screened as potential candidates involved in sheep muscle IMP metabolic regulation.

Graphical abstract

关键词

绵羊 / 肉品质 / 肌苷酸 / 转录组测序 / mRNA / lncRNA

Key words

sheep / meat quality / IMP / RNA-seq / mRNA / lncRNA

羊肉作为人们生活中重要的肉品之一，其品质对满足消费者的饮食需求作用重大。杜泊羊肉质优良，生长性能佳。滩羊是我国著名肉毛兼用绵羊，产二毛裘皮和美味羊肉，分布在宁夏中部及周边地区的干旱半干旱草原。小尾寒羊适应性和繁殖力强，抗逆性优良且耐粗饲，深受养殖户喜爱，但生长慢，产肉量低，生产效率不高，因此需在养殖中适当开展杂交改良与精准饲喂，以提高生产效率^［1］。

肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）是评价肉品鲜味的重要指标，其作用效果是谷氨酸钠的50倍，并且与谷氨酸钠有较强的协同效应。同时，外源添加IMP能刺激动物味觉，促进动物进食和生长，提高畜禽的肉用性能，改善肉品风味。近年来，围绕IMP含量调控肉品质的研究已在鸡^［2-3］和鱼^［4］等物种中取得进展，在牛上的探索也在逐步深入。李光辉等^［5］通过多组学联合分析揭示，丙糖磷酸异构酶1（TPI1）基因可负向调控IMP的合成代谢，嘌呤代谢通路是影响肉质风味形成的关键途径之一。向倩等^［6］研究指出，牛腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）是一种不稳定的亲水蛋白，可催化IMP合成，并可与腺苷酸代琥珀酸合成酶（ADSS）、磷酸核糖甘氨酰胺甲酰转移酶（GART）等多种蛋白互作调节IMP含量，进而显著影响牛肉的鲜味和整体品质。此外，腺苷酸活化蛋白激酶信号通路（AMPK）与动物宰后肌肉中IMP的积累密切相关，高永芳等^［7］在西杂牛中发现，AMPK能够感知宰后肌肉能量状态的变化（如ATP降解和AMP/ADP积累），其一方面可加速糖酵解以恢复能量平衡，另一方面也可间接促进ATP降解途径中IMP的生成与积累，从而影响肌肉品质；安宇凡等^［8］的研究结果也进一步证实了AMPK对肌肉品质具有调控作用。

近年来，高通量测序技术广泛用于动物肉类性状研究。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和mRNAs的相互调控在IMP代谢中可能起着关键作用。WANG等^［9］借助转录组测序（RNA-seq）方法探索和牛与安格斯牛杂交后代肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）沉积的分子机制，筛选出与脂质代谢、PPAR信号通路、甘油酸代谢等通路相关的基因，并构建了肝-IMF调控网络。ZHANG等^［10］通过转录组测序和生物信息学分析，从静原鸡中鉴定出39个差异表达的miRNAs和574个差异表达的mRNAs，并发现差异表达的丙酮酸激酶M2基因（PKM2）通过嘌呤代谢、氨基酸生物合成、丙酮酸代谢和糖酵解/糖异生这4条通路协同gga-miR 107-3p-KLHDC2因子调控IMP的合成。王燕燕等^［11］采用RNA-seq方法筛选出了在陶湖杂交F₁代和萨湖杂交F₁代2种杂交羊中差异表达的基因，获得众多富集在AMPK信号通路、脂类代谢信号通路等与肉质相关的基因，为培育出肉质风味更优的羊品种提供了理论依据。目前，IMP在羊上的相关研究仍较为有限，现有研究主要聚焦在滩羊上。为系统解析不同品种羊肉中IMP含量差异及其遗传机制，本研究以杜泊羊、滩羊和小尾寒羊为研究对象，采用转录组测序技术筛选与IMP含量相关的关键基因和信号通路，旨在从分子水平揭示IMP积累的机制，为培育高IMP含量绵羊品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

受试绵羊饲养于宁夏石嘴山市威震肉羊繁育场。选用饲养管理条件一致、健康无疾病的8月龄滩羊（T，n=7）、杜泊羊（D，n=8）和小尾寒羊（H，n=7）共计22只绵羊作为研究对象，屠宰后采集右侧第3到第12肋骨间的背最长肌组织（500 g/只），用于IMP含量的测定。在各品种中分别选取3只绵羊的背最长肌样本，切取少量肉样装于无RNA酶的2 mL冻存管中，标号后迅速置于液氮罐中储存，用于转录组测序。

1.2 试验方法

1.2.1 IMP和胆固醇含量测定

采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对绵羊背最长肌中的IMP和胆固醇含量进行测定。利用SPSS（V25.0）软件对绵羊群体背最长肌中IMP含量进行方差分析，数据以“平均值±标准差”表示，以P<0.05为差异显著性判断标准。

1.2.2 羊cDNA文库构建和转录组测序

采用Trizol试剂盒（Invitrogen）提取绵羊背最长肌组织RNA。使用Nanodrop和Agilent 2100 bioanalyzer及1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的浓度、纯度、完整性。检测合格的RNA去除核糖体RNA（rRNA）后，构建cDNA文库，具体流程如下：将片段化的RNA以随机引物反转录为cDNA第一链，再以DNA聚合酶I合成cDNA第二链；随后进行末端修复、A尾添加与接头连接，完成Illumina®测序文库构建。反转录反应体系为：5×g DNA Eraser Buffer 2.0 µL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 µL，Oligo dT Primer 0.5 µL，Random 6 mers 0.5 µL，Total RNA 1 µL，无RNase 蒸馏水5.5 µL；反应程序为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。最终在Illumina测序平台上进行PE150模式的双末端转录组测序。

1.2.3 差异表达mRNAs和lncRNAs筛选

为了获得高质量的有效读段（clean reads），使用fastp（V0.18.0）进行质控过滤，并借助Bowtie2（V2.5.3）去除rRNA序列，随后通过HISAT2（V2.1.0）将剩余序列比对至绵羊参考基因组（Ovis aries，ARS-UI-Ramb-v2.0）。利用DESeq2（v1.36.0）进行差异表达基因分析，筛选标准为显著性P<0.05且|lb FC|≥1。基于IMP含量结果，将D（IMP含量最低）分别与T、H比较，得到差异表达mRNAs（DE mRNAs）和差异表达lncRNAs（DE lnc-RNAs）。取杜泊羊和滩羊（D vs T）、杜泊羊和小尾寒羊（D vs H）DE mRNAs、DE lncRNAs交集（D vs T & D vs H）进行后续分析。

1.2.4 DE lncRNAs靶基因预测

为探究lncRNA功能，本研究通过顺式和反式2种方式对DE lnc-RNAs进行靶基因预测。顺式作用分析中，将lnc-RNA上下游100 kb范围内的蛋白编码基因进行识别并视为潜在顺式靶基因（cisG）。反式作用分析则基于表达相关性，筛选与DE lncRNAs相关系数大于0.95的DE mRNAs作为反式靶基因（tranG）。

1.2.5 DE mRNAs、DE lncRNAs靶基因功能富集分析

使用在线网站（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn）对DE mRNAs和DE lncRNAs进行GO和KEGG富集分析。GO条目分为3类，分别为生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。

1.2.6 DE lncRNAs与DE mRNAs互作分析

基于lncRNA与mRNA的靶向关系，用Cytoscape（V3.8.2）绘制DE lncRNAs与DE mRNAs的互作图。

1.2.7 RNA⁃seq数据的验证

选取9个绵羊背最长肌RNA样本，使用天根生物公司反转录试剂盒将其反转录为cDNA，置于-20 ℃冰箱保存备用。随机选取6个DE mRNAs和DE lncRNAs，通过实时荧光定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR）对转录组测序数据进行验证。从GenBank上查找CDS序列，使用Primer 5.0软件设计引物，以GAPDH作为内参基因，引物由北京擎科生物科技有限公司合成（表1）。采用SYBR Green染料法对DE mRNAs和DE lncRNAs进行RT-qPCR反应， RT-qPCR在96孔CFX Connect（美国）仪器上进行，反应体系为TB Green Taq Ⅱ 10 μL，Rox Dye Ⅱ 0.4 μL，200 ng/μL cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，加ddH₂O至总体积20 μL。RT-qPCR反应条件：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。RT-qPCR扩增反应结束后进行60~95 ℃熔解曲线分析。试验重复3次。对qPCR得到的Ct值进行标准化处理，采用2^-ΔΔCt 方法计算基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1 3个绵羊品种IMP和胆固醇含量差异分析

由表2可知，胆固醇含量在3个绵羊品种间差异不显著（P>0.05）；杜泊羊IMP含量显著低于滩羊和小尾寒羊（P<0.05），滩羊和小尾寒羊间无显著差异。

2.2 DE mRNAs和DE lncRNAs筛选

2.2.1 DE mRNA筛选

试验结果表明，D vs T组筛选出578个DE mRNAs，其中313个表达上调，265个表达下调；D vs H组筛选出816个DE mRNAs，其中511个表达上调，305个表达下调。对D vs T和D vs H DE mRNAs取交集，得到232个DE mRNAs。

2.2.2 DE lncRNA筛选

试验结果表明，D vs T组筛选出700个DE lncRNAs，其中344个表达上调，356个表达下调；D vs H组筛选出797个DE lnc-RNAs，其中388个表达上调，409个表达下调。对D vs T和D vs H DE lncRNAs取交集，共得到278个DE lncRNAs。

2.3 DE mRNA的功能分类与富集分析

对D vs T、D vs H中共同存在的232个DE mRNAs进行GO功能富集和KEGG信号通路分析。GO结果显示，232个DE mRNAs共富集到1 172个GO条目，其中显著富集的GO条目有92个，选取其中30个条目（10个BP、10个CC及10个MF）绘图，结果见图1。由图1可知，在BP条目中，主要富集到调节细胞增殖、对蛋白质代谢过程的积极调节等子条目；在CC条目中，主要富集到小亚基加工体、核糖核蛋白复合物和前核糖体等子条目；在MF条目中，主要富集到半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性、胆绿素还原酶活性等子条目。3个条目中的一些子条目与肌肉生长发育、IMP代谢显著相关，如MF条目中的半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性等。

KEGG结果显示，232个DE mRNAs显著富集于159条信号通路中，从DE mRNAs富集的信号通路中按P值从小到大排序后，选取P值排名前20的信号通路作图，结果见图2。由图2可知，DE mRNAs主要富集在亚油酸代谢、色氨酸代谢、TNF信号通路、MAPK信号通路、血清能突触、催乳素信号通路等通路，其中亚油酸代谢、MAPK信号通路等可能与IMP代谢有关。

2.4 DE lncRNA靶基因的功能分类与富集分析

依据反式法则（共表达）和顺式法则（共位置），预测DE lncRNAs的靶基因。278个DE lncRNA共预测到1 657个靶基因，其中包括反式靶基因803个，顺式靶基因854个。

2.4.1 反式靶基因的功能分类和富集分析

803个反式靶基因共富集到2 170个GO条目，其中显著富集的GO条目有129个，选取其中30个（10个BP，10个CC及10个MF）绘图，结果见图3。由图3可知，在BP条目中，主要富集到rRNA加工、rRNA代谢过程、核糖体生物合成等子条目；在CC条目中，主要富集到大分子复合物、核腔等子条目；在MF条目中，主要富集到DNA结合、S-腺苷蛋氨酸依赖性甲基转移酶活性等子条目。3个条目中的一些子条目与肌肉生长发育、IMP代谢有关，如BP条目中rRNA加工、rRNA代谢过程、核糖体生物合成等。KEGG分析结果显示，803个反式靶基因共富集于228条信号通路中，从DE lncRNAs富集的信号通路中按P值从小到大排序后，选取P值排名前20的信号通路作图，结果见图4。

由图4可知，DE lncRNAs反式靶基因主要富集在肾素-血管紧张素系统、真核生物核糖体生物合成等通路。

2.4.2 顺式靶基因的功能分类和富集分析

854个顺式lncRNA靶基因共富集到2 104个GO条目，其中显著富集的条目有137个，选取其中30个（10个BP，10个CC及10个MF ）绘图，结果见图5。由图5可知，在BP条目中，主要富集到小GTP酶介导的信号转导、细胞内信号转导等子条目；在CC条目中，主要富集到细胞器膜、膜结构等子条目；在MF条目中，主要富集到阳离子跨膜转运蛋白活性、蛋白质结合等子条目。3个条目中的一些子条目与肌肉的生长发育、IMP代谢相关，如BP条目中细胞内信号转导等。

KEGG结果显示，854个顺式lncRNA靶基因富集于226条信号通路中，从DE lncRNAs富集的信号通路中按P值从小到大排序后，选取P值排名前20的信号通路作图，结果见图6。

由图6可知，DE lncRNAs顺式靶基因主要富集在RIG-I样受体信号通路、Rap1信号通路、催乳素信号通路、MAPK信号通路、心肌收缩、PI3K-Akt信号通路等，其中MAPK信号通路可能和IMP代谢相关。

2.5 DE lncRNAs与DE mRNAs互作网络分析

为深入探究影响IMP代谢的关键基因，本研究对D vs T和 D vs H共有的DE mRNAs和DE lnc-RNAs进行互作分析，以更精准地剖析他们间的关系，结果见图7。由图7可知，CA5A、TRAT1与TCONS_00081739存在互作关系；FAM3B、CRB1与TCONS_00039964存在互作关系；NRG4与TCONS_00076277存在互作关系；C8B与TCONS_00177140、TCONS_00009206、TCONS_00164001存在互作关系；IGFBP7与TCONS_00048011、TCONS_00062426存在互作关系；NT5DC3、SHC3与TCONS_00081700存在互作关系。本试验通过IMP差异富集得到众多基因，其在心肌细胞功能调节、骨骼肌相关代谢与生长等诸多方面发挥作用。目前虽然未发现这些基因与IMP的直接关系，但基于其在肌肉生理过程中的重要作用，推测其与IMP存在潜在联系。

2.6 DE mRNAs和DE lncRNAs RT‐qPCR验证

为验证转录组测序结果，随机选择6个DE mRNAs（SLC2A9、ENTPD3、NT5DC3、PTGS2、SOS1、RAB25）和6个DE lncRNAs（TCONS_00182504、TCONS_00057689、TCONS_00172842、TCONS_00008702、TCONS_00038332、TCONS_00022256）进行RT-qPCR试验。结果（图8，9）显示，RT-qPCR结果与转录组测序结果的表达趋势一致，表明转录组测序结果的可靠性较高。

3 讨 论

羊肉品质受IMP含量影响显著，但其在绵羊中的lncRNA调控机制尚不明确。本研究以杜泊羊、滩羊和小尾寒羊为对象开展转录组测序分析，共鉴定出232个DE mRNAs和278个DE lncRNAs，其中lncRNA预测到1 657个靶基因（803个反式靶基因和854个顺式靶基因）。GO富集分析显示，与IMP调控相关的GO条目有半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性、rRNA加工、蛋白质结合、脂质储存的调节、离子跨膜转运蛋白活性、核糖体生物合成、免疫系统过程、细胞内信号转导等条目。KEGG富集分析表明，色氨酸代谢、RIG-I样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、亚油酸代谢、抗原加工与呈递、MAPK信号通路等多个通路可能与IMP调控相关。MAPK通路不仅参与骨骼肌线粒体生物发生和能量代谢的调控^［12］，也是影响滩羊宰后肌肉pH值、滴水损失和色泽等肉品质性状的核心通路^［13］。RIG-I样受体信号通路在多项肉质风味性状的研究中被提到^［14-15］。PI3K-Akt信号通路除在心肌纤维化^［16］、氧化损伤^［17］等方面发挥作用外，在鲫鱼中可改善肌肉质地并提升IMP含量^［18］，胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7）基因可通过影响PI3K-Akt信号通路来维持细胞生长和肌肉发育^［19］，具体而言，IGFBP7基因可促进鸡原代成肌细胞和肌内前脂肪细胞的增殖和分化^［20］。此外，史金平等^［21］基于RNA-seq技术挖掘影响绵羊肉质风味的遗传基础，发现PI3K-Akt信号通路被显著富集，并找到关键基因IGFBP7，这再次佐证了该基因在肌肉品质形成中的潜在作用。组氨酸脱羧酶在肌肉相关过程中具有重要作用，其可催化组氨酸转化为组胺，这一过程参与调控肌肉保鲜及风味形成^［22］。本研究crumbs细胞极性复合体组分1（crumbs cell polarity complex component 1，CRB1）富集到组氨酸脱羧酶活性条目。另有研究发现，盐度可通过调控组氨酸脱羧酶等关键酶的活性进一步影响肌肉中氨基酸与核苷酸的代谢平衡，从而调控IMP等风味物质的形成与积累^［23］。有研究显示，在羊背最长肌的冷藏过程中，组氨酸与嘌呤的生物碱合成通路被激活，从而促进了IMP等风味物质积累^［24］。另外CRB1同源蛋白CRB3已被证实可在多种上皮及骨骼肌组织中表达^［25］。神经调节蛋白-4（neuregulin 4，NRG4）是表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）家族的一种脂肪因子，其在棕色脂肪组织、白色脂肪组织、胰腺、肺和心脏等组织器官均有表达^［26］，其可与ErbB4受体结合，激活PI3K/MAPK与AMPK等多条下游通路，参与调控细胞增殖、凋亡、能量代谢及炎症反应等过程^［27］。NRG4在心肌细胞中发挥多重保护作用，包括抗肥大、抗纤维化、抗炎（通过抑制NF-κB）^［28］以及抗凋亡和抗铁死亡^［29］。除在能量代谢和疾病中的作用外，NRG4在肉品质调控中的功能也日益受到关注，已有研究证实其为肝脏脂质合成的关键负调控因子^［30］。因此推测，NRG4可能通过调控脂代谢间接影响IMP等风味物质，进而影响肉品质。

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基金资助

宁夏自然科学基金项目(2020AAC03082)

宁夏回族自治区农业育种专项(nxnyyz20150101)