新吉细毛羊血浆外泌体促小尾寒羊毛囊发育的转录组学分析及差异miRNA筛选

摘要

【目的】探讨新吉细毛羊血浆外泌体（PLA-Exos）对小尾寒羊毛囊发育的影响，并通过转录组测序分析筛出皮肤组织中影响毛囊发育的关键miRNA，为miRNA对毛囊发育的调控机制研究提供理论依据。【方法】采用双相沉淀法提取新吉细毛羊PLA-Exos，对其进行鉴定。构建小尾寒羊脱毛模型，在其左侧背部皮肤脱毛区域五点皮内注射新吉细毛羊PLA-Exos，每日一次，连续注射5 d，右侧对应脱毛区域皮内注射相同体积的PBS作为对照，注射结束后第21天采集皮肤组织，HE染色观察皮肤组织学变化。对皮肤样本进行转录组测序分析，使用DESeq2软件，以|log₂ Fold Change|≥1和错误发现率（FDR）≤0.05为标准筛选差异表达miRNA，利用miRanda和RNAhybrid预测其靶基因，并对靶基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，进而构建差异miRNA-mRNA调控网络。利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）对转录组测序结果进行验证。【结果】成功分离出新吉细毛羊PLA-Exos，其粒径主要集中在30～150 nm，在106 nm处出现浓度峰值，表达表面标志蛋白TSG101和CD9。皮肤组织切片观察发现，PLA-Exos组毛囊数目较对照组明显增加。从皮肤组织中共鉴定出1 474个miRNA（已知miRNA 146个，新预测1 328个），共筛选出18个差异表达miRNA，其中14个上调表达（novel-mir-335、novel-mir-957、novel-mir-855、novel-mir-561、novelmir-797、novel-mir-1158、novel-mir-917、novel-mir-816、novel-mir-1119、novel-mir-616、novel-mir-1192、 novel-mir-528、novel-mir-451和novel-mir-478）,4个下调表达（novel-mir-1170、novel-mir-965、novel-mir-1352和novel-mir-156）。18个差异表达miRNA共预测到493个靶基因，GO功能注释分析显示，差异表达miRNA的靶基因主要涉及生物学过程中的细胞过程、单一生物过程等条目及细胞组分和分子功能中的细胞、细胞部分、结合与催化活性等条目；KEGG通路分析显示共富集在273个通路中，有6个miRNA及其靶基因富集于与毛囊调控密切相关的MAPK和Wnt信号通路。通过RT-qPCR对10个差异表达miRNA进行验证，结果与转录组测序数据一致。【结论】novel-mir-1192、novel-mir-1158、novel-mir-156、novel-mir-917、novel-mir-797和novel-mir-451及其靶基因是调控毛囊发育的候选基因，可能对绵羊毛发生长有重要影响。

关键词

毛囊发育 / miRNAs / 血浆外泌体 / 新吉细毛羊 / 小尾寒羊