切花菊CmCUC基因鉴定及在腋芽发育中的作用分析

Identification and functional analysis of CmCUC gene in axillary bud development of cut chrysanthemum（Chrysanthemum × morifolium）

摘要

目的 克隆调控切花菊腋芽形成的关键基因CmCUC并分析其表达特性，为菊花株型改良提供理论依据。 方法 通过基因克隆分离切花菊‘神马’的CmCUC基因序列，利用生物学信息方法分析CmCUC蛋白理化性质、蛋白结构、蛋白亲疏水性、保守结构域和启动子顺式元件，预测其跨膜结构及信号肽，利用农杆菌瞬时转化本氏烟草叶片，对CmCUC基因进行亚细胞定位，通过实时荧光定量分析CmCUC基因在菊花顶芽、腋芽、花、叶、根、茎等不同组织部位的表达特异性，明确其在不同分枝类型菊花顶芽和腋芽等组织中的表达模式，以及在‘神马’腋芽不同发育阶段的表达特性。 结果 从切花菊‘神马’中分离鉴定到1个NAC（NAM/ATAF/CUC）超家族CUC基因CmCUC，CmCUC基因全长1 017 bp。系统发育分析发现，CmCUC蛋白与罂粟PsCUC蛋白的进化关系更近；蛋白序列分析表明，CmCUC蛋白结构稳定，无信号肽且无跨膜螺旋区，为亲水性蛋白；CmCUC蛋白以无规则卷曲为主，且具有典型的NAM结构域，属于NAC基因家族。顺式作用元件预测分析显示，CmCUC基因启动子区域含有光响应元件、生长素响应元件、脱落酸响应元件和分生组织特异性表达相关元件；亚细胞定位结果显示，CmCUC基因定位于细胞核。表达分析结果显示，CmCUC基因在菊花顶芽和腋芽组织中表达量较高，而在花、叶、根、茎等组织中不表达或表达量较低；在不同分枝类型菊花中，CmCUC基因在顶端优势明显类型的顶芽中表达量较高；在腋芽形成的不同阶段，CmCUC基因在腋芽发育的早期阶段（腋生分生组织形成阶段）表达水平最高，随着腋芽形成，其表达水平逐渐下降。 结论 CmCUC基因属于NAC家族转录因子，可以促进切花菊的顶芽和腋芽等芽组织发育，特别是在腋芽发育过程中，其通过调控腋生分生组织的发育来促进腋芽形成。

Abstract

Objective This study aimed to clone the key gene CmCUC regulating the formation of cut Chrysanthemummorifolium axillary bud and to analyze its expression characteristics，thus providing theoretical and experimental basis for molecular breeding and plant type improvement of chrysanthemum. Method The CmCUC gene sequence of cut C.morifolium ‘Shenma’ was isolated by gene cloning. The physicochemical properties，protein structure，protein hydrophilicity and hydrophobicity，conserved domains and promoter cis-elements of CmCUC protein were analyzed by biological information method.Additionally，its transmembrane structure and signal peptide were predicted.The subcellular localization of CmCUC gene was performed by Agrobacterium-mediated transient transformation of Nicotiana tabacum leaves.The differential expression patterns of the CmCUC were investigated by qRT-PCR in various organs，including apical buds，axillary buds，flowers，leaves，roots，and stems，to clarify its expression patterns in the tissues of chrysanthemum cultivars with different branching types，along with its expression characteristics during different developmental stages of the axillary buds in ‘Shenma’. Result A NAC（NAM/ATAF/CUC） superfamily CUC gene，CmCUC，was isolated and identified from cut C.morifolium ‘Shenma’.The full length of the CmCUC gene was cloned to be 1 017 bp.Phylogenetic analysis showed that the CmCUC protein shared a closer evolutionary relationship with PsCUC protein of opium poppy.Protein sequence analysis revealed that CmCUC protein was a stable，hydrophilic protein lacking both a signal peptide and transmembrane helices.The CmCUC protein was mainly composed of random coils and contains a typical NAM domain，belonging to the NAC gene family.Prediction analysis of cis-acting ele-ments showed that the promoter region of the CmCUC gene contained light-responsive elements，auxin-responsive elements，abscisic acid-responsive elements，and meristem-specific expression related elements.Subcellular localization results demonstrated that CmCUC gene was localized in the nucleus.The expression analysis showed that CmCUC gene was highly expressed in apical buds and axillary buds，but not expressed or expressed at low levels in flowers，leaves，roots and stems.Among chrysanthemum cultivars with different branch types，the expression level of CmCUC gene was higher in the apical buds of those exhibiting strong apical dominance.At different stages of axillary bud development，the expression level of the CmCUC gene peaked at the early stage of axillary bud development （axillary meristem formation stage），and gradually decreased as the axillary bud formed. Conclusion The CmCUC gene belongs to the NAC family of transcription factors and can promote the development of bud tissues，including apical buds and axillary buds in cut C.morifolium.Particularly during axillary bud development，it facilitates axillary bud formation by regulating the development of axillary meristems.

Graphical abstract

关键词

切花菊 / 腋芽发育 / CmCUC基因 / 表达模式

Key words

cut Chrysanthemum×morifolium / axillary bud development / CmCUC gene / expression pattern

植物分枝是自然界中普遍存在的现象，是植物形态建成中的重要组成部分，是决定作物产量和园艺植物观赏价值的重要性状^［1］。菊花（Chrysanthemum×morifolium Ramat）作为中国传统名花和世界主要商品花卉，不同栽培应用类型对株型有着独特的需求，如园林景观用菊花品种对株型需求为顶端优势缺失的多分枝类型，而切花菊特别是单头切花菊则要求顶端优势极强的少分枝（或不分枝）类型。因此，培育理想分枝特性的新品种是菊花育种的重要目标之一，而解析菊花侧枝发育机制是其核心科学问题。植物的侧枝由叶腋部位的腋生分生组织（axillary meristem，AM）发育而成，植物侧枝发育一般包括3个阶段，分别为腋芽的形成、腋芽的释放（或腋芽的休眠）和腋芽的伸长^［2］，其中腋芽的形成是侧枝形成的关键阶段，这一阶段又可细分为叶腋部位的确定、叶腋内分生组织形成能力的维持、腋生分生组织的形成和叶原基的形成4个时期^［3］。越来越多的研究表明，转录因子在腋芽的形成过程中发挥着重要调控功能^［4］。例如番茄（Solanum lyco‐persicum L.）中RAX1同源基因BLIND的缺失会导致腋生分生组织无法形成^［5］；拟南芥STM基因在分生组织中特异性表达，其参与分生组织分生能力的维持并抑制分生组织的分化^［6］。

CUC （CUP-SHAPED COTYLEDON）是一类具有NAC（NAM/ATAF/CUC）结构域的转录因子^［7］。已有研究发现CUC亚家族基因在植物生长发育过程中具有重要作用，如参与植物形态建成、相邻器官间分离、分生组织起始等^［8］。在拟南芥中，AtCUC基因通过调控下游LAS基因促进AM起始^［9］，并且激活DA1基因的表达，促进侧枝形成^［10］；拟南芥cuc2突变体植株的叶缘变得平滑，cuc3突变体叶片锯齿较少^［11］；番茄中CUC2的同源基因丢失会使复叶的复杂性降低^［12］；在花器官发育中，CUC1和CUC2不仅是心皮边缘分生组织形成与定位的关键基因^［13］，还是促进珠原基形成及影响早期胚珠发育的重要基因^［14］。

分枝是菊花的重要性状，但目前关于菊花分枝性状的形成和调控机制并不清楚，分离鉴定的调控菊花腋芽形成的基因尚极为有限。本研究从菊花中分离鉴定CmCUC基因，对其序列特征及蛋白特性等进行分析，并对其在不同组织部位、腋芽形成不同阶段及不同分枝特性菊花中的表达模式进行研究，明确其在菊花腋芽发育中的作用，以期为深入探索其功能及解析其调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

基因克隆、组织特异性表达及腋芽形成不同阶段基因表达模式研究所选用的材料为切花菊品种‘神马’；为探究CmCUC基因在不同分枝特性菊花中的表达是否存在差异，选择代表3种不同分枝类型的6份菊花种质资源作为试验材料，分别为切花菊品种‘圣雪’‘神马’，地被菊品种‘匙之粉黛’‘2019-39’，野菊‘福州野菊’‘菊花脑’，以研究CmCUC基因在不同菊花品种顶芽和腋芽中的表达模式。以上材料均由国家花卉工程中心菊花课题组提供和保存，采用扦插方式繁殖。

1.2 试验方法

1.2.1 基因克隆

利用天根RNA快速提取试剂盒获取菊花营养生长期腋芽组织的RNA，然后利用PrimeScript^TM RT Reagent kit合成cDNA。根据菊花CmCUC基因的编码区（CDS）序列设计引物，以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应体系25 μL：上下游引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，2×Phnta UniFi Master Mix 12.5 μL，ddH₂O 9.5 μL；PCR扩增程序为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对菊花CmCUC基因的PCR产物进行纯化回收，连接到pTOPO-Blunt载体上，转化至Top 10大肠杆菌感受态中，并将鉴定为阳性的菌液送至北京擎科生物科技有限公司进行双向测序。

1.2.2 CmCUC基因的生物信息学分析

从NCBI数据库中获得拟南芥、水稻、玉米等22个物种CUC基因的CDS序列，使用MEGA11.0采用邻位相接法构建系统发育树，利用在线软件ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）、SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）、WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）、T-MHMMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）、SignalP（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）进行菊花CUC蛋白理化性质、二级结构、亲疏水性分析及定位预测分析、跨膜结构域预测分析、信号肽预测分析和蛋白质三级结构预测分析，利用Smart网站（http：//smart.embl-heidelberg.de）预测菊花CmCUC蛋白的保守结构域，利用TBtools软件进行启动子顺式作用元件分析。

1.2.3 CmCUC基因表达载体构建及亚细胞定位

利用QuickCut KpnⅠ内切酶对PCAMBIASuper1300-GFP空载体进行酶切，以获得线性化的PCAMBIASuper1300-GFP，再利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对反应液中的线性化质粒进行纯化回收。利用菊花CmCUC基因序列和PCAMBIASuper1300-GFP序列信息设计同源臂引物，再利用PCR在菊花CmCUC基因两端加上同源臂。对加有同源臂的菊花CmCUC基因进行纯化回收，连接到线性化的PCAMBIASuper1300-GFP质粒上，转化至Top 10大肠杆菌感受态中，并将鉴定为阳性的单克隆菌液送至北京擎科生物科技有限公司测序，送返测序正确的菊花CmCUC-GFP融合表达质粒。借助冻融法将菊花CmCUC-GFP融合表达质粒转化至GV3101农杆菌感受态中，利用农杆菌瞬时转化本氏烟草叶片的方法对菊花CmCUC基因进行亚细胞定位，利用荧光共聚焦显微镜SP8观察并拍照。

1.2.4 CmCUC基因表达分析

在切花菊‘神马’腋芽形成的4个发育阶段（其中第Ⅰ发育阶段为AM形成阶段，此时在叶原基叶腋部位的中央呈现出一个明显球状突起；第Ⅱ发育阶段为边界区域形成阶段，此时AM刚开始分化，两侧叶原基刚刚开始隆起，与中央的分生组织形成了明显边界，即有2条边界区域；第Ⅲ发育阶段为叶原基形成阶段，此时AM两侧的叶原基逐渐膨大，但叶原基尚且不能完全包裹AM；第Ⅳ发育阶段为腋芽形成后停滞生长阶段，此时AM两侧的叶原基明显伸长，且叶原基已经将AM紧密包裹），以顶芽、腋芽、花、叶、根、茎等不同组织部位以及6个不同分枝特性菊花品种的顶芽和腋芽cDNA为模板，以菊花18S基因为内参基因（表1）进行荧光定量PCR。菊花CmCUC基因的相对表达水平通过2^-ΔΔCt 进行计算，荧光定量结果数据的分析与统计由Microsoft Office Excel完成，采用Graphpad Pism进行显著性分析和图片绘制。

2 结果与分析

2.1 CmCUC基因的克隆

以切花菊‘神马’腋芽的cDNA为模板进行PCR扩增，获得基因编码序列全长，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，显示在1 017 bp有目的条带（图1）。测序后与CmCUC基因的CDS序列一致，表明已成功克隆了CmCUC基因的编码区。

2.2 CmCUC蛋白的生物信息学分析

2.2.1 CmCUC蛋白理化性质分析和二级、三级结构预测

经在线软件ExPASy预测，CmCUC蛋白的氨基酸数目为338，分子质量为37 706.28 ku，等电点为8.34，表现为碱性（等电点≥7）。该蛋白序列的总平均亲水系数为负数，不稳定系数为33.92，说明其结构表现稳定。亚细胞定位预测结果显示，菊花CmCUC蛋白定位于细胞核中，可能作为转录因子发挥转录调控功能。蛋白质二级结构预测结果（图2-A）显示，该基因以无规则卷曲为主，有271个无规则卷曲结构，占比80.18%，其次延伸链占比11.54%，α-螺旋占比8.28%。蛋白质三维结构预测结果（图2-B）表明，其可信度（global model quality estimation，GMQE）为0.63，序列比对一致性为97.03%。

2.2.2 CmCUC蛋白信号肽、跨膜区域预测和蛋白亲疏水性分析

为深入了解CmCUC蛋白的生物学功能，对其结构特性，包括信号肽、跨膜区域以及亲疏水性等进行了深入分析，结果见图3~5。信号肽预测结果（图3）显示，CmCUC蛋白不存在信号肽结构域，表明CmCUC蛋白可能不具备经典的分泌途径介导的蛋白转运功能。跨膜区域预测结果（图4）显示，CmCUC蛋白的氨基酸序列中不存在跨膜螺旋区，为非膜蛋白，主要分布在膜外。蛋白亲疏水性分析结果（图5）显示，CmCUC蛋白为亲水性蛋白，其中异亮氨酸亲水性最强，亲水指数为4.5，明精氨酸疏水性最强，疏水指数为-4.5。

2.2.3 CmCUC蛋白系统进化分析

为了探究菊花CmCUC蛋白在进化上的保守性及其与其他物种CUC基因家族的关系，利用NCBI获取拟南芥等多个物种的CUCs氨基酸序列，使用MEGA软件构建系统发育树，结果（图6）显示，菊花的CmCUC蛋白与罂粟的PsCUC蛋白位于同一分支上，表明二者进化关系更近。系统发育树的分支结构进一步揭示了CUC基因家族在不同物种中的进化分化情况，为后续功能分析提供了重要的进化背景。

2.2.4 CmCUC基因保守结构域和启动子顺式作用元件

保守结构域分析结果（图7）显示，菊花CmCUC基因有一个保守结构域，为Pfam： NAM结构域，长度为16~142个氨基酸，表明CmCUC属于NAM亚族。

顺式作用元件预测分析结果（图8）表明，CmCUC基因的启动子区域包含多种潜在的顺式调控元件，环境因子响应元件中鉴定出多个光响应元件，提示CmCUC基因的表达可能受光信号通路的调控，激素响应元件涉及茉莉酸甲酯响应元件、生长素响应元件、脱落酸响应元件和水杨酸响应元件。此外，启动子序列中还存在1个分生组织特异性表达相关元件，暗示该基因可能在植物分生组织的分化过程中发挥调控作用。

2.3 CmCUC基因的亚细胞定位

以测序正确的CmCUC基因阳性克隆质粒为模板，构建菊花CmCUC-GFP融合表达载体，利用农杆菌瞬时转化本氏烟草叶片，使用荧光共聚焦显微镜观察菊花CmCUC融合蛋白在烟草叶片下表皮细胞中的分布情况，结果见图9。图9显示，细胞核中出现明显的荧光信号，表明CmCUC蛋白主要在细胞核中积累，与软件预测结果相符，其可能作为转录因子发挥调控功能。

2.4 CmCUC基因的表达模式分析

2.4.1 CmCUC基因组织特异性表达

为进一步探究CmCUC基因组织特异性表达模式，对该基因在‘神马’菊花腋芽、顶芽、花、叶、根和茎等组织中的相对表达量进行了检测。荧光定量分析结果（图10）显示，CmCUC基因在顶芽中的表达水平最高，其次是腋芽，而在花、叶、根、茎组织中表达量较低。上述表达模式提示，CmCUC基因可能在菊花芽相关器官的发育进程中发挥调控作用。

2.4.2 CmCUC基因在菊花腋芽形成不同阶段的表达

为了进一步明确CmCUC基因在‘神马’菊花腋芽形成过程中具体发挥作用的时期，对CmCUC基因在菊花腋芽形成4个关键时期的表达情况进行了分析。荧光定量分析结果（图11）显示，CmCUC基因在腋芽形成早期显著高表达，伴随着腋芽的逐渐形成，其表达水平不断下调，表明菊花CmCUC基因可能在腋芽形成早期特别是腋生分生组织形成过程中发挥着重要调控作用。

图11　 CmCUC基因在‘神马’菊花腋芽各发育阶段的表达

Fig.11　 CmCUC gene expression in different developmental stages of axillary buds in chrysanthemum cultivar ‘Shenma’

2.4.3 CmCUC基因在不同分枝类型菊花中的表达

为探究CmCUC基因在不同分枝类型菊花中的表达是否存在差异，选取切花菊、地被菊和野菊3种分枝类型的6 份菊花种质资源的腋芽和顶芽作为试验材料，检测CmCUC基因的相对表达量。荧光定量分析结果（图12）显示，不同分枝特性菊花顶芽和腋芽中基因表达水平存在差异，CmCUC基因在野菊‘菊花脑’的顶芽中表达量最高，其次是切花菊品种‘圣雪’的顶芽，在地被菊品种‘2019-39’腋芽中的表达量最低。上述结果进一步印证了CmCUC基因在芽器官发育调控中的潜在功能。

3 讨论与结论

植物分枝是植物株型的重要组成部分。在菊花中，不同的应用方式和应用场景对其分枝有着不同的要求，挖掘调控菊花分枝发育的关键基因并解析其调控机制，是理想分枝特性菊花新品种培育的核心科学问题。CUC基因家族是NAC基因家族的亚家族，在植物生长发育中扮演着重要角色^［15］。本研究从菊花中克隆获得CmCUC基因；系统进化分析显示，CmCUC蛋白与罂粟PsCUC蛋白的进化关系更近；蛋白序列分析发现，CmCUC蛋白结构稳定，无信号肽且不存在跨膜螺旋区，为亲水性蛋白。

保守结构域分析表明，克隆得到的CmCUC基因具有明显的NAM结构域，证明其属于NAC基因家族。亚细胞定位结果显示，CmCUC基因定位在菊花的细胞核，这与拟南芥AtCUC1定位于细胞核的结果^［16］一致。顺式作用元件预测分析表明，CmCUC基因的启动子区域含有光响应元件、生长素响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、脱落酸响应元件和分生组织特异性表达相关元件，说明CmCUC基因可能受光诱导和生长素等激素诱导。这与已报道的生长素运输和响应基因能够调节CUC基因的表达进而调控早期胚胎顶端的发育^［17］相一致。

已有研究表明，CmCUC基因主要受生长素、细胞分裂素和油菜素内酯激素调节^{［15，18-19］}，而切花菊CmCUC基因启动子区域鉴定出脱落酸和茉莉酸甲酯响应元件，暗示CmCUC基因可能同时受这两种激素调节，具体如何值得进一步研究。组织特异性表达分析结果显示，CmCUC基因主要在切花菊顶芽和腋芽中表达，说明CmCUC基因参与切花菊顶芽和腋芽的发育进程，这与已报道的CUC基因参与芽发育^［20］相一致。对切花菊腋芽形成过程中几个关键发育时期基因表达的分析显示，CmCUC基因主要在切花菊腋芽形成的第一时期，即腋生分生组织形成时期表达水平最高，随后伴随着腋芽逐渐形成其表达水平不断下调，说明CmCUC基因参与切花菊腋芽分生组织的发育。拟南芥cuc1cuc2突变体表现出不能形成茎尖分生组织的表型，在cuc突变体中，其生芽率相比野生型明显降低^［20］。此外，CUC基因还可与其他转录因子协同作用共同调控芽的发育。CUC2作为增强因子在PLT基因促进芽再生的过程中发挥作用^［21］；在ESR-CUC通路中，ESR基因在CUC上游发挥作用而影响早期茎尖分生组织的形成，进而影响不定芽的再生^［22］。拟南芥中的CUC2和CUC3基因可直接与DA1启动子结合并激活其表达，而DA1则通过调控UBP15的降解来促进腋生分生组织的形成^［23］；RAX1和LOF1基因是编码MYB转录因子的基因，在CUC基因的上游起作用，从而诱导CUC2的表达来促进腋生分生组织的形成，而在lof1突变体中，CUC1、CUC2、CUC3基因的表达均有所下调^［24］。在过表达miR164的cuc3‐2突变体中，腋生分生组织的形成过程受到显著抑制，这一结果表明，CUC1、CUC2与CUC3三者需协同参与共同调控腋芽形成及腋生分生组织的建立^［9］。综合本研究结果及已有文献^{［9，20，25］}报道，表明CmCUC基因可能在切花菊顶芽和腋芽的形态建成尤其是腋生分生组织形成过程中发挥重要的调控作用，这为深入解析CmCUC基因调控菊花顶芽和腋芽发育的分子机制提供了理论依据。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2023YFD1200105)

雄安新区科技计划项目

国家自然科学基金项目(32071827)

中央高校基本科研业务费专项(QNTD202503)

河北省省级科技计划项目(254X9918D)