鸡GTF2A1基因SNP位点筛选及其与产蛋性状的关联分析

Screening and bioinformatics analysis of SNPs in the chicken GTF2A1 gene and their association with egg‐laying traits

摘要

目的 解析通用转录因子ⅡA亚基1（general transcription factor ⅡA subunit 1，GTF2A1）基因对鸡产蛋性状的遗传效应，筛选与其显著相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记，为苏禽4号母系（M系）产蛋性能的分子标记辅助育种提供依据。 方法 以384只苏禽4号母系（M系）为试验对象，采用Sanger测序与Sequenom MassARRAY技术对GTF2A1基因进行SNP筛查。利用Haploview v4.1分析连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD），基于一般线性模型（general linear model，GLM）进行SNP位点及单倍型与产蛋性状的关联分析，并通过MEME Suite预测SNP对转录因子结合的影响。用GOMO对GTF2A1基因SNP位点保守基序进行功能预测， 结果 共检出2个SNP位点：g.40334089G>C（位于5′ UTR，为颠换突变）和g.40341114A>G（位于外显子3，为同义突变）。2个位点均符合哈代-温伯格平衡（P>0.05），且呈中度多态性。关联分析表明，g.40334089G>C位点GG基因型个体与g.40341114A>G位点AA基因型个体的开产日龄和300日龄产蛋数均显著优于其他基因型个体（P<0.05）。2个SNP位点处于强连锁不平衡状态，形成H1（GA）、H2（CG）、H3（GG）等3种单倍型，其中H1H1（GGAA）组合个体的300日龄产蛋数与开产日龄表现较优。g.40341114A>G位点有一个保守基序（CCTGCAGCTGGTCAGCAGCAGCCR（A/G）CAGC），该保守基序参与了小GTP酶介导的信号转导、蛋白质转运、葡萄糖代谢过程等生物过程及趋化因子活性、GTP结合等分子功能；g.40334089G>C位点没有保守基序。g.40341114A>G位点A→G突变能够增强保守基序与转录因子Myod1的结合能力，G→A突变可增强保守基序与转录因子REST和PPARG的结合能力。 结论 GTF2A1基因中g.40334089G>C和g.40341114A>G位点均与产蛋性状显著相关，其中单倍型组合H1H1（GGAA）为改善开产日龄和300日龄产蛋数的优势遗传标记，可作为苏禽4号母系（M系）分子标记辅助育种的核心依据。

Abstract

Objective This study aimed to elucidate the genetic effects of the general transcription factor ⅡA Subunit 1 （GTF2A1） gene on egg-laying traits in chickens，and screen single nucleotide polymorphism （SNP） markers significantly associated with these traits，to provide a basis for marker-assisted selection to improve egg-laying performance in the maternal line （M line） of Suqin No.4 chickens. Method A total of 384 hens from the Suqin No.4 maternal line were used as experimental subjects.SNP screening of the GTF2A1 gene was performed by using Sanger sequencing and Sequenom MassARRAY technology.Haploview v4.1 was employed for linkage disequilibrium （LD） analysis.Association analyses between SNP loci/haplotypes and egg-laying traits were conducted based on a general linear model （GLM）.The potential impact of SNP on transcription factor binding was predicted by using the MEME Suite.Function prediction of conserved motifs for SNP loci in the GTF2A1 gene was performed by using GOMO. Result Two SNP loci were identified：g.40334089G>C （located in the 5′ UTR，a transversion mutation） and g.40341114A>G （located in exon 3， a synonymous mutation）.Both loci were in Hardy-Weinberg equilibrium （P>0.05） and exhibited moderate polymorphism.Association analysis revealed that individuals with the GG genotype at the g.40334089G>C locus and individuals with the AA genotype at the g.40341114A>G locus had significantly better performance in age at first egg and the total number of eggs laid at the age of 300 days，compared to individuals with other genotypes （P<0.05）.The two SNP loci were in strong linkage disequilibrium， forming three haplotypes：H1（GA），H2（CG），and H3（GG），with H1H1 （GGAA） diplotype individuals showing better performance in age at first egg and the total number of eggs laid at the age of 300 days.The g.40341114A>G locus contained one conserved motif （CCTGCAGCTGGTCAGCAGCAGCCR（A/G）CAGC），which was involved in biological processes such as small GTPase-mediated signal transduction，protein transport，and glucose metabolic process，as well as molecular functions including chemokine activity and GTP binding.No conserved motif was identified in the g.40334089G>C locus.The A→G mutation at the g.40341114A>G locus could enhance the binding affinity of the conserved motif to the transcription factor Myod1，while the G→A mutation could enhance its binding affi-nity to transcription factors REST and PPARG. Conclusion The g.40334089G>C and g.40341114A>G loci in the GTF2A1 gene are significantly associated with egg-laying traits.The H1H1 （GGAA） diplotype serves as a favorable genetic marker for improving age at first egg and the total number of eggs laid at the age of 300 days，and can be used as a core basis for marker-assisted selection in the maternal line （M line） of Suqin No.4 chickens.

Graphical abstract

关键词

鸡 / GTF2A1基因 / 产蛋性状 / 单核苷酸多态性

Key words

chicken / GTF2A1 gene / egg-laying traits / single nucleotide polymorphism

种鸡产蛋性状是家禽遗传育种的核心指标，其遗传优化直接决定了种鸡的繁殖性能与产业的可持续发展能力。应用现代基因组学技术系统解析种鸡遗传特征，筛选关键分子标记，对提升种鸡繁殖性能具有重大的实践价值。美国国家生物技术信息中心官网公示的鸡通用转录因子ⅡA亚基1（general transcription factor ⅡA Subunit 1，GTF2A1）基因分布在5号染色体^［1］上，长度为26.3 kb，由8个内含子和9个外显子组成。真核RNA聚合酶无法单独识别并结合启动子，而是依赖基本转录因子与启动子形成前起始复合物以启动转录，其中GTF2A1作为关键因子，对大多数启动子的转录激活是必需的^［2］。GTF2A1蛋白可与TATA区域结合蛋白相互作用，在转录激活中发挥关键作用^［3］。GTF2A1基因的功能不仅限于转录调控，其在生殖细胞发育中也发挥着重要作用，近年来，GTF2A1基因在动物生殖系统中的潜在功能逐渐受到关注。研究发现，青蛙和小鼠体内有超过10种旁系同源的GTFs（GTF2A1基因的转录因子变体）在性腺组织中专一性表达，这些特殊的转录因子不仅承担着所有细胞都必需的基本转录工作，还专门负责调控与繁殖密切相关的关键基因活动^［4］。GTF2A1基因是卵巢肿瘤检测的一种候选生物标志物，在卵巢癌患者中高度甲基化，提示其可能在生殖系统的功能调控中发挥重要作用^［5］。TAO等^［6］结合3种基因组方法（GWAS、XP-nSL和ROH）对821只绵羊个体进行全基因组分析，结果将GTF2A1基因鉴定为繁殖性状候选基因。狄冉等^［7-8］对鲁中肉羊和绵羊的研究发现，GTF2A1基因的g.89505005G>A位点多态性与产羔数显著相关，AA基因型个体产羔数显著高于GG基因型个体，这一发现表明，GTF2A1基因可能是调控绵羊繁殖性能的关键基因之一。YUE等^［2］对澳大利亚白绵羊的研究发现，GTF2A1基因的某些插入/缺失（indel）多态性位点与绵羊的产仔数显著相关。LAWAL等^［1］采用群体杂合度分析方法对非洲地方鸡品种的正选择信号进行分析，发现GTF2A1基因与甲状腺刺激激素受体（thyrotropin receptor，TSHR）共同位于一个受选择的基因组区域，该区域Z（Hp）值最低，而TSHR基因已被证明在家禽的代谢和繁殖性状中起重要作用^［9-10］，提示GTF2A1基因可能与鸡种对当地气候条件的适应及繁殖性状相关。YUAN等^［11］对白来航鸡和东乡绿壳鸡杂交产生的F₂代母鸡进行全基因组关联分析，发现GTF2A1基因多态性与产蛋数显著相关，推测其可能通过影响卵巢和子宫的功能调控产蛋性能。基于上述研究，可以推测，GTF2A1基因在鸡群体中可能存在影响产蛋性状的功能性遗传变异，有望作为分子标记应用于我国特色鸡种育种实践中。但鸡GTF2A1基因多态性及其对繁殖性状的调控机制尚未见系统研究报道。苏禽4号是江苏省家禽科学研究所自主培育的黄羽肉鸡良种，其母系（M系）具有繁殖性能稳定、适应性强等特性，是解析基因与性状关联的理想模型。本研究以苏禽4号母系为对象，采用Sanger测序联合质谱阵列技术（Sequenom MassARRAY）系统筛查其GTF2A1基因SNP位点，通过连锁不平衡分析与单倍型构建，解析SNP位点与各产蛋性状的关联性，分析SNP位点对保守基序 （motif）与转录因子结合能力的影响，旨在筛选优势单倍型组合，为苏禽4号母系高繁殖力选育提供分子育种标记。

1 材料与方法

1.1 试验地点、对象及样品采集

本试验在江苏省家禽科学研究所仪征基地进行。苏禽4号母系（M系）母鸡按照种鸡饲养管理条件采用个体笼养方式饲养。待试验鸡开产后，记录其开产体质量、开产日龄、开产蛋质量、300日龄蛋质量和300日龄产蛋数。在大群母鸡中随机选取384只，翅下静脉采血1 mL/只，加入0.3 mL含5 mg/mL肝素钠的抗凝剂中，-20 ℃保存。

1.2 主要试剂及仪器

Taq DNA聚合酶、dNTPs及血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（型号：DP318），均购自天根生化科技（北京）有限公司；紫外分光光度计（NanoDro3 2000）和Applied Biosystems™ （3730xl DNA 分析仪） 测序仪，均购自Thermo Fisher Scientific公司；MALDI-TOF质谱仪，购自Agena Bioscience公司。

1.3 基因组DNA 提取

采用基因组DNA提取试剂盒（血液/细胞/组织）提取鸡全血基因组DNA，紫外分光光度计（NanoDrop 2000）检测DNA浓度与质量（1.8<OD₂₆₀/ OD ₂₈₀<2.0），稀释至50 ng/μL，备用。

1.4 引物设计与合成

根据GenBank上公布的鸡GTF2A1基因的DNA序列（GenBank登录号：NC_052536.1），用Primer Primer 5.0软件在鸡GTF2A1基因mRNA区域设计6对Sanger测序引物，引物信息见表1，由上海生工生物技术有限公司合成。针对Sanger测序确定的苏禽4号母系（M系）母鸡5号染色体基因组g.40334089和g.40341114位点（版本号：bGalGal1.mat.broiler.GRCg7b）序列，使用sequenom公司的引物设计软件Assay design 3.1设计MassARRAY SNP引物组，引物信息见表2，由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。

1.5 鸡GTF2A1基因SNP位点确定

将384份母鸡个体DNA样品各取1 µL，置于5 mL灭菌离心管中混合，制备DNA混合池模板。使用6对Sanger测序引物（表1）进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR缓冲液 （含15 mmol/L Mg²⁺）2.5 µL，10 µmol/L上下游引物各1.0 µL，2 mmol/L dNTPs 2.0 µL，5.0 U/µL Taq DNA聚合酶0.5 µL，50 ng/µL pooled DNA模板1.0 µL，ddH₂O补足25 µL。PCR扩增程序设定为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58~65 ℃（具体依表1中的引物而定）退火15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保存。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司在ABI 3730xl DNA分析仪上进行Sanger测序。利用DNAstar软件对获得的序列进行分析，筛选SNP位点。利用欧洲生物信息学研究所（EBI）旗下的Ensembl数据库（http：//asia.ensembl.org/index. html？redirect=no），基于鸡的参考基因组（版本号：bGalGal1.mat.broiler.GRCg7b），对GTF2A1基因的SNP位点进行全基因组定位。

1.6 鸡GTF2A1基因Sequenom MassARRAY‐SNP位点确定

采用多重PCR技术（引物见表2）同步扩增包含多个目标位点的DNA片段。按比例混合以下组分制备母液：HPLC级水691 µL，10×PCR Buffer 236 µL，25 mmol/L MgCl₂ 123 µL，25 mmol/L dNTPs 38 µL，0.5 µmol/L上下游引物混合物378 µL，5 U/µL Taq DNA 聚合酶76 µL。母液充分混匀，分装至384孔 PCR 板，每孔4 µL。随后每孔加入10 ng/µL基因DNA模板1 µL，使单孔反应液体积为5 µL。多重PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环45次；72 ℃延伸3 min；4 ℃保存。

多重反应产物用虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）进行消化处理，降解残留 dNTPs 并灭活游离引物，以纯化多重PCR扩增产物。SAP消化反应体系：将810.9 μL HPLC级水、90.1 μL 10×SAP缓冲液、159 μL 1.7 U/μL SAP混合配制成母液，按24 μL/孔分装至384孔板；反应程序为37 ℃温育40 min后85 ℃热失活5 min。在iPLEX酶催化下，使用针对各靶位点设计的单碱基延伸引物（表2），以双脱氧核苷酸（ddNTPs）为终止底物，对纯化后的多重反应产物进行单碱基延伸反应，延伸反应体系：将400.2 μL HPLC级水、106 μL 10×iPLEX Buffer Plus、106 μL iPLEX Termination Mix、426.1 μL 1.0 μmol/L 延伸引物混合物及22 μL iPLEX酶混合配制成母液，按2 μL/孔分装至384孔板。延伸反应程序为：94 ℃ 预变性30 s；94 ℃变性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s，退火延伸5个循环，变性退火延伸40个循环；72 ℃延伸3 min；4 ℃保存。

对延伸产物进行3倍稀释后，采用离子交换树脂进行脱盐纯化，点样至384孔SpectroCHIP芯片。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）平台（Sequenom MassARRAY 系统）检测。不同等位基因由于延伸引物结合 ddNTPs 的分子量差异，产生特异性质量位移峰。最终采用 Typer 4.0 软件解析质谱峰图谱，实现 SNP 位点的自动化基因分型。

1.7 统计分析

1.7.1 遗传数据分析

基于苏禽4号母系（M系）母鸡群体，利用Excel软件计算GTF2A1基因g.40334089G>C与g.40341114A>G位点的等位基因频率（allele frequency，AF）、基因型频率（genotype frequency，GF）、期望杂合度（expected heterozygosity，He）、多态信息含量（polymorphism information content，PIC）及有效等位基因数（effective number of alleles，Ne）；通过卡方检验（χ²）评估Hardy-Weinberg平衡状态，并采用Hapoview v4.1软件分析2个SNP位点间的连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）。

1.7.2 SNP位点与产蛋性状的关联分析

采用IBM SPSS Statistics 27.0软件，对GTF2A1基因SNP位点与开产日龄（age at first egg，AFE）、开产体质量（body weight at first egg，BWF）、开产蛋质量（weight of the first egg，WFE）、300日龄平均蛋质量（average egg weight at 300 days of age，EW300）及300日龄产蛋数（ egg number to 300 days of age，EN300）的关联性进行单变量方差分析（UNIANOVA），评估基因型对产蛋性状的影响。数据以“平均值±标准误”表示，基因型间差异显著性经LSD法多重比较判定，P<0.05为差异显著。

1.7.3 转录因子结合位点分析

利用MEME网站（https：//meme-suite.org）分析GTF2A1基因SNP位点短序列模式保守基序^［12］，利用Tomtom插件对GTF2A1基因SNP位点保守基序转录因子结合区域进行分析^［13］，利用GOMo插件对GTF2A1基因SNP位点保守基序进行功能预测^［14］。

2 结果与分析

2.1 鸡GTF2A1基因SNP位点筛选

对引物P1至P6的DNA混合池样本的扩增产物进行测序，在苏禽4号母系（M系）母鸡GTF2A1基因5'非翻译区（5' UTR）区鉴定到1个SNP位点（g.40334089G>C），在外显子3（exon 3）区鉴定到1个SNP位点（g.40341114A>G）（图1）。经Ensembl数据库分析发现，GTF2A1基因转录起始是反向的，因此g.40334089G>C突变未引起调控元件的变化，为颠换突变；g.40341114A>G突变属于转换突变，未引发氨基酸改变，为同义突变。

2.2 鸡GTF2A1基因 SNP位点质谱分析

384只苏禽4号母系（M系）母鸡GTF2A1基因2个SNP位点基因型质谱分析结果见图2。

由图2可知，苏禽4号母系（M系）母鸡GTF2A1基因g.40334089G>C位点存在GG、CG和CC等3种基因型（图2-A），检出率为99.7%（383/384）；g.40341114A>G位点存在AA、GA和GG等3种基因型（图2-B），检出率为99.5%（382/384）。

2.3 鸡GTF2A1基因SNP位点群体遗传学分析

分别根据GTF2A1基因g.40334089G>C和g.40341114A>G位点分型结果，统计苏禽4号母系（M系）母鸡2个位点的基因型频率和等位基因频率，结果见表3。由表3可知，苏禽4号母系（M系）在g.40334089G>C位点以GG基因型为主，G等位基因频率明显高于C等位基因； g.40341114A>G位点以AA基因型为主，A等位基因频率明显高于G等位基因。Hardy-Weinberg平衡检验结果（表4）显示，2个SNP位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态，g.40334089G>C位点He和PIC分别为0.29和0.25，g.40341114A>G位点He和PIC分别为0.42和0.33。鉴于g.40334089G>C和g.40341114A>G位点的期望杂合度数值均落在0.25~0.5，且多态信息含量均未超过0.5的中度多态阈值，据此判定2个SNP位点均为中度多态。

2.4 鸡GTF2A1基因2个SNP位点连锁不平衡与单倍型分析

LD分析结果见图3。由图3-A可知，本研究GTF2A1基因g.40334089G>C和g.40341114A>G位点的LOD值为57.58，依据MORTON^［15］提出的连锁分析显著性标准（LOD>3.0，对应P<0.000 1）可知，这2个SNP位点存在连锁的概率极高，显著降低了假阳性风险。GTF2A1基因g.40334089G>C和g.40341114A>G位点的|D'|值为1.0，R²值为0.508，依据经典阈值标准^［16］（|D'|>0.80且R²>0.33）可知，2个SNP位点处于高强度连锁不平衡状态。

g.40334089G>C与g.40341114A>G之间的强连锁关系产生了3种单倍型：H1 （GA，频率=0.707）、H2（CG，频率=0.174） 和 H3 （GG，频率=0.119）（图3-B）。单倍型组合形成的基因型及其频率详见表5。由表5可知，本研究共检测到6种单倍型组合个体，其中H1H1和H2H1为优势单倍型组合；未检测到H1H2、H1H3和H3H2单倍型组合个体。

2.5 鸡GTF2A1基因SNP位点多态性与产蛋性状的关联性分析

对苏禽4号母系（M系）母鸡群体GTF2A1基因g.40334089G>C和g.40341114A>G位点与产蛋性状进行关联性分析，结果见表6。由表6可知，g.40334089G>C和g.40341114A>G位点不同基因型之间的部分产蛋性状指标存在显著差异，其中g.40334089G>C位点GG基因型个体开产日龄显著早于CC及CG基因型个体（P<0.05），300日龄产蛋数显著高于CC和CG基因型个体（P<0.05）；CC基因型个体300日龄蛋质量显著高于CG与GG基因型个体（P<0.05），GG基因型个体的300日龄蛋质量最低；g.40341114A>G位点AA基因型个体开产日龄显著早于GA与GG基因型个体（P<0.05），300日龄产蛋数显著高于GA和GG基因型个体（P<0.05）。

2.6 鸡GTF2A1基因单倍型组合与产蛋性状的关联性分析

对苏禽4号母系（M系）群体中GTF2A1基因单倍型组合与产蛋性状的关联性进行分析，结果如表7所示。

表7显示，不同单倍型组合个体300日龄产蛋数存在显著差异（P<0.05），其中H1H1（GGAA）单倍型组合个体的300日龄产蛋数最高，显著高于H2H1（CGGA）、H2H2（CCGG）、H2H3（CGGG）及H3H1（GGGA）单倍型组合个体（P<0.05）；与H3H3（GGGG）单倍型组合个体的300日龄产蛋数无显著差异，但比其多7.37枚。不同单倍型组合个体的开产日龄存在显著差异，单倍型组合H3H3（GGGG）个体的开产日龄显著早于单倍型组合H2H1（CGGA）和H2H2（CCGG）个体（P<0.05），与单倍型组合H1H1（GGAA）、H2H3（CGGG）和H3H1（GGGA）个体的开产日龄差异虽不显著，但比其分别早1.98，6.67和5.79 d。

2.7 鸡GTF2A1基因 SNP位点碱基变化对保守基序和转录因子的影响

利用MEME网站分析GTF2A1基因突变位点的保守基序，结果发现g.40341114A>G位点有一个保守基序：CCTGCAGCTGGTCAGCAGCAGCC-R（A/G）CAGC，g.40334089G>C位点没有保守基序。用Tomtom分析GTF2A1基因SNP位点保守基序与转录因子的结合能力，发现g.40341114A>G位点A→G突变使保守基序与转录因子Myod1的结合能力增强（图4-A）；G→A突变使保守基序与转录因子REST和PPARG的结合能力增强（图4-B，C），用GOMO对GTF2A1基因g.40341114A>G位点保守基序进行功能预测，结果发现该保守基序参与了小GTP酶介导的信号转导、蛋白质转运、葡萄糖代谢过程等生物过程及趋化因子活性、GTP结合等分子功能（图5）。

3 讨 论

3.1 鸡GTF2A1基因群体遗传学分析

本试验对苏禽4号母系（M系）mRNA区域进行一代测序分析，结果发现了2个SNP位点，即g.40334089G>C和g.40341114A>G位点，其中G→C属于颠换突变，A→G属于转换突变，且为同义突变。这2个SNP位点均有3种基因型，均处于Hardy-Weinberg平衡状态。遗传参数分析结果表明，在所检测的2个中性位点上，苏禽4号母系（M系）群体目前没有受到强烈的近亲繁殖^［17］、选择或其他导致基因型频率失衡因素^［18］的影响，符合随机交配大群体的基本特征。该结果为后续的关联分析等研究提供了合格的群体遗传学基础。群体的遗传丰富度与遗传多样性呈正相关，遗传多样性常通过期望杂合度和多态信息含量等指标进行度量^［19］。g.40334089G>C和g.40341114A>G位点均为中度多态，表明本试验的育种群拥有丰富的遗传变异可供选择和利用，世代扩繁的后代具有更高的遗传多样性，能产生更强的杂种优势，且具有更强的环境变化适应能力，可减小近交衰退的风险，具有更大的选择潜力。

3.2 鸡GTF2A1基因多态性与产蛋性状的关联性分析

GTF2A1基因被鉴定为现代家鸡中与高产蛋频率相关的驯化基因^{［9-10，20］}。YUAN等^［11］用GWAS方法对白来航鸡和东乡绿壳蛋鸡正反交后代进行全基因组扫描，共鉴定出3个与产蛋性状相关的SNP位点，其中位于5号染色体GTF2A1基因上的rs317449530（Gallus gallus 4.0版本基因组位置：40101576，3' UTR）A→G突变和rs313187645（Ga‐llus gallus 4.0版本基因组位置：40106943，内含子7）A→G突变均与产蛋前期（21至26周龄）产蛋数显著相关，rs317449530、rs313187645和rs317282‐705（Gallus gallus 4.0版本基因组位置：40121093，5' UTR）C→T突变均与21至40周龄产蛋数显著相关。本试验发现，g.40334089G>C和g.40341114A>G位点均与苏禽4号母系（M系）的开产日龄和300日龄产蛋数显著相关。本试验与YUAN等^［11］的研究结果在SNP位点和相关性分析结果方面存在差异，这可能是由品种及参考基因组不同引起的。

基因突变可发生在基因组多个功能区域，包括非翻译区（UTR）、编码区和内含子区域，不同位点的突变通过不同分子机制影响基因表达、蛋白质功能或调控网络，进而导致表型变异^［21］。本试验中g.40334089G>C位于5' UTR，g.40341114A>G位于外显子3区域，g.40334089G>C没有引起调控元件的变化，g.40341114A>G为同义突变，但5' UTR突变可干扰mRNA翻译起始复合物的组装^［22］，外显子区域的突变也可能引起蛋白质合成异常^［23］，从而导致这2个位点突变均与开产日龄和300日龄产蛋数显著相关。

蛋白质-蛋白质相互作用通常由一个蛋白质中的保守基序和另一个蛋白质中的结构域介导，从而引起细胞功能的变化^［24］。本试验g.40341114A>G位点G→A突变使保守基序与转录因子REST和PPARG的结合能力增强，该位点AA基因型个体的开产日龄更早，300日龄产蛋数更高，说明保守基序与REST和PPARG结合能力的增强可能调控了GTF2A1基因的表达，从而使产蛋性状得到提升。

表型变异由单一位点突变或多SNP连锁效应介导^［25］。通过连锁不平衡分析定位共遗传位点，可进一步揭示非等位基因的多位点互作，从而系统解析表型变异的遗传基础^［26］。本研究发现，GTF2A1基因g.40334089G>C和g.40341114A>G位点存在强连锁不平衡。交配模式、群体混合与选择压力共同调控群体内SNP连锁不平衡的构建与维持^［27］。本试验选用的苏禽4号母系（M系）经过6个世代的选育，选择压力较强，可能导致了2个SNP位点的强连锁。2个位点的强连锁出现3种单倍型，其中H1（GA）单倍型频率最高（0.707），H3（GG）单倍型频率最低（0.119），根据AKEY^［28］理论，高频率GA可能为祖先中最早出现的单倍型。本研究中仅检测到6种单倍型组合，少于理论值（9种），其原因可能是样本量有限未能覆盖低频组合，或自然选择对某些单倍型组合产生了淘汰作用。

本试验g.40334089G>C和g.40341114A>G 2个SNP位点强连锁产生的单倍型组合H1H1（GGAA）的基因型频率最高（0.49），且与300日龄产蛋数显著相关（P<0.05），个体300日龄产蛋数最高，平均为98.62枚，显著高于其他单倍型组合个体；单倍型组合H3H3（GGGG）与开产日龄显著相关（P<0.05），其个体开产日龄最早，为146.17 d，但其基因型频率较低（0.01）。本试验发现，GGAA基因型个体300日龄产蛋数虽然最高，但开产日龄比GGGG基因型个体迟1.98 d，GGGG基因型个体的开产日龄虽然最早，但300日龄产蛋数比GGAA基因型个体少7.37枚，因此这2个基因型在产蛋性状上表现出权衡关系。种鸡选育以提升总产蛋数为首要目标，因此GGAA基因型具有潜在优势。单一位点多态性分析对揭示基因-性状相关性存在局限性，同时对多个位点的综合效应进行分析才能准确得出基因与性状的真实相关性^［29］。本研究提示，在苏禽4号母系（M系）育种中可将单倍型组合H1H1（GGAA）作为产蛋性状的重要分子标记，优先选择GGAA基因型个体作为亲本，以加速母系选育进程。本试验结果为产蛋性状的分子标记辅助选择提供了依据。

4 结 论

在苏禽4号母系（M系）GTF2A1基因mRNA区筛选到g.40334089G>C和g.40341114A>G位点，2个SNP位点均存在3种基因型且符合Hardy-Weinberg平衡，均与苏禽4号母系（M系）母鸡的开产日龄及300日龄产蛋数显著相关。2位点强连锁，形成H1（GA）、H2（CG）、H3（GG）3种单倍型，其中优势单倍型H1（GA）频率为0.707。H1H1（GGAA）单倍型组合个体的300日龄产蛋数显著高于除H3H3（GGGG）单倍型组合个体外的其他组合（P<0.05）；H3H3（GGGG）单倍型组合个体开产日龄最早；H1H1（GGAA） 单倍型组合个体在开产日龄与300日龄产蛋数上综合效应最优。单倍型组合 H1H1（GGAA） 可作为苏禽4号母系（M系）产蛋性状分子标记辅助育种的候选标记。

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