灰杨COPT蛋白家族成员鉴定及镉胁迫下的表达分析

Identification of COPT protein family members in Populus ×canescens and expression analysis under cadmium stress

摘要

目的 鉴定灰杨（Populus×canescens）铜转运蛋白（PcCOPT）家族成员，明确PcCOPTs基因响应Cd胁迫的表达模式。 方法 以灰杨（Populus×canescens）为试验材料，利用生物信息学方法对PcCOPT家族成员进行鉴定、蛋白质序列特征分析、亚细胞定位预测、系统发育分析、共线性分析及顺式作用元件分析；使用MEGA11构建系统进化树；使用TBtools对PcCOPT家族成员的基因结构、保守基序、染色体定位、共线性等进行可视化分析；通过RT-qPCR技术分析PcCOPT家族成员的组织表达模式以及响应Cd胁迫的表达特征。 结果 从灰杨基因组中共鉴定出7个无内含子的COPT基因，分布在1，6和9号染色体上。蛋白质序列特征分析结果表明，编码PcCOPT家族蛋白的氨基酸序列长度为141~159 个氨基酸，相对分子质量为15.73~17.64，理论等电点为6.15~9.99。亚细胞定位预测结果表明，PcCOPT1、PcCOPT2、PcCOPT3、PcCOPT6和PcCOPT7定位在细胞质膜上，PcCOPT4和PcCOPT5定位在液泡膜上。系统发育分析显示，PcCOPT家族分为3个进化分支，其中第一分支包含PcCOPT1，PcCOPT6和PcCOPT7，第二分支包含PcCOPT2和PcCOPT3，第三分支包含PcCOPT4和PcCOPT5。共线性分析结果显示，在灰杨基因组内有2对共线性基因，灰杨与拟南芥之间有6对共线性基因，灰杨与水稻之间有4对共线性基因。顺式作用元件分析结果表明，PcCOPTs基因启动子区包含多个光响应、激素应答和非生物胁迫响应元件。PcCOPTs基因表达具有组织特异性，其中PcCOPT2、PcCOPT3在根中高度表达，PcCOPT1在木质部特异性表达，PcCOPT4、PcCOPT6和PcCOPT7在幼叶中表达水平较高，PcCOPT5在根和木质部中表达水平较高。与对照相比，在Cd胁迫下，第一分支成员PcCOPT1、PcCOPT6和PcCOPT7表达量显著升高；第二分支PcCOPT2和PcCOPT3在Cd胁迫72 h后表达量显著降低；第三分支成员PcCOPT5表达量升高，但PcCOPT4表达量显著降低。 结论 从灰杨基因组中共鉴定出7个PcCOPT基因，分为3个分支。其中第一分支成员PcCOPT1、PcCOPT6和PcCOPT7的表达受Cd胁迫诱导表达，第二分支成员PcCOPT2和PcCOPT3的表达受Cd胁迫抑制，第三分支成员PcCOPT4和PcCOPT5在Cd胁迫下表达量变化趋势相反。表明PcCOPTs成员可能具有功能分化，在灰杨响应Cd胁迫过程中发挥不同作用。

Abstract

Objective The study aims to identify the COPT family members in Populus×canescens and clarify the expression patterns of PcCOPT genes in response to cadmium （Cd） stress. Method Using Populus×canescens as materials，bioinformatic approaches were used to identify the members of the PcCOPT family， analyze the characteristics of protein sequences，predict the subcellular localization，and conduct phylogenetic analysis，collinearity analysis，and cis-acting element analysis.MAGE11 was used to construct a phylogenetic tree.The gene structures，conserved motifs，chromosome locations，and collinearity of PcCOPT family members were visualized using TBtools.Reverse transcription-quantitative PCR was carried out to analyze the tissue-specific expression patterns of PcCOPT family members and their expression characteristics in response to Cd exposure. Result Seven putative intron-lacking PcCOPT genes were identified in the genome of Populus×canescens，located on chromosome 1，6 and 9.Protein sequence analysis showed that the encoded PcCOPT family proteins consisted of 141-159 amino acid residues，with relative molecular weights ranging from 15.73 to 17.64 and the theoretical isoelectric point between 6.15 and 9.99.The prediction of subcellular localizations showed that PcCOPT1，PcCOPT2，PcCOPT3，PcCOPT6 and PcCOPT7 were located on the plasma membrane，while PcCOPT4 and PcCOPT5 were located on the vacuole membrane.The phylogenetic analysis exhibi-ted that the PcCOPT family members were divided into three clades.The first clade included PcCOPT1，PcCOPT6，and PcCOPT7，the second clade included PcCOPT2 and PcCOPT3，and the third clade included PcCOPT4 and PcCOPT5.Collinearity analysis showed that there were two pairs of collinear genes within the Populus×canescens genome，six pairs of collinear genes between the genomes of Populus×canescens and Arabidopsis thaliana，and four pairs of collinear genes between the genomes of Populus×canescens and Oryza sativa. Cis-acting element analysis revealed that the promoters of PcCOPTs genes contained multiple regulatory elements related to light，hormone or abiotic stress response.RT-qPCR analysis revealed tissue-specific expression patterns among PcCOPT genes.PcCOPT2 and PcCOPT3 were highly expressed in the roots of P.×canescens， PcCOPT1 was relatively highly expressed in xylem，PcCOPT4，PcCOPT6 and PcCOPT7 exhibited high expression levels in the young leaves，and PcCOPT5 were expressed at relatively high levels in roots and xylem. Under cadmium （Cd） stress，the expression levels of PcCOPT1，PcCOPT6 and PcCOPT7 in the first clade were markedly upregulated.In contrast，the transcript levels of PcCOPT2 and PcCOPT3 in the second clade were obviously decreased after 72 h of Cd treatment.In the third clade，the mRNA level of PcCOPT5 was increased，while that of PcCOPT4 was significantly decreased upon Cd exposure. Conclusion This study identified seven PcCOPTs in Populus×canescens，which were divided into three clades.Under Cd stress，PcCOPT1， PcCOPT6 and PcCOPT7 in the first clade were induced，PcCOPT2 and PcCOPT3 in the second clade were repressed，and PcCOPT4 and PcCOPT5 of the third clade showed opposite trends.These results demonstrated that different PcCOPTs may have functional differentiation and play different roles in mediating Cd response.

Graphical abstract

关键词

灰杨 / COPT基因家族 / 基因表达 / Cd胁迫

Key words

Populus×canescens / COPT gene family / gene expression / cadmium stress

镉（cadmium，Cd）是一种毒性大、迁移性强的重金属，全球约有9%的表层土壤Cd含量超标^［1］。土壤中的Cd通过食物链进入人体，严重威胁人类健康^［2-3］。目前，Cd污染土壤的修复方法主要有3类：物理修复法、化学修复法和生物修复法^［4］。其中生物修复法中的植物修复法通过植物根系吸收土壤中的Cd，将其转移、贮存到地上部分，进而通过收割地上部分进行集中处理。与物理修复法和化学修复法相比，植物修复法具有环境友好、成本低廉等优点^［5］。多种草本植物如天蓝遏蓝菜（Noccaea caerulescens）^［6］、宝山堇菜（Viola baoshanensis）^［7］和龙葵（Solanum nigrum）^［8］等被鉴定为Cd超积累植物，其地上部分Cd含量超过100 μg/g。近年来，杨树（Populus L.）等速生木本植物因其适应能力强，根系发达，生物量大，地上部分Cd积累量大，被认为是修复Cd污染土壤的优良材料^［9-10］。金属转运蛋白在杨树吸收、转运和积累Cd的过程中发挥重要作用。天然抗性相关巨噬细胞蛋白（natural resistance-associated macrophage protein，NRAMP）和镉诱导蛋白AS（cadmium-induced protein AS，CIPAS）等参与杨树根系对Cd的吸收 ^［11-12］。灰杨PcNRAMP1定位在细胞质膜上，主要在根中表达，介导根从土壤中吸收Cd ^［11］。胡杨（P.euphratica）细胞质膜定位的PeCIPAS8也在根中高表达，过表达PeCIPAS8会增加转基因杨树根对Cd的吸收速率，提高了根中Cd含量^［12］。黄色条纹样蛋白（yellow stripe-like protein）参与杨树茎中Cd的横向运输过程^［13］。灰杨PcYSL3是质膜定位蛋白，在木质部特异性高表达，参与木质部导管向相邻木射线细胞卸载Cd过程，显著增加木材和皮中的Cd含量^［13］。利用基因工程技术调控金属转运蛋白表达，可进一步增强杨树富集Cd的能力，提高植物修复效率^［13-15］。

吸收型铜转运蛋白（copper transporter， COPT/Ctr）是一类定位在细胞质膜或内膜系统上的二价阳离子转运体^［16］。COPT蛋白具有3个保守的跨膜结构域（transmembrane domain，TMD），其中TMD2包含1个MXXM基序（M为甲硫氨酸，Met），负责调节转运蛋白孔径；TMD3包含1个GXXG基序（G为甘氨酸，Gly），使3个跨膜结构域（TMD）形成紧密的螺旋结构^［17-19］。研究表明，MXXM和GXXG基序对二价阳离子的转运活性至关重要^［18］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中有6个COPTs成员^［20］，其中AtCOPT1、AtCOPT2和AtCOPT6氨基酸序列相似度高，且均定位在细胞质膜上，主要负责将胞外的Cu²⁺转运到细胞内^［20］；AtCOPT3和AtCOPT5分别定位在内质网膜和液泡膜上，负责将Cu²⁺外排到细胞质中^［21-22］；AtCOPT4本身不具备Cu²⁺转运活性，但可通过与其他COPT蛋白形成复合体转运二价阳离子^［23］。COPT蛋白不仅参与Cu²⁺稳态调控过程，而且参与细胞对Cd的吸收和转运^［24-25］。拟南芥AtCOPT1基因主要在主根和侧根根尖表达，AtCOPT2基因主要在根毛细胞表达，在Cd胁迫后二者的表达水平均显著上升^［25-26］。AtCOPT6在茎、叶和侧根中高表达，但其表达同样受Cd胁迫诱导^{［20， 25］}。与野生型植株相比，在Cd胁迫下，拟南芥copt1‐1突变体的根长显著变短，且copt1，2，6三重突变体根长的降低幅度进一步加剧^［25］。AtCOPT3主要在叶和花中表达，AtCOPT4和AtCOPT5在主根中高水平表达^［21-23］。在Cd胁迫后，AtCOPT3，AtCOPT4和AtCOPT5的表达量均无显著变化^［25］。然而，鲜有COPTs在杨树中参与Cd转运过程的报道。

课题组前期对7种杨树Cd富集能力的比较发现，与美洲黑杨（P.deltoides）、欧美杨（P.×euramericana）、84K杨（P.alba×P.glandulosa）、欧洲黑杨（P.nigra）、群众杨（P.popularis）和中华长青杨（P.cathayana）相比，灰杨（P.×canescens）对Cd的吸收和耐受能力最强，其地上部分Cd富集总量可达到3 000 μg/g ^［27-28］。表达谱分析发现，PcCOPT5在灰杨茎木质部和根中高表达，在Cd胁迫后表达上调。在酵母细胞中异源表达PcCOPT5导致其对Cd胁迫的敏感性增加^［13］。这表明PcCOPT基因可能参与灰杨对Cd的转运过程。然而，目前灰杨COPT基因家族尚未得到系统性鉴定。为此，本研究以灰杨为对象，利用生物信息学技术，从全基因组水平鉴定PcCOPT家族成员，并分析PcCOPTs的基因结构、系统进化和蛋白保守基序，明确PcCOPTs基因的组织表达模式以及对Cd胁迫的响应特征，为解析PcCOPTs基因的生物学功能及其调控杨树响应Cd胁迫的作用机制奠定基础，同时也为利用基因工程技术提高杨树Cd富集能力提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 灰杨PcCOPT家族成员鉴定

从Phytozome基因组数据库（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）下载灰杨基因组序列。从拟南芥基因组网站（https：//www.arabidopsis.org/）下载AtCOPT家族基因的氨基酸序列，通过BLASTP和hmmsearch程序（TBtools，v2.056）对灰杨基因组进行搜索，利用在线工具CD-Seach（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）对搜索到的灰杨PcCOPTs进行结构域鉴定，最终筛选出7个灰杨PcCOPT基因。毛果杨和水稻COPTs氨基酸序列来自Phytozome基因组数据库（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）。利用Expasy ProtParam tool（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）得到PcCOPT家族成员的相对分子质量和理论等电点。利用在线工具（https：//wolfpsort.hgc.jp）预测PcCOPT蛋白的亚细胞定位。

1.2 灰杨PcCOPT家族系统进化树的构建

利用Clustal软件将7条灰杨（P.×canescens）、7条毛果杨（P.trichocarpa）、6条拟南芥（A.thaliana）和7条水稻（Oryza sativa）COPT氨基酸序列进行多重序列比对。在MEGA11软件中，将上述比对的COPTs氨基酸序列使用邻接法（neighbor-joining method）构建系统进化树。

1.3 灰杨PcCOPTs基因结构和蛋白保守基序分析

利用灰杨基因组注释文件，采用TBtools软件的Gene Density Profile程序计算灰杨基因组的基因密度，并提取灰杨PcCOPT家族成员的染色体位置信息。在MEME网站（http：//meme-suite.org/tools/streme）进行PcCOPT蛋白的保守基序分析。利用TBtools软件将灰杨PcCOPTs基因结构和保守基序进行可视化。

1.4 灰杨PcCOPTs染色体定位及共线性分析

基于灰杨基因组GFF注释文件，使用TBtools软件绘制PcCOPTs的染色体定位图。利用TBtools软件的MCScanX程序对灰杨种内及灰杨与拟南芥、水稻种间的COPTs进行共线性分析，并通过TBtools软件对种内和种间共线性结果进行可视化。

1.5 灰杨PcCOPTs顺式作用元件分析

使用TBtools软件从灰杨基因组中提取PcCOPTs基因起始密码子上游2 000 bp序列作为启动子，将灰杨7个PcCOPT基因启动子序列上传至PlantCARE网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm），预测PcCOPTs基因启动子区域的顺式作用元件，并利用Excel对预测结果进行统计与整理。

1.6 灰杨PcCOPTs基因组织表达模式分析

灰杨组培苗保存于中国林业科学研究院林木遗传育种全国重点实验室。将灰杨在含有1/2 MS培养基中生长5周，选择生长状态一致的灰杨组培苗移栽至人工气候室中进行水培，培养溶液为1/4 Hoagland营养液，培养条件：昼/夜温度为25 ℃/18 ℃，相对湿度为50%~60%，光照周期16 h/8 h。水培2月后，选择长势一致的杨树，收集每个植株的幼叶、成熟叶、皮、木质部和根组织。使用CTAB法提取各组织RNA，参考CHANG等^［29］建立的方法略有改动。利用PrimeScript™ RT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa，大连）试剂盒去除灰杨基因组DNA，并将纯化后的RNA反转录为cDNA。利用Oligo 7软件设计PcCOPTs特异引物（详见表1），并利用TB Green^® Premix Ex Taq^TM （Tli RNase H Plus）（TaKaRa，大连）进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析。RT-qPCR反应体系为：TB Green^® Premix Ex Taq^TM（Tli RNase H Plus） （2×）10 µL，cDNA 1 µL，上、下游引物各0.5 µL，ddH₂O 8 µL。RT-qPCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s， 40个循环。每个组织3个生物学重复和4个技术重复。以PcActin2/7作为内参基因，使用2^-∆∆Ct 法计算各组织中PcCOPTs的相对表达量。

1.7 灰杨PcCOPTs基因表达对Cd胁迫的响应

选择生长1个月的灰杨组培苗，在人工气候室中水培2月后，将长势相同的灰杨水培苗平均分为5组，每组3株，其中1组作为对照，其余4组分别用100 μmol/LCdCl₂ 处理6，12，36和72 h，处理结束后，收获灰杨的木质部。使用CTAB法提取灰杨木质部RNA，参考CHANG等^［29］建立的方法略有改动，并将其反转录为cDNA，以cDNA作为模板进行RT-qPCR扩增。PcCOPTs特异性引物信息详见表1。RT-qPCR反应体系：TB Green^® Premix Ex Taq^TM （Tli RNase H Plus） （2×）10 µL，cDNA 1 µL，上、下游引物各0.5 µL，ddH₂O 8 µL。RT-qPCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，扩增40个循环。每个样品4次技术重复。以PcActin2/7作为内参基因，使用2^-∆∆Ct 法计算Cd胁迫处理后不同时间点PcCOPTs基因的相对表达量。

1.8 数据统计与分析

使用Statgraphics Centurion软件对试验数据进行统计分析，采用单因素方差分析对基因的表达模式进行分析。使用最小显著性差异法对组间差异显著性进行检验，以P<0.05被认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 灰杨PcCOPT家族成员分析

通过BLASTP和hmmsearch程序对灰杨基因组进行搜索，鉴定得到7个灰杨COPT成员。根据基因在染色体上的位置，将灰杨COPT蛋白命名为PcCOPT1~PcCOPT7。蛋白质序列特征分析结果表明，编码PcCOPT家族蛋白的氨基酸序列长度为141~159 个氨基酸，相对分子质量为15.73~17.64 ku，理论等电点为6.15~9.99。通过对7个PcCOPT成员进行亚细胞定位预测，发现PcCOPT1、PcCOPT2、PcCOPT3、PcCOPT6和PcCOPT7均定位在细胞质膜上，PcCOPT4和PcCOPT5定位在液泡膜上（表2）。

2.2 灰杨PcCOPT家族系统进化分析

为分析PcCOPTs的进化关系，将灰杨、毛果杨、拟南芥和水稻中的COPTs氨基酸序列进行多重序列比对，并构建系统进化树。结果（图1）显示，4个物种共27个COPT蛋白被分成4个分支。其中第一分支包含3个PcCOPT蛋白，分别为PcCOPT1，PcCOPT6和PcCOPT7；第二分支包含2个PcCOPT蛋白，分别为PcCOPT2和PcCOPT3，二者均与拟南芥AtCOPT4的亲缘关系较近；第三分支包含2个PcCOPT蛋白，分别为PcCOPT4和PcCOPT5，均与拟南芥AtCOPT5的亲缘关系相近；第四分支不包含灰杨PcCOPTs。

2.3 灰杨PcCOPT家族基因结构及其编码蛋白的保守基序分析

为进一步分析PcCOPTs的序列特征，对其基因结构及蛋白保守基序进行分析，结果（图2）显示，7个灰杨PcCOPT均无内含子。由图2还可知，利用MEME网站对7个灰杨PcCOPT蛋白进行保守基序预测，共鉴定到5个保守基序，且所有PcCOPT家族成员的N-端均含有基序2（motif 2），C-端均含有基序1（motif 1）。位于第一分支的PcCOPT1、PcCOPT6和PcCOPT7均含有5个保守基序，且保守基序的分布一致。与其他分支中的COPT蛋白不同，第一分支中COPT蛋白N-端包含motif 4，C-端包含motif 5。位于第二分支的PcCOPT2和PcCOPT3均含有motif 1、motif 2、motif 3，且保守基序的位置相同。位于第三分支的PcCOPT4和PcCOPT5只在N-端含有motif 2，C-端含有motif 1。上述结果表明，同一进化分支内PcCOPTs含有相似的保守基序，说明其可能具有相似的功能；不同分支COPT蛋白C-端和N-端保守基序具有差异，暗示其基因功能可能出现分化。

2.4 灰杨PcCOPT家族基因的染色体定位

如图3所示，7个灰杨PcCOPT基因分布在Chr1、Chr6和Chr9等3条染色体上。其中位于6号染色体的PcCOPTs数量最多，分别是PcCOPT2、PcCOPT3、PcCOPT4和PcCOPT5；9号染色体包含PcCOPT6和PcCOPT7；1号染色体仅包含PcCOPT1。

2.5 灰杨PcCOPT家族基因的共线性分析

为了分析PcCOPTs在灰杨基因组中的复制事件，对PcCOPTs进行种内共线性分析。结果（图4-A）显示，在7个灰杨PcCOPT基因中共存在2对共线性关系，分别是PcCOPT1与PcCOPT2和PcCOPT4与PcCOPT5。

为进一步探究PcCOPTs在不同植物间的进化关系，分别对灰杨与拟南芥、灰杨与水稻的PcCOPTs进行种间共线性分析。结果（图4-B）显示，灰杨与拟南芥之间有6组基因存在共线性关系，灰杨与水稻之间有4组基因存在共线性关系。其中位于灰杨1号染色体的PcCOPT1与拟南芥之间存在3个共线性基因对。与水稻相比，灰杨PcCOPTs可能与拟南芥的亲缘关系更近，推测上述基因可能从共同祖先的基因组中进化而来。

2.6 灰杨PcCOPT家族基因顺式作用元件分析

为了预测PcCOPTs的生物学功能，对PcCOPTs基因上游启动子区域的顺式作用元件进行分析。结果表明，PcCOPTs基因上游启动子区域主要有4类顺式作用元件，分别为植物生长与发育响应元件、激素响应元件、光响应元件及生物与非生物胁迫响应元件，且生物与非生物胁迫响应元件分布数量最多。激素响应元件主要包含乙烯响应元件，光响应元件主要包括Box 4和GT1-motif元件，生物与非生物胁迫响应元件数量最多的是MYB元件，在所有PcCOPTs基因上游启动子区域均有分布，且数量最多。上述结果表明，PcCOPTs基因可能在光响应、激素响应以及生物与非生物胁迫中发挥作用，尤其是在响应环境因子胁迫方面发挥着重要作用。

2.7 灰杨PcCOPTs基因的组织表达模式

基因的组织表达模式与其功能密切相关。为探究灰杨PcCOPTs基因的生物学功能，对7个灰杨PcCOPT基因进行组织表达分析。结果（图5）表明，PcCOPT6和PcCOPT7在幼叶中表达量较高，PcCOPT1在木质部表达量较高，PcCOPT3和PcCOPT2在根中特异性高表达，PcCOPT5在根和木质部中表达量较高，PcCOPT4在幼叶中具有较高的表达量。上述结果表明，灰杨PcCOPTs基因在不同组织中的相对表达量不同，暗示灰杨PcCOPT家族基因可能在功能上存在差异。

2.8 灰杨PcCOPTs基因表达对Cd胁迫的响应

由图6可知，与对照相比，在Cd胁迫6 h时，PcCOPT2、PcCOPT6和PcCOPT7的表达量显著上调；在Cd胁迫12 h时，PcCOPT6和PcCOPT7的表达量显著上调，PcCOPT2和PcCOPT4的表达量显著下调；在Cd胁迫36 h时，PcCOPT1、PcCOPT5、PcCOPT6和PcCOPT7的表达量显著上调，PcCOPT2和PcCOPT4表达量的显著下调；在Cd胁迫72 h时，7个PcCOPT家族成员的相对表达量均发生了显著变化，其中PcCOPT1、PcCOPT5、PcCOPT6和PcCOPT7的表达量显著上调，且以PcCOPT1表达量上调幅度最大（是对照相对表达量的18.1倍）；PcCOPT2、PcCOPT3和PcCOPT4的表达量显著下调，且PcCOPT2和PcCOPT3表达量下调幅度较大。上述结果表明，PcCOPT家族成员在Cd胁迫下具有不同的表达特征。

3 讨论

近年来，关于COPT家族成员参与二价阳离子吸收和转运的研究主要集中在拟南芥等草本植物中，而对木本植物COPT成员的系统性鉴定及响应Cd胁迫的表达模式研究甚少^［25］。有研究表明，定位在细胞质膜上的拟南芥AtCOPT1、AtCOPT2和AtCOPT6氨基酸序列相似程度高，在Cd胁迫下，AtCOPT1、AtCOPT2和AtCOPT6均上调表达，增加植物根部Cu²⁺含量^［20］。相似地，在本研究中，AtCOPT1、AtCOPT2和AtCOPT6与预测定位在细胞质膜上的PcCOPT2、PcCOPT3处于同一分支，表明PcCOPT2、PcCOPT3与AtCOPT1、AtCOPT2和AtCOPT6氨基酸序列相似度较高，暗示PcCOPT2、PcCOPT3可能也具有转运二价阳离子的功能。酵母互补试验结果表明，在7个水稻COPT蛋白中，只有OsCOPT7能够互补酵母突变体ctr1Δctr3Δ的生长缺陷，表明仅有OsCOPT7是高亲和力的铜转运蛋白，其他OsCOPTs多为低亲和力铜转运蛋白，多数低亲和力的水稻OsCOPTs蛋白需要与其他OsCOPTs蛋白形成复合体才能转运Cu^{2+［16，30］}。在本研究中，水稻OsCOPT1、OsCOPT2、OsCOPT3、OsCOPT4和OsCOPT5均处于第四分支，而OsCOPT6、OsCOPT7与PcCOPT4、PcCOPT5位于第三分支，暗示PcCOPT4、PcCOPT5有可能与OsCOPT7类似，具有独立转运Cu²⁺的功能。还有研究显示，COPT蛋白不仅参与Cu²⁺稳态调控过程，而且还参与细胞对Cd的吸收和转运^［24-25］。因此，PcCOPT4、PcCOPT5也可能具有Cd转运活性。在毛果杨中，PtrCOPTs的表达受到Cd诱导，在Cd胁迫3 h时，茎中PtrCOPT7的表达量显著上升^［18］。类似地，在Cd胁迫6 h时，与PtrCOPT7位于同一分支的PcCOPT2在木质部中表达量显著上调，表明灰杨COPTs也响应Cd胁迫。另外，不同物种之间COPT家族基因数目和序列具有一定的差异性，这可能与环境适应性、进化路径及基因复制事件等有关^［31-32］。在Cu²⁺缺乏条件下，缺失N-端的拟南芥COPT6的Cu²⁺转运功能被严重抑制^［20］，由此可见，N-端对于COPTs行使二价阳离子转运功能具有重要作用。灰杨COPTs保守基序分析结果显示，不同进化分支的PcCOPTs成员在N-端和C-端的保守基序类型有所不同，这可能会导致灰杨COPTs在转运二价阳离子的功能上出现差异。此外，基因复制事件有助于基因家族扩张，促进新基因的产生和功能分化^［33-34］。种内共线性分析结果发现，PcCOPT家族成员中有2个复制基因对，说明这些基因在进化过程中发生了扩张事件。种间共线性分析结果表明，灰杨与拟南芥之间的共线性关系对较多，暗示灰杨与拟南芥的COPTs基因可能具有共同祖先。PcCOPT1在灰杨基因组内，以及与拟南芥COPTs之间存在多个共线性关系对，表明PcCOPT1在进化过程中比较保守。

基因的组织表达模式与其功能密切相关。本研究发现，7个PcCOPTs基因在不同组织之间的表达量具有显著差异，暗示其功能可能不同。PcCOPTs基因启动子区含有多个光响应元件、激素响应元件以及生物与非生物胁迫响应元件，且所有PcCOPTs成员启动子区都存在多个MYB元件。由于MYB是一类参与Cd等逆境胁迫的重要转录因子^［35-36］，推测在应对Cd胁迫过程中，PcCOPTs可能受到MYB类转录因子的调控。Cd等二价金属离子的吸收和转运依赖于质膜定位的金属转运体活性。位于第二分支的PcCOPT2和PcCOPT3主要在根中表达，其编码蛋白预测定位在细胞质膜上。与之类似的是，拟南芥同源蛋白AtCOPT1、AtCOPT2和AtCOPT6定位在细胞质膜上，也在根中高度表达^{［20， 24-25］}。与对照相比，在Cd胁迫下，过表达AtCOPT6的拟南芥根长增加，但copt1，2，6三重突变体的根长显著缩短^［25］。本研究结果表明，PcCOPT1、PcCOPT6和PcCOPT7定位在细胞质膜上。与AtCOPT6相似，PcCOPT1在灰杨木质部高水平表达，在Cd胁迫72 h后相对表达量上调18.1倍，推测PcCOPT1可能参与Cd在灰杨木质部的转运。PcCOPT5定位在液泡膜上，在灰杨根中高水平表达。在Cd胁迫36~72 h下，PcCOPT5的表达水平显著升高，推测PcCOPT5可能介导液泡对Cd的跨膜转运过程。在Cd胁迫下，第一分支成员PcCOPT1、PcCOPT6和PcCOPT7总体显著上调表达，暗示PcCOPT1可能参与灰杨木质部Cd的运输。在Cd胁迫72 h后，第二分支成员PcCOPT2和PcCOPT3显著下调表达。在Cd处理下，位于第三分支的PcCOPT4显著下调表达，而PcCOPT5则显著上调表达。说明PcCOPTs基因不同分支中的成员之间可能存在功能分化，相同分支的不同成员也可能存在功能上的差异。结合PcCOPTs的结构分析，发现其所有成员都不包含内含子结构，能够减少转录后RNA的剪切过程^［37］，在植物受到Cd胁迫后，实现快速转录后加工和翻译。关于PcCOPT家族关键成员在调控杨树Cd富集过程中的分子生理功能有待进一步研究。

4 结论

本研究利用生物信息学方法对灰杨PcCOPT家族进行了系统分析，从灰杨基因组中共鉴定出7个无内含子的COPTs，分布在1，6，9等3条染色体上。系统发育分析结果显示，PcCOPTs可分为3个进化分支。PcCOPTs的表达具有组织特异性，与对照相比，在Cd胁迫72 h时，第一分支成员表达水平显著升高，第二分支成员表达量显著下降，第三分支成员PcCOPT5的表达量显著升高，但PcCOPT4的表达水平则显著降低。表明PcCOPTs成员在灰杨响应Cd胁迫过程中可能存在功能分化。该研究结果为后续解析PcCOPTs基因调控杨树富集Cd的分子生理机制提供了参考。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32371841)