发酵亚麻籽饼替代豆粕对蛋鸡血清指标及肠道微生物的影响

Effects of replacing soybean meal with fermented flaxseed meal on serum parameters and intestinal microbiota in laying hens

摘要

目的 探究生氰糖苷（cyanogenic glycosides， CGs）降解菌发酵亚麻籽饼替代豆粕对海兰褐蛋鸡生产性能、蛋品质、血清生化和抗氧化指标及肠道微生物多样性的影响。 方法 将720只健康且体质量相近的500日龄海兰褐蛋鸡随机分成4组，每组6个重复，每个重复30只鸡。对照组（Control， CON）鸡饲喂基础饲粮，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组鸡分别饲喂用发酵亚麻籽饼替代10%，30%和50%豆粕的饲粮，试验期56 d。试验结束后，分别测定蛋鸡生产性能、蛋品质、血清生化指标、抗氧化指标和肠道菌群指标。 结果 用发酵亚麻籽饼代替豆粕对蛋鸡产蛋率、平均蛋质量、料蛋比和破软蛋率均无显著影响（P>0.05）。与对照组相比，试验Ⅱ和Ⅲ组蛋黄颜色显著增加（P<0.05）；各试验组蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋壳颜色、蛋白高度和哈氏单位均无显著差异（P>0.05）。与对照组相比，试验Ⅱ和Ⅲ组血清TG含量显著下降（P<0.05），各试验组血清LDL-C水平均显著下降（P<0.05）。与对照组相比，试验Ⅰ组血清T-AOC含量显著增加（P<0.05），MDA水平显著下降（P<0.05）。蛋鸡饲粮添加发酵亚麻籽饼能显著增加蛋鸡粪便微生物Chao1指数、Ace指数和Shannon指数（P<0.05），在属水平上，能促进拟杆菌属、未分类拟杆菌属和理研菌属的相对丰度，其中Ⅱ组达显著水平（P<0.05）。 结论 综合考虑，本试验条件下，发酵亚麻籽饼替代豆粕不会对蛋鸡生产性能、蛋品质产生不利影响，且当替代水平为50%时可对蛋鸡脂质代谢、抗氧化能力及肠道健康产生有利影响。

Abstract

Objective This study aims to investigate the effects of fermenting flaxseed meal with cyanogenic glycosides （CGs）-degrading bacteria as a substitute for soybean meal on production performance，egg quality，serum biochemical and antioxidant indicators，as well as intestinal microbial diversity of Hy-line brown laying hens. Method A total of 720 healthy 500-day-old Hy-line brown layers with similar body weight were randomly divided into 4 groups，with 6 replicates per group and 30 layers per replicate.The control group （CON） was fed a basal diet，while experimental groups Ⅰ，Ⅱ，and Ⅲ received diets in which fermented flaxseed meal replaced 10%，30%，and 50% of soybean meal，respectively.The experiment lasted for 56 days.After the experiment，production performance，egg quality，serum biochemical indicators，antioxidant indicators，and intestinal flora indicators of the laying hens were measured. Result Replacing soybean meal with fermented flaxseed meal had no significant effects on laying rate，average egg weight，feed-egg ratio，and broken or soft egg rate of laying hens （P>0.05）.Compared with control group，yolk color of experimental groups Ⅱ and Ⅲ significantly increased （P<0.05），whereas no significant differences were observed on egg shape index，eggshell strength，eggshell thickness，eggshell color，albumen height，and Haugh unit among all experimental groups （P>0.05）.Serum TG was significantly reduced （P<0.05） in groups Ⅱ and Ⅲ，and serum LDL-C was significantly decreased in all treatment groups（P<0.05）.In Group Ⅰ，serum T-AOC was significantly increased （P<0.05）， while MDA was significantly decreased （P<0.05）.Adding fermented flaxseed meal to the feed of laying hens can significantly increase Chao1，Ace，and Shannon indices of fecal microbiota in laying hens （P<0.05）.At genus level，it can promote relative abundance of Bacteroides，unclassified Bacteroides，and Ruminococcus genera，with group Ⅱ reaching a significant level （P<0.05）. Conclusion Under the conditions of this experiment， the substitution of fermented flaxseed meal for soybean meal exerted no adverse effects on production performance and egg quality of laying hens.Furthermore，when the substitution level reaches 50%，it can beneficially affect lipid metabolism，antioxidant capacity，and intestinal health of laying hens.

Graphical abstract

关键词

生氰糖苷降解菌 / 亚麻籽饼 / 血清生化指标 / 抗氧化能力 / 肠道微生物 / 蛋鸡

Key words

cyanogenic glycoside-degrading bacteria / flaxseed meal / serum biochemical indices / antioxidant capacity / intestinal microbiota / laying hens

近年来，豆粕作为植物性蛋白饲料原料在畜牧生产中的需求持续增加，为了缓解畜牧生产中豆粕短缺问题，农业农村部相继出台《饲用豆粕减量替代三年行动方案》等政策，积极开辟新型饲料资源^［1］。我国地源性蛋白饲料资源丰富，但抗营养因子又限制了其在动物饲粮中的应用。亚麻籽又称胡麻籽（flaxseed），是我国西北地区常见的一种油料作物，属于典型的地源性非常规蛋白饲料原料^［2］。亚麻籽饼为亚麻籽榨油后的副产品^［3］，蛋白质含量为35%~40%^［4］，氨基酸组成合理，其饱和脂肪酸含量与豆粕相似^［5］，是替代豆粕弥补蛋白饲料资源不足的重要蛋白饲料原料之一。但相关研究表明，动物饲粮中直接添加亚麻籽饼会显著降低其生产性能^［6］，这是因为亚麻籽饼中含有生氰糖苷（cyanogenic glycosides，CGs）、亚麻籽胶和植酸等多种抗营养因子^［7］，其中CGs是影响亚麻籽饼成为饲料原料的重要因素，动物过量摄入CGs会导致氢氰酸急性中毒^［8］。通过从自然界中筛选CGs降解菌来发酵亚麻籽饼，从而降低亚麻籽饼中CGs含量，是提高亚麻籽饼利用价值的重要措施^［9］。目前，CGs降解菌的筛选及脱毒工艺研究已取得一定进展^［10］，但采用CGs降解菌发酵亚麻籽饼在蛋鸡上的应用效果尚未见报道。本试验拟在研究团队前期筛选的CGs降解菌生活条件基础上，采用实验室确定的最优发酵条件发酵亚麻籽饼，根据发酵后亚麻籽饼营养成分含量，在蛋鸡饲粮中添加不同水平的发酵亚麻籽饼替代不同比例的豆粕，研究其对蛋鸡生产性能、蛋品质、血液生化指标、抗氧化能力及肠道微生物的影响，从而为亚麻籽饼在蛋鸡饲粮中的合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

CGs降解菌株枯草芽孢杆菌XS-023，由河南省生物发酵微量元素饲料添加剂工程技术研究中心提供。亚麻籽饼，由内蒙古益善园生物科技有限责任公司提供。用枯草芽孢杆菌XS-023株对亚麻籽饼进行固态发酵，制备发酵亚麻籽饼，固态发酵条件为：菌种接种量12%、含水量42%、发酵温度37 ℃、发酵时间48 h。发酵结束后，将发酵物料于65~70 ℃烘干，经检测发酵物料枯草芽孢杆菌XS-023活菌含量为2.8×10⁸ CFU/g。亚麻籽饼发酵前粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪、粗灰分、生氰糖含量（风干基础）分别为38.47%，11.23%，10.73%，6.49%和351.25%，发酵后分别为43.90%，9.42%，11.20%，6.84%和67.07%。发酵后亚麻籽饼含大肠杆菌3.8×10³ CFU/g，含霉菌2×10³ CFU/g，未检出沙门氏菌；呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量（风干基础）分别为345.65和16.21 μg/kg，未检出黄曲霉毒素。

1.2 试验动物及基础饲粮

选取500日龄健康且体质量接近的海兰褐蛋鸡720只，随机分成4组，每组6个重复，每个重复30只鸡。对照组（control，CON）鸡饲喂基础饲粮，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组鸡分别饲喂用发酵亚麻籽饼代替10%、30%和50%豆粕的饲粮。预试期7 d，正试期56 d，预试期各组均饲喂基础饲粮。基础饲粮参照NRC（1994）、《鸡饲养标准》（NY/T33-2004）及《海兰褐蛋鸡饲养手册》配制而成。各组饲粮组成及营养水平见表1。

1.3 饲养管理

试验蛋鸡采用三层全阶梯式笼养，每笼3只鸡。鸡舍光照时间为18 h/d，每日8：00、17：00各饲喂1次，匀料2次，清粪1次。各组采用自由饮水。

1.4 样品采集与处理

试验结束时，每组随机捡取30枚鸡蛋（每个重复5枚鸡蛋），用于蛋品质的测定。试验最后一天，各组随机选取30只鸡（每个重复5只），早晨空腹采血，3 000 r/min 离心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中保存备用^［11］，用以测定血清生化指标。试验最后5 d，以重复为单位采集新鲜粪便于自封袋内，确保粪样与空气接触不超过10 min，粪样进行固氮处理后于-80 ℃冰箱保存备用。

1.5 指标测定与方法

1.5.1 生产性能及蛋品质指标测定

试验期间，每日以重复为单位，记录各组蛋鸡采食量、产蛋数、蛋质量和破软蛋数，并计算产蛋率、料蛋比和破软蛋率。

蛋品质指标测定参照文献［12］中的方法进行，蛋壳颜色、蛋白高度、蛋黄颜色和哈氏单位用蛋品质分析仪（QCH，英国）测定；蛋壳强度用强度测定仪（In-spec 2200，美国）测定；蛋形指数用游标卡尺测量纵径和横径，计算纵径/横径比；蛋壳厚度采用螺旋测微器测定蛋壳钝端、中端及锐端的厚度（已除去蛋壳内外壳膜）。

1.5.2 血清生化指标及抗氧化指标测定

血清生化指标测定：采用AVDIA2400全自动生化分析仪（西门子，美国）测定血清总胆固醇（total cholesterol，T-CHO）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量；采用比色法测定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）及谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性，试验所用试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

血清抗氧化指标：采用比色法测定总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）及谷胱甘肽过氧化氢酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）的活性；采用羟胺法测定总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）的活性，采用钼酸铵法测定过氧化氢酶（catalase，CAT）的活性，采用硫代巴比妥酸测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量^［13］。试验所用试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.5.3 肠道菌群多样性分析

试验结束后，每组6个重复，每重复收集粪样1份至灭菌管中，干冰保存送至上海元莘生物科技有限公司进行16S rDNA测序，并基于操作单元（OUT）和物种注释结果分析试验鸡肠道微生物多样性与差异性。

1.6 数据处理与分析

利用Origin2021进行数据绘图和SPSS 26.0对试验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），使用Duncan氏法和最小显著差异法（LSD）进行多重比较。所有数据用“平均数±标准差”表示，显著水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 发酵亚麻籽饼对蛋鸡生产性能的影响

由表2可知，与对照组相比，各试验组蛋鸡产蛋率、平均蛋质量、料蛋比和破软蛋率均无显著差异（P>0.05）。

2.2 发酵亚麻籽饼对蛋品质的影响

由表3可知，与对照组相比，试验Ⅱ和Ⅲ组蛋鸡蛋黄颜色显著升高（P<0.05）；各试验组蛋鸡蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋壳颜色、蛋白高度和哈氏单位与对照组相比均无显著差异（P>0.05）。

2.3 发酵亚麻籽饼对蛋鸡血清生化指标的影响

发酵亚麻籽饼替代豆粕对蛋鸡血清生化指标的影响结果见表4。由表4可知，与对照组相比，试验Ⅱ和Ⅲ组血清TG含量显著下降（P<0.05）。各试验组蛋鸡血清LDL-C水平均显著低于对照组（P<0.05）。各试验组蛋鸡血清T-CHO、HDL-C、ALT、AST及AKP水平与对照组相比均无显著差异（P>0.05）。

2.4 发酵亚麻籽饼对蛋鸡血清抗氧化能力的影响

发酵亚麻籽饼替代豆粕对蛋鸡血清抗氧化能力的影响结果见表5。由表5可知，与对照组相比，试验Ⅰ组蛋鸡血清T-AOC水平显著增加（P<0.05），同时MDA含量显著下降（P<0.05）；各试验组蛋鸡血清T-SOD、CAT及GSH-PX活性与对照组相比均无显著差异（P>0.05）。

2.5 发酵亚麻籽饼对蛋鸡肠道微生物的影响

由表6可知，从粪便微生物群落丰富度来看，各试验组OTUs数量、Chao1指数、Ace指数均显著高于对照组（P<0.05）。ɑ多样性结果表明，各试验组Shannon指数与对照组相比均有所升高，其中试验Ⅱ组显著高于对照组（P<0.05）。

由图1可知，对照组共有426个OTUs，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组分别有629，720和662个OTUs，表明各试验组蛋鸡肠道微生物菌群丰度均有所增加。

发酵亚麻籽饼替代豆粕对蛋鸡肠道菌群属水平相对丰度的影响见表7。由表7可知，用发酵亚麻籽饼替代豆粕明显增加了蛋鸡粪便菌群中拟杆菌属、未分类拟杆菌属和理研菌属的相对丰度，其中Ⅱ组达显著水平（P<0.05），并不同程度降低了嗜冷杆菌属、苏黎世杆菌属、肠球菌属和不动杆菌属的相对丰度（P>0.05）。

3 讨 论

3.1 发酵亚麻籽饼替代豆粕对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响

亚麻籽饼（粕）含有较多有毒物质和抗营养因子，如CGs、亚麻籽胶（纤维类）、植酸和抗VB6因子等，其中以CGs含量较高、毒性较大，限制了其在动物饲粮中的应用^［14］，对亚麻籽饼（粕）去毒处理是提高其利用效率的重要措施。ATTIA等^［15］采用冷压榨法处理亚麻籽并将其副产物（亚麻籽饼）按10%添加于蛋鸡饲粮中，发现不会对蛋鸡产蛋率、平均蛋质量和料蛋比产生不利影响。ATTIA等^［16］对亚麻籽饼进行浸泡处理，在12%的添加水平下，蛋鸡产蛋率、平均蛋质量和料蛋比等指标均未发生显著变化。HUANG等^［17］在蛋鸡饲粮中添加7.5%~22.5%的膨化亚麻籽，各添加水平对蛋鸡平均蛋质量、产蛋量和料蛋比均未产生显著影响。本试验用经CGs降解菌发酵的亚麻籽饼替代10%，30%和50%的豆粕，结果对蛋鸡产蛋率、平均蛋质量、料蛋比和破软蛋率均无显著影响，表明发酵方法可降低亚麻籽饼（粕）中有害物质并促进其在蛋鸡饲粮中的应用效果。本试验条件下，发酵前后CGs含量由351.25 mg/kg降至67.07 mg/kg，CGs降解率达80.91%。

亚麻籽饼（粕）中的抗营养因子也会对蛋品质产生不利影响。KHATUN等^［18］采用未经处理的亚麻籽饼饲喂蛋鸡，随着添加水平的增加，蛋黄质量呈降低趋势；随着鸡蛋贮存期的延长，蛋白高度和哈氏单位均不同程度下降 ^［19］，对亚麻籽饼进行去毒处理后可大大降低其对蛋品质的不良影响。研究表明，饲喂膨化亚麻籽对蛋壳厚度、蛋壳强度和哈氏单位无显著影响^［20］。张建民等^［21］研究发现，在蛋鸡饲粮中添加4%和6%的膨化亚麻籽饼能显著提高蛋白高度、哈氏单位和蛋黄颜色。本研究中发酵亚麻籽饼替代30%和50%的豆粕可显著提高蛋黄颜色，并不同程度地改善了蛋壳厚度和哈氏单位等指标，与前人研究结果^［21］基本一致。

3.2 发酵亚麻籽饼替代豆粕对蛋鸡血清生化指标的影响

血清T-CHO、TG、HDL-C和LDL-C是反映脂肪代谢和血脂水平的重要指标。研究认为，亚麻籽饼中的n-3 多不饱和脂肪酸（PUFAs）可通过调节线粒体功能和内质网应激来影响血清脂质代谢^［22］。此外，亚麻籽饼中的α-亚麻酸能阻止脂肪酸和三酰甘油的合成并加速脂肪酸β 氧化，有降低TG水平及抗血栓形成等功效^［23］。杨光勇等^［24］研究认为，5%的膨化亚麻籽能显著降低蛋鸡血清CHO和LDL的含量，显著增加HDL的含量。ZHAI等^［25］研究表明，与未发酵的亚麻籽饼相比，发酵亚麻籽饼能显著降低雏鸭血清TG、TC和LDL的含量。本研究中，发酵亚麻籽饼各添加水平均可显著降低蛋鸡血清LDL-C含量，且30%和50%添加水平可显著降低TG含量，与前人研究结果基本一致。

ALT和AST是反映肝脏组织是否受损的重要指标，当肝脏组织受损时，肝脏细胞中大量ALT和AST会释放到血液中，导致血液ALT和AST水平升高^［26］。赵丹阳等^［27］研究发现，在北京油鸡饲粮中添加9%的膨化亚麻籽，能显著提高血浆AST活性，显著降低血浆ALT活性。本研究中，各试验组ALT和AST活性均无显著差异，表明发酵亚麻籽饼未对蛋鸡肝脏产生损害。血清AKP水平高低可反映肝脏和骨骼器官是否受损。本研究中，各试验组AKP水平与对照组相比均无显著差异，表明发酵亚麻籽饼对蛋鸡肝脏和骨骼器官均无负面影响，这与前人研究结果^［28］基本一致。

3.3 发酵亚麻籽饼替代豆粕对蛋鸡血清抗氧化能力的影响

动物血清抗氧化指标的水平一方面可以反映机体抗氧化能力的强弱，另一方面也可以反映机体受氧化损伤的程度^［29］。郭宝珠^［8］研究发现，与未发酵亚麻籽饼相比，发酵亚麻籽饼显著提高了1~21日龄肉鸡血清T-SOD活性，并显著降低了MDA水平。本研究中，10%发酵亚麻籽饼替代组蛋鸡血清T-SOD水平显著高于对照组，MDA水平显著低于对照组，表明10%替代水平在一定程度上能降低机体的氧化损伤。这可能是因为亚麻籽饼中的木酚素具有抗氧化功能，能够提高血液抗氧化水平^［30］，也可能是亚麻籽饼在发酵过程中产生的某种活性物质的作用所致。

3.4 发酵亚麻籽饼替代豆粕对蛋鸡肠道微生物的影响

肠道微生物与动物机体代谢及健康密切相关，其数量与组成可间接反映动物机体的代谢和健康状况^［31］。本研究发现，发酵亚麻籽饼可增加蛋鸡粪便微生物的Chao1指数、Ace指数和Shannon指数，各试验组物种丰度OTUs均显著提高，试验Ⅱ组α多样性显著提高，表明发酵亚麻籽饼能增加蛋鸡肠道微生物的物种丰富度和多样性。在属水平上，发酵亚麻籽饼显著提高了蛋鸡粪便拟杆菌属和未分类拟杆菌属相对丰度。拟杆菌属是肠道中最普遍的革兰氏阴性菌，具有降解多糖、调节热量吸收及促进机体对营养物质消化吸收的作用^［32］。研究认为，增加肠道拟杆菌属丰度或拟杆菌门/厚壁菌门比值能有效缓解动物肠道应激综合征^［33］。此外，本研究还发现，用30%发酵亚麻籽饼替代豆粕可显著提高蛋鸡粪便理研菌属的丰度，而理研菌属是肠道内具有保护功能的菌群，与黏蛋白降解细菌有关，同时也与机体的脂代谢相关^［34］。

4 结 论

CGs降解菌株枯草芽孢杆菌XS-023发酵亚麻籽饼可替代豆粕，当替代比例达50%时，不会对蛋鸡生产性能及蛋品质产生不良影响，且可以显著增加蛋黄颜色。发酵亚麻籽饼可显著降低蛋鸡血清中TG和LDL-C的含量，增强机体抗氧化能力。发酵亚麻籽饼可改善蛋鸡肠道菌群丰富度和多样性，对肠道健康具有一定的促进作用。

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基金资助

河南省青年科学基金项目(212300410136)

河南岐伯实业有限公司重点研发项目(4025-22010074)