水稻籽粒碱消值的全基因组关联分析及候选基因研究

Genome‐wide association analysis and candidate gene study of alkali spreading value in rice grains

摘要

目的 糊化温度（gelatinization temperature，GT）是评价稻米蒸煮品质与食味特性的关键指标，通常通过碱消值进行间接表征，基于碱消值指标解析稻米糊化温度的遗传基础。 方法 以139份西北早粳稻种质为材料，分别在海南与宁夏两地开展田间试验，测定籽粒碱消值表型，采用一般线性模型（GLM）和FarmCPU模型进行全基因组关联分析（GWAS）。 结果 海南地区碱消值平均为5.40，变异范围为2.00~7.00，宁夏地区碱消值平均为5.17，变异范围为1.80~6.70。不同地区间该性状的变异系数较高，全基因组关联分析共检测到38个显著关联的SNP位点，其中在海南环境下两种模型共同定位到6个QTL，宁夏环境下共同定位到8个QTL，两地共同检测到2个稳定的QTL区间。基于功能注释与单倍型分析，筛选出两个关键候选基因LOC_Os09g20820和LOC_Os09g20880。在灌浆期籽粒中基因相对表达量分析发现，LOC_Os09g20820在不同单倍型（Hap1，Hap2）间表达差异显著，而LOC_Os09g20880相对表达量较低且单倍型间无显著差异。 结论 基因LOC_Os09g20820的不同单倍型在水稻籽粒碱消值表型上具有差异显著性，含有Hap2单倍型的品种中基因相对表达量始终显著高于含有Hap1单倍型的品种。LOC_Os09g20820可作为与水稻糊化温度相关的候选基因进行后续验证。

Abstract

Objective Gelatinization temperature （GT） is a key index for evaluating rice quality for cooking and eating，which is usually indirectly characterized by alkali spreading value （ASV）.Based on ASV，this study aims to dissect the genetic basis of rice GT. Method A total of 139 early japonica rice germplasm accessions from Northwest China were used as materials.Field experiments were conducted in Hainan and Ningxia，respectively.Grain ASV phenotypes were determined，and genome-wide association analysis （GWAS） was performed using the general linear model （GLM） and FarmCPU model. Result The average ASV was 5.40 in Hainan and 5.17 in Ningxia.The variation range of ASV was 2.00 to 7.00 in Hainan and 1.80 to 6.70 in Ningxia.The coefficient of variation of this trait was relatively high between different regions.A total of 38 significantly associated SNPs were detected by GWAS.6 QTLs were co-localized by the two models in Hainan，8 QTLs were co-localized by the two models in Ningxia，and 2 stable QTL intervals were commonly identified in both regions.Based on functional annotation and haplotype analysis，two key candidate genes （LOC_Os09g20820 and LOC_Os09g20880） were screened.Further analysis of relative gene expression level in grains at the filling stage revealed that LOC_Os09g20820 exhibited significant expression differences among different haplotypes（Hap1，Hap2），while LOC_Os09g20880 showed low expression level with no significant difference observed between different haplotypes. Conclusion Different haplotypes of LOC_Os09g20820 showed significant differences in rice grain ASV phenotype.The gene expression level in varieties carrying Hap2 was consistently significantly higher than that in varieties carrying Hap1.LOC_Os09g20820 can serve as a candidate gene associated with rice GT for subsequent functional verification.

Graphical abstract

关键词

水稻 / 糊化温度 / 碱消值 / 全基因组关联分析（GWAS） / 候选基因

Key words

rice / gelatinization temperature / alkali spreading value / genome-wide association analysis （GWAS） / candidate genes

水稻（Oryza sativa L.） 是全球近半数人口的主食，其产量稳定与品质优劣直接关系到世界粮食安全与人民生活水平 ^［1-2］。长期以来，水稻育种以高产为核心目标，并取得了举世瞩目的成就。然而，随着消费需求的升级，对稻米品质尤其是蒸煮食味品质（cooking and eating quality，CEQ）的要求日益提高，“高产与优质”协同改良已成为当前水稻育种工作的核心挑战与前沿方向 ^{［3- 4］}。稻米蒸煮食味品质主要由直链淀粉含量、糊化温度及胶稠度3个关键理化指标构成。糊化温度（gelatinization temperature，GT）是表征水稻淀粉品质的核心指标之一，其数值高低不仅直接决定稻米蒸煮加工环节的能量投入与时间成本，更是通过影响米饭质地、黏性及硬度等关键食味性状，直接决定消费者的最终食用体验 ^［5-6］。从生理生化角度而言，GT的本质是淀粉颗粒在热水中发生不可逆吸水膨胀、晶体结构崩解，伴随体系黏度显著上升、双折射现象完全消失时的临界温度 ^［7］。鉴于GT对水稻蒸煮食味品质的关键调控作用，挖掘调控该性状的关键功能基因，解析其在淀粉合成代谢通路中的分子作用机制，对推动水稻优质品种的遗传改良进程、加速分子设计育种的产业化应用，具有重要的理论指导意义与实践价值 ^［8］。在育种实践中，GT通常依据碱消值划分等级：碱消值1~3级、4~5级、6~7级分别对应高、中、低糊化温度，且碱消值与GT呈高度负相关（碱消值越高，GT越低），这一简便的间接指标为表型精准鉴定提供了便利 ^［9-10］。在遗传解析方面，目前已明确ALK基因是控制稻米糊化温度的主效基因，其编码可溶性淀粉合成酶Ⅱ（soluble starch synthase Ⅱ，SSⅡa），其功能正常（如ALK^a 、ALK^b 等位基因）时能合成长链支链淀粉，形成稳定的晶体结构，导致糊化温度较高；而其功能缺失的等位变异（如ALK^c 、ALK^d ）则会导致支链淀粉结构改变，晶体稳定性下降，表现为糊化温度降低^［11-12］。研究表明通过图位克隆法可以得到ALK基因，该基因包含8个外显子和7个内含子；基于品种间序列比较与表型关联分析，推测编码区内的碱基替换可能通过改变支链淀粉晶体结构影响糊化温度^［13-15］。

近年来，随着基因组测序成本的急剧下降和高通量基因分型技术的普及，全基因组关联分析已成为解析复杂性状遗传架构的重要方法。该方法利用自然群体在历史重组中积累的大量遗传变异，无需构建分离群体即可实现更高精度的定位，极大地提升了挖掘“隐藏”优异等位基因的效率 ^［16］。基于此，本研究以139份具有广泛遗传多样性的水稻种质为自然群体，在多环境下系统鉴定了糊化温度及其相关表型，并利用覆盖全基因组的255 501个高质量SNP标记进行全基因组关联分析，旨在鉴定除ALK外与糊化温度显著关联的新遗传位点，挖掘关键候选基因并解析GT的遗传基础，为通过分子标记辅助选择或基因编辑等精准育种策略改良稻米食味品质提供理论依据与新的基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选用139份西北早粳稻种质资源，其地理来源覆盖12个国家，包括中国104份、阿尔巴尼亚1份、澳大利亚2份、巴西1份、朝鲜3份、法国2份、韩国3份、美国1份、孟加拉1份、南斯拉夫1份、葡萄牙2份、日本18份，所有材料均由宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室提供^［17-18］。

1.2 田间种植设计

分别于2022年在海南省乐东黎族自治县隆平高科玉米南繁基地（109°17′E，18°39′N），2023年在宁夏永宁县宁夏大学教学试验农场（106°15′E，38°14′N）开展田间试验。每份材料采用单株移栽的方式种植2行，每行10株。行长设定为1.2 m，行距为0.3 m，株距为0.1 m，进行水稻常规田间管理 ^［19］。于成熟期统一采收种子，经脱粒及干燥后保存备用。

1.3 碱消值的测定及数据分析

碱消值是指碱液对完整精米粒的侵蚀程度，反映稻米淀粉在碱性条件下的糊化特性。碱消值依据NY/T 83-2017标准进行测定。测定时应严格控制反应条件（质量分数1.7% KOH、30 ℃、23 h），通过观察米粒分解程度评定1~7级，计算平均值作为最终结果。

采用Excel 2016对两地碱消值数据进行基本统计分析，计算均值、标准差、变异范围、变异系数、偏度和峰度等统计量。

1.4 全基因组关联分析

本研究采用全基因组关联分析（GWAS），其基于的SNP物理图谱由本课题组通过重测序获得。原始数据经过严格质控过滤，设置最大缺失率为0.05、最小等位基因频率（MAF）为0.05、哈迪-温伯格平衡检验P值阈值为1×10⁻³，最终获得255 501个高质量SNPs。该群体的连锁不平衡（LD）衰减距离确定为50 kb，群体结构分析参考本实验室已发表的前期研究结果^［20］。利用R 4.3.1软件中rMVP包的一般线性模型（GLM）和FarmCPU模型，分别对两地碱消值进行全基因组关联分析，通过曼哈顿图与Q-Q图可视化显著关联位点。

1.5 候选基因筛选

1.5.1 单倍型分析

对两年两地显著重复关联位点进行整合，以上下游各延伸50 kb区域为候选区段，将间距在50 kb以内的SNPs视为一个显著关联QTL区段 ^［21］。利用国家水稻数据中心（http：//www.ricedata.cn）以及Rice Genome Browser网站（http：//rice.uga.edu/cgi-bin/Gbrowse/rice）查找候选区段内的候选基因及其相应注释，初步筛选候选基因。进一步使用Haploview4.1软件对候选基因进行单倍型分析 ^［22］，筛选潜在候选基因。

1.5.2 籽粒灌浆期动态分析

在水稻开花时标记为1 d，之后每间隔5 d取籽粒，设3次生物学重复，将籽粒用锡箔纸包裹标记后经液氮速冻，随即转移至-80 ℃冰箱保存。使用TRlozl-A+总RNA试剂盒（北京天根生化有限公司）提取RNA，使用微量核酸蛋白仪（Thermo Nanodrop2000 分光光度计，上海）和电泳法检测RNA质量，若A₂₆₀/A₂₈₀=2.0，有3条带或前2条带，则说明RNA质量良好。用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（TaKaRa）进行反转录获取cDNA。通过EnsemblPlants数据库检索并获取目的基因的cDNA序列，随后利用NCBI平台提供的引物设计工具Primer-BLAST进行特异性引物设计与筛选，筛选后的引物序列委托上海生物工程股份有限公司合成，相关引物的具体序列信息详见表1。使用生物染料法荧光定量试剂盒（TB Green^® Premix Ex Taq^TMⅡ）测定候选基因在灌浆期的相对表达量。扩增体系如下：2×TB Green^®Premix Ex Taq 10 μL，正反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase Free ddH₂O 6.4 μL。扩增程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45个循环。

2 结果与分析

2.1 水稻籽粒碱消值表型数据分析

对2022年海南和2023年宁夏两地收集的139份水稻籽粒碱消值表型数据进行了系统描述性分析，结果见表2。

由表2可以看出，海南地区碱消值平均为5.40，变异范围为2.00~7.00，宁夏地区碱消值平均为5.17，变异范围为1.80~6.70。不同地区间该性状的变异系数较高，表明地域间材料表型差异显著。两地碱消值的偏度绝对值均小于2，峰度绝对值均小于5，表明该性状基本符合数量性状连续分布的特征。

2.2 水稻籽粒碱消值全基因组关联分析

使用FarmCPU模型和GLM模型对2022年海南与2023年宁夏两地139份水稻籽粒碱消值进行全基因组关联分析，在阈值为-lg P≥5.4的条件下，共检测到与ASV显著关联的SNP位点38个，其中Chr03-17654172、Chr09-12520151、Chr04-14118925等6个显著SNP在海南地区被两种模型共同检测到，Chr01-13684285、Chr03-3306844、Chr05-24830302和Chr09-4974231等8个显著SNP在宁夏地区被两种模型共同检测到，Chr04-7788329和Chr09-4893497在两个地区均被共同检测到（图1和表3）。

2.3 水稻籽粒碱消值候选基因筛选

利用国家水稻数据中心（NRRD）和Rice Genome Browser 网站对两个环境下共定位QTL区段进行基因筛选，共获得22个可能影响碱消值（ASV）的候选基因，结果见表4。基于功能注释信息进一步筛选，最终筛选出两个与水稻籽粒碱消值相关的候选基因，分别为位于9号染色体上的LOC_Os09g20820和LOC_Os09g20880。

2.4 水稻籽粒碱消值候选基因分析

2.4.1 单倍型分析

对两个候选基因进行单倍型分析，结果显示各基因不同单倍型之间均存在显著的表型差异。在LOC_Os09g20820中鉴定出Hap1和Hap2两种单倍型，其群体自然频率分别为94.20%和5.40%（图2-A）。结合海南与宁夏两地的表型数据分析表明，Hap1的单倍型表型值显著高于Hap2，为优势单倍型。LOC_Os09g20880同样检测到Hap1和Hap2两种单倍型，其群体自然频率分别为94.20%和5.80%，且在两地试验环境中均表现出显著的表型差异，Hap1的碱消值显著高于Hap2（图2-B）。综上所述，将LOC_Os09g20820和LOC_Os09g20880确定为影响水稻籽粒碱消值的关键候选基因。

根据SNP注释分析，LOC_Os09g20820基因在外显子区发生了3处突变：第121位碱基由G突变为A，导致编码的氨基酸由谷氨酸（Glu）变为赖氨酸（Lys）；第618位碱基发生同义突变（G→A），未改变氨基酸序列；第1 390-1 391位碱基组合（A→G和T→A）则使编码的氨基酸由甲硫氨酸（Met）变为精氨酸（Arg）。与此同时，LOC_Os09g20880基因在外显子区检测到3处突变：第80位碱基由A突变为G，导致赖氨酸（Lys）替换为精氨酸（Arg）；第174位（C→A）和第738位（C→T）的突变均为同义突变，未影响氨基酸编码。这些突变信息为后续研究基因功能变异提供了重要依据。

2.4.2 候选基因相对表达量动态分析

测定含有Hap1和Hap2水稻品种在籽粒灌浆期的相对表达量，结果（图3）表明，在水稻籽粒中，LOC_Os09g20820的相对表达量在灌浆第11，16，21，26和31天时，含有Hap2的品种中基因相对表达量极显著高于含有Hap1的品种（P<0.01），在第1和6天时，含有Hap2的品种中基因相对表达量显著高于含有Hap1的品种（P<0.05）。在整个时期呈现出含有Hap2的品种始终高于含有Hap1的品种。LOC_Os09g20880的相对表达量在整个籽粒灌浆期都极低，且两单倍型差异极小，因此推测基因LOC_Os09g20880可能不在灌浆期表达。

3 讨 论

糊化温度是决定稻米蒸煮品质与市场接受度的关键性状，其主要受遗传基础与环境因子的共同调控 ^［23-24］。本研究基于海南、宁夏多环境表型鉴定与全基因组关联分析，在西北早粳稻群体中成功挖掘出2个位于第9染色体上的糊化温度相关候选基因。这一研究成果的高效性与可靠性并非单一因素作用的结果，而是群体的独特遗传特性及环境的差异化调控效应协同作用的体现。

表型分析发现，海南试验点水稻籽粒的碱消值（ASV）均值显著高于宁夏，这一差异的主要原因是两地灌浆期温度显著不同。已有研究指出，水稻灌浆期高温（如海南的热带气候）会抑制颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）的活性，降低直链淀粉含量（AAC），进而降低糊化温度（ASV升高），而灌浆期低温则有利于GBSS的积累，导致AAC和糊化温度升高而ASV降低^［25-28］，这一结果与本研究的表型差异结果吻合，进一步验证了环境温度可显著影响糊化温度。宁夏试点的碱消值变异系数（6.49%）高于海南（5.74%），表明宁夏试点的环境更有利于群体遗传变异的充分表达，使不同材料表型差异更易显现。这种环境介导的表型分化，一方面为跨环境稳定QTL的筛选提供了对比条件，在两种差异环境中均能检测到的位点，才更可能是调控GT的核心遗传因子；另一方面通过候选基因单倍型差异分析，使微效基因的表型效应得以充分暴露，避免因环境同质化导致的遗传信号掩盖。

GWAS能解析复杂性状的效率，在很大程度上依赖于研究群体的遗传特性。已有研究证实，ALK基因通过编码可溶性淀粉合成酶Ⅱ（SSⅡa）调控支链淀粉的链长与结构，是影响GT的核心主效基因，其遗传效应强弱直接依赖于基因区域的变异分化程度^［29］。本研究通过已获得的全基因组SNP数据，对GT主效基因ALK上下游50 kb区域进行变异位点检索，结果未检测到显著差异SNP位点，表明该群体中ALK基因所在区域的遗传变异水平极低，意味着该基因在群体内难以通过序列变异产生表型效应分化，其对GT主效干扰被极大削弱，这一独特的群体特性有助于缓解GT遗传解析中“主效基因掩盖微效基因”的普遍难题，为挖掘GT相关的微效新基因提供了有利条件。同时，本研究的GWAS未定位到ALK基因所在的QTL区间，进一步佐证了该群体可有效避开ALK基因的强效应干扰，是筛选GT新调控基因的理想材料。

本研究通过跨环境与跨模型交叉验证，筛选到2个稳定表达的QTL区间，并从中锁定LOC_Os09g‑20820 （编码烯醇化酶）和LOC_Os09g20880（编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）两个候选基因。此前的单倍型分析结果已证实，这两个基因的Hap1/Hap2单倍型在海南、宁夏两种差异环境中均表现出显著表型差异，且均以Hap1为优势单倍型。这一结果表明，在ALK基因无主效干扰的背景下，两个候选基因的遗传效应并未受环境影响，而是呈现出稳定的表型调控作用，这种跨环境的稳定性，既验证了候选基因与碱消值（糊化温度）的遗传关联可靠性，也进一步凸显了本研究群体剔除主效基因干扰、富集微效稳定基因信号的独特优势。

从候选基因功能机制来看，LOC_Os09g20820与LOC_Os09g20880可能通过不同途径参与GT的调控，且均与淀粉合成代谢密切相关。LOC_Os09g20820编码的烯醇化酶是糖酵解途径中催化2-磷酸甘油酸（2-PGA）不可逆转化为磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的关键酶^［30］。该步骤是糖酵解的核心调控节点，烯醇化酶活性直接影响PEP的生成速率，进而影响下游丙酮酸、三羧酸循环中间产物以及依赖于这些前体物质的生物合成过程^［31］，其中包括为淀粉生物合成提供必需的碳骨架和能量（ATP和NADPH）^［32］。结合单倍型表达分析结果，LOC_ Os09g20820的Hap2单倍型在籽粒灌浆各时期均呈现显著更高的表达水平（P<0.01），携带该单倍型的种质资源群体表现出显著较低的碱消值（对应较高GT，P<0.05），基因型、表达量和表型关联性均暗示该基因可能通过调控碳代谢流向改变淀粉合成的物质与能量供应，进而影响GT。LOC_Os09g20880 编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其功能可能与淀粉合成关键酶的翻译后修饰相关。已有研究表明，淀粉合成关键酶（如颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和淀粉去分支酶（DBE））的活性均受磷酸化修饰的精细调控^［33］。该蛋白激酶可能通过磷酸化修饰上述关键酶，调节其催化效率或蛋白互作能力，间接影响淀粉结构（如支链淀粉链长分布CLD），最终实现对GT的调控^［34］。

4 结 论

本研究利用全基因组重测序数据，采用GLM模型和FarmCPU模型对139份种质资源的籽粒碱消值进行全基因组关联分析，结果发现水稻籽粒的碱消值共关联到38个显著SNPs，其中有两个SNPs在两个环境下被共同检测到。基因功能注释筛选获得2个影响水稻籽粒碱消值的关键候选基因LOC_Os09g20820和LOC_Os09g20880。将候选基因进行单倍型和灌浆期籽粒动态表达量分析，最终确定基因LOC_Os09g20820的不同单倍型在水稻籽粒碱消值表型上具有差异显著性，含有Hap2的品种中基因表达量始终显著高于含有Hap1的品种。基于单倍型关联分析与籽粒灌浆期动态表达分析结果，LOC_Os09g20820可作为水稻糊化温度相关的重要候选基因，开展后续的功能验证。

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基金资助

宁夏回族自治区粮食作物种质创制与生长调控创新团队项目(2022BSB03109)

宁夏农业育种专项(2018NYYZ0302)