TaNAS4‐A对小麦籽粒锌铁积累的调控机制

Regulation mechanism of TaNAS4‐A on zinc and iron accumulation in wheat grains

摘要

目的 解析小麦烟酰胺合成酶基因TaNAS4‐A在锌、铁吸收转运与籽粒积累中的生物学功能，为小麦微量营养生物强化育种提供基因资源和理论依据。 方法 从EMS诱变的Kronos突变体库中筛选出TaNAS4‐A基因SIFT评分为0的纯合点突变株系Kronos2277（K2277）和Kronos2581（K2581），以Kronos野生型为对照，通过KASP基因分型进行分子验证，并利用蛋白质结构模拟分析突变效应；采用酶活性测定、根系分泌物分析及原子吸收光谱法，分别检测不同基因型植株根叶NAS催化效率、缺铁胁迫下麦根酸（MAs）分泌动态及籽粒锌铁含量；同时在田间条件下调查农艺性状。 结果 K2277和K2581均为TaNAS4‐A纯合突变体，二者根、叶NAS活性显著低于其野生型。在缺铁条件下，突变体MAs分泌率显著低于野生型。突变体的田间籽粒Zn和Fe含量显著低于野生型，且K2277的籽粒Fe含量显著高于K2581。突变体的株高、穗下茎长、千粒质量显著降低，而籽粒干瘪率显著升高。 结论 TaNAS4‐A基因可通过调控NAS活性与MAs分泌，影响小麦Zn和Fe在籽粒的积累。

Abstract

Objective This research aims to elucidate the biological function of the wheat nicotianamine synthase gene TaNAS4‐A in zinc（Zn） and iron（Fe） accumulation in wheat grain，to provide gene resources and theoretical support for wheat micronutrient biofortification breeding. Method Kronos2277（K2277） and Kronos2581（K2581），mutants of TaNAS4‐A with SIFT score of 0，were screened from the EMS-mutagenized Kronos TILLING （targeting induced local lesions in genomes） population.The homogeneity of the two mutants was validated using KASP （kompetitive allele specific PCR） genotyping.Mutation effects were predicted using protein structure simulation.Enzyme activity assays，root exudate analysis，and atomic absorption spectrometry were employed to measure NAS enzyme catalytic efficiency in roots and leaves，the dynamics of mugineic acid （MAs） secretion under iron deficiency stress，and grain zinc and iron contents in different genotypes，respectively.Agronomic traits of the two mutants and the wild type were investigated under field conditions. Result Both K2277 and K2581 were identified as homozygous mutants of TaNAS4‐A，with significantly lower NAS enzyme activity in roots and leaves compared with the wild type.Under iron deficiency，MAs secretion rates in the mutants were significantly lower than those in the wild type.In the field， Zn and Fe contents in the grain of the mutants were significantly lower than those of the wild type，and the Fe content in the grain of K2277 was significantly higher than that of K2581.Moreover，plant height，peduncle length， and thousand-grain weight were significantly reduced in the mutants，while grain shriveling rate was increased. Conclusion TaNAS4‐A gene regulates Zn and Fe accumulation in the wheat grain by modulating NAS enzyme activity and MAs secretion.

Graphical abstract

关键词

生物强化 / 定向诱导基因组局部突变技术（TILLING） / 麦根酸 / 竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应（KASP）

Key words

biofortification / targeting induced local lesions in genomes（TILLING） / mugineic acid / kompetitive allele specific PCR （KASP）

锌（zinc，Zn）和铁（iron，Fe）是人体新陈代谢必需的微量营养素。锌缺乏与心血管疾病、胃肠道疾病、慢性炎症性肠病和癌症的发生密切相关^［1］。铁缺乏会提升急性冠状动脉综合征和心肌梗塞病人的致死率，造成认知发育障碍和免疫机制受损^［2-4］。全球近17%的人口面临锌缺乏风险^［5］，25%的人口患有缺铁性贫血^［6］。膳食摄入不足是导致人体锌、铁缺乏的主要原因，与动物源性食物相比，谷物通常具有较低的锌、铁含量和生物利用度。因此以谷物类食物为主的人群比依赖动物源性食物的人群具有更高的锌铁缺乏风险。

小麦（Triticum aestivum L.）是我国主要粮食作物，是全国40%人口的主食来源。研究表明，小麦籽粒Zn含量需达45 mg/kg才能满足以小麦为主食的居民对Zn摄入量的需求^［7］。目前普通小麦籽粒的平均Zn、Fe含量分别为28~30 mg/kg^［8］和24~51 mg/kg^［9］，远低于营养强化标准。由于小麦在我国居民饮食结构中具有重要地位，培育富Zn和富Fe小麦品种对改善我国居民缺Zn和缺Fe现状具有重要意义。然而对小麦调控锌铁吸收转运分子机制的有限认知，严重制约了分子育种技术在富Zn和富Fe小麦选育中的应用。

烟酰胺（nicotianamin，NA）是一种金属螯合剂。NA由NA合成酶（NA synthase，NAS）催化合成。NAS基因在Zn、Fe吸收与转运调控中起关键作用。在水稻中过表达HvNAS1显著提高了NA及其下游产物脱氧麦根酸（deoxymugineic acid，DMA）含量，促进了籽粒Zn和Fe积累^［10］。类似地，过表达OsNAS2和OsNAS3基因均显著提高了水稻籽粒Zn和Fe含量^［11-12］。利用CRISPR-Cas9技术编辑OsNAS2启动子序列，使其表达量显著提高后，基因编辑植株的籽粒Zn和Fe含量也显著提高^［13］。在小麦中过表达OsNAS2基因显著提高了面粉Zn和Fe含量^［14-15］。但目前关于TaNAS基因在小麦籽粒Zn和Fe积累中作用的研究较少。

利用突变体解析基因功能，是现代分子生物学研究的核心策略之一。“Chloronerva”是番茄（Lycopersicon esculentum L.）中的一个NAS突变体，是栽培作物中最早发现的此类突变之一，该突变体显著降低了番茄对铁的吸收能力^［16］。之后，研究人员通过T-DNA插入技术在拟南芥中生成了8个NAS突变体，并进一步构建了两个四重NAS突变体，其中一个突变体完全缺乏NAS活性，表现出不育及类似Chloronerva的特征（nas4x-2），另一个突变体（nas4x-1）则表现出中等程度的突变表型，在从营养生长阶段向生殖阶段过渡期间以及在缺铁条件下叶片黄化现象加重^［17］。在中等镍毒性条件下生长时，atnas4-1和atnas3-1单突变体的叶片黄化现象更加严重，而atnas1-1和atnas2-1单突变体仅表现出轻微黄化^［18］。

小麦Kronos突变体系由EMS（ethyl methanesulfonate mutagenesis）诱变产生，经靶向诱导基因组局部突变技术（targeting induced local lesions in genomes，TILLING）筛选鉴定获得。至创建以来，Kronos突变体系被广泛用于小麦基因功能研究。SIMMONDS等^［19］通过对Kronos的gw2-a1突变体及野生型进行研究，发现gw2-a1突变等位基因可显著增加小麦的千粒质量、粒宽和粒长。KIPPES等^［20］在对Kronos突变系phyC/phyB的研究中发现，在长日照条件下，phyC缺失突变体抽穗比野生型晚104 d，phyB缺失突变体抽穗比野生型晚194 d，证实了这两个基因在长日照促进开花中的主要作用。本研究拟利用从Kronos突变体中鉴定到的两个携带TaNAS4-A错义点突变的株系，深入探究TaNAS4-A基因在小麦籽粒锌、铁积累中的生物学功能，以期为小麦锌、铁营养强化分子育种提供理论依据与基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料及种植

小麦Kronos 突变体系由美国加州大学戴维斯分校 Jorge Dubcovsky 博士团队构建。本研究依据SIFT（sorting intolerant from tolerant）评分为0及突变位点纯合两个筛选标准，从该突变体系中选取2个在TaNAS4-A基因存在错义点突变的株系，编号Kronos2277和Kronos2581（以下分别简称为K2277和K2581），以野生型Kronos（简称K000）为对照。

田间试验于2023年和2024年在宁夏大学教学实验农场（北纬38°23′，东经106°23′）开展。试验采用完全随机区组设计，设置3次重复，每小区种植4行，行长1.5 m。

于恒温培养箱内对K000、K2277和K2581进行水培试验。挑选饱满的小麦籽粒，用质量分数3%次氯酸钠溶液消毒15 min，用清水冲洗3次后置于培养盘萌发。将发芽后的幼苗移植至1/4强度Hoagland溶液（营养液含Zn 0.5 µmol/L）中培养。每天用蒸馏水清洗培养盘并更换新的营养液。将培养盘置于光照培养箱，光照周期设置为16 h光照和8 h黑暗，白天温度20~25 ℃，夜间温度18 ℃。

1.2 DNA的提取及KASP（kompetitive allele specific PCR）基因分型

分别取K2277、K2581和K000幼苗期叶片样品0.5 g，经液氮速冻30 s后，使用冷冻研磨仪破碎成细粉。采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取基因组DNA。

利用在线工具Polymarker（https：//www.polymarker.info/）设计TaNAS4-A突变位点的KASP基因分型引物（表1）。反应体系包括5 µL DNA模板、5 µL 预混母液（LGC公司）及0.14 µL引物混合物。PCR扩增程序为：94 ℃初始变性15 min；随后进行35个循环，每循环包括94 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min；最后72 ℃延伸5 min。反应结束后使用FLUOstar Omega微孔板读板机检测荧光信号，并通过LaunchKlusterCaller软件进行等位基因分型分析。

1.3 野生型和突变型TaNAS4蛋白与SAM的分子对接分析

TaNAS4蛋白野生型三维结构从AlphaFold Protein Structure Database获取。基于野生型结构，利用PyMOL软件的Mutagenesis工具分别构建K2277和K2581突变体模型，并进行局部结构优化。

SAM配体结构从PubChem数据库下载，经AutoDock Tools加氢、赋予电荷并转换为PDBQT格式。受体蛋白同样使用AutoDock Tools进行预处理，包括去除水分子、补加极性氢原子及电荷计算。

分子对接采用AutoDock 4.2软件完成，以蛋白活性口袋区域为中心设置网格盒，采用Lamarckian 遗传算法进行对接模拟。每组蛋白-配体组合独立运行50次对接计算，取结合自由能的平均值作为最终结合亲和力指标。

1.4 NAS催化效率的测定

NAS催化效率的测定参考文献［21］的方法并稍作改进。称取0.5 g冷冻组织，于液氮预冷研钵中研磨成粉，加入1 mL提取缓冲液（含0.2 mol/L Tris/HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA，50 g/L不溶性PVP，体积分数5%甘油，0.1 mmol/L p-APMSF，100 µg/mL antipain及10 mmol/L DTT），匀浆液经8 000×g离心20 min后，取上清液过1 mL疏水树脂柱，使用平衡缓冲液（20 mmol/L Tris/HCl，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L p-APMSF，3 mmol/L DTT，0.4 mol/L（NH₄）₂SO₄，pH 8.0）平衡后，以含0.1 mmol/L p-APMSF和3 mmol/L DTT的体积分数1%甘油溶液洗脱获得NAS粗酶液。

酶反应体系中含有20 µg/mL antipain和50 µmol/L S-腺苷甲硫氨酸（SAM），于25 ℃反应15 min后，加入乙醇至终浓度50%终止反应，并将pH调至8.0。反应产物经PAX强阴离子交换柱分离，使用0.05 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 8.2）平衡后，以0.1 mol/L NaCl（pH 7.5）分步洗脱，收集洗脱液，于260 nm波长下测定吸光度值。以S-甲基-5’-硫代腺苷（MTA）为标准品制作标准曲线，根据吸光度值计算MTA生成量。全部操作在15 ℃条件下进行。NAS活性定义为每毫升粗酶液每分钟生成MTA的微摩尔浓度，生成的MTA越多，说明酶液中的NAS活性越高、催化效率越好。

1.5 根分泌麦根酸类物质（MAs）的测定

将K000、K2277和K2581在缺铁营养液中进行水培处理。在处理第7，10，12和14天，于光照开始后2 h将植株转移至等体积去离子水中收集根系分泌物，持续收集4 h。收集过程中容器遮光并持续通气，以维持根系正常生理活性并避免分泌物降解。收集结束后，记录根系鲜质量，所得分泌液按单位根鲜质量进行归一化处理，用于后续MAs含量测定。MAs含量测定参考于福同等^［22］的方法并加以改进：取9.00 mL根系分泌液，加入0.50 mL 2 mmol/L FeCl₃溶液和1.00 mL 0.5 mol/L NaAc-HAc缓冲液（pH 7.0），振荡1 h使充分形成Fe（Ⅲ）- MAs复合物；滤除沉淀后，取8.00 mL滤液，加入0.20 mL 1.5 mol/L H₂SO₄和0.50 mL 8%（0.08 g/mL）羟胺盐酸盐（HONHCl），于50 ℃水浴中还原20 min生成Fe（Ⅱ）-MAs；随后加入1.00 mL 2 mol/L NaHAc-HAc缓冲液（pH 4.7）和0.2 mL 0.01 mol/L Ferrozin显色剂，反应生成紫红色Fe（Ⅱ）-Ferrozin络合物，于562 nm波长下测定吸光度值。根据铁标准曲线计算铁活化量，并以铁螯合当量表示MAs分泌率。

1.6 Zn和Fe含量的测定

参考食品中锌的测定（GB 5009.14-2017）和食品中铁的测定（GB 5009.90-2016）的方法，采用火焰原子吸收光谱法（flame atomic absorption spectroscopy，FAAS）对成熟期籽粒及苗期叶片和根系的锌、铁含量进行测定。苗期锌、铁离子再转运效率按下式计算：再转运效率=（茎叶干质量×茎叶离子浓度）/（茎叶干质量×茎叶离子浓度+根系干质量×根系离子浓度）×100%。

1.7 小麦农艺性状及籽粒性状的测定

于灌浆期对K000、K2277和K2581进行农艺性状及籽粒性状的系统考察，包括株高、穗下茎长、旗叶长、旗叶宽，以及成熟籽粒的干瘪率、粒长、粒宽、粒厚和千粒质量。

1.8 数据处理

本试验所有数据均利用软件GraphPad Prism 10、R进行处理与分析。所有的显著差异性比较采用标准均为P≤0.05。蛋白与小分子对接采用Pymol与Autoduck软件进行量化分析。

2 结果与分析

2.1 TaNAS4‐A点突变的分子验证与结构分析

利用KASP技术对K2277、K2581及野生型K000进行基因分型，结果表明两个突变体株系均成功携带目标纯合突变位点（图1）。

InterPro分析结果（图2）表明，TaNAS4-A蛋白含有一个几乎跨越其全长的高度保守烟酰胺合成酶结构域，隶属于S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶超家族。NAS domains覆盖4~284 aa，G242E（K2277）与P246S（K2581）均位于保守的NAS结构域内，根据与已表征NAS蛋白结构的同源性比对，这两个残基处于预测的催化核心区域。说明这些残基很可能对维持酶催化效率与结构稳定性具有关键作用。

蛋白质结构分析定位突变位点发现，K2277的突变位于TaNAS4-A蛋白的α螺旋区域（图3-A），而K2581的突变则位于β折叠相邻的无规则卷曲区域（图3-B）。为评估突变对蛋白结构的潜在影响，本研究基于空间排斥效应原理（即原子间距小于2 Å时可因电子云重叠引发空间冲突，进而破坏结构稳定性），以突变后氨基酸侧链为中心，在其5 Å范围内检测潜在的空间冲突原子（阈值设为2 Å）。分析结果（图4）显示，K2277和K2581分别存在9个和6个此类冲突原子，表明突变可能引起局部构象扰动，从而影响TaNAS4-A蛋白的正常功能。

对接分析结果（表2）表明，G242E和P246S突变均降低了TaNAS-4与SAM的结合亲和力。相较于野生型（ΔG=-12.93 kJ/mol），G242E突变导致结合亲和力适度下降（ΔΔG=+2.43 kJ/mol），而P246S突变引起的结合亲和力降低更为显著（ΔΔG=+4.81 kJ/mol），这表明Pro246在维持SAM结合口袋的结构稳定性中具有关键作用。

2.2 TaNAS4-A点突变对NAS催化效率的影响

由图5可以看出，小麦Kronos野生型与突变体根系中的NAS活性均显著高于叶片。K000在根和叶中的NAS活性均显著高于K2277和K2581，根系中K2277的NAS活性显著高于K2581。该结果表明，TaNAS-4A点突变对NAS催化效率有显著降低作用。

2.3 TaNAS4-A点突变对MAs分泌率的影响

由表3可以看出，培养第7天时，K000、K2277和K2581的MAs分泌率无显著差异。培养第10天时，K000的MAs分泌率开始显著高于两个突变体，但K2277与K2581之间无显著差异。培养第12天时，K000、K2277和K2581的MAs分泌率都达到了最大值，此时K000的MAs分泌率仍显著高于K2277和K2581，K2277的MAs分泌率开始显著高于K2581。培养第12~14天时，K000、K2277和K2581的MAs分泌率均开始下降，至第14天时，K000的MAs分泌率仍显著高于K2277和K2581，K2277的MAs分泌率仍显著高于K2581。该结果表明，TaNAS4-A点突变可以显著降低MAs分泌率。

2.4 TaNAS4-A点突变对锌铁向地上部转运效率的影响

由表4可以看出，不同TaNAS4-A基因型之间Zn向地上部的再转运效率存在显著差异。野生型K000的Zn向地上部再转运效率最高，其均值为54.86%，显著高于两个突变体；K2277的Zn向地上部再转运效率最低（46.06%）；K2581的Zn向地上部再转运效率为中间水平（50.12%），与K000和K2277均存在显著差异。该结果表明，TaNAS4-A点突变可以显著降低锌、铁向小麦地上部的转运效率。

由表4还可以看出，与Zn相比，不同基因型间Fe向地上部的转运效率差异更加明显。K000的Fe向地上部再转运效率显著高于两个突变体，其均值达到72.34%，而K2277和K2581的Fe向地上部再转运效率仅为25.23%和25.14%，二者之间无显著差异，但均显著低于K000。

2.5 TaNAS4‐A点突变对籽粒锌铁含量的影响

由图6可以看出，K000籽粒中的铁（43.2 mg/kg）和锌（31.2 mg/kg）含量均显著高于K2277（38.3 mg/kg，28.1 mg/kg）和K2581（36.1 mg/kg，27.7 mg/kg）。两个突变体之间籽粒锌含量无显著差异，但K2277籽粒的铁含量显著高于K2581。该结果显示，TaNAS4-A点突变会显著降低小麦籽粒的锌铁含量。

2.6 K000、K2277和K2581农艺性状及籽粒性状的差异

由表5可以看出，3个株系间的旗叶宽、粒长和粒宽无显著差异。与K000相比，两个突变株系的株高和穗下茎长均显著降低，其中K2581的株高显著低于K2277。K000和K2277的旗叶长均显著高于K2581。籽粒性状分析显示，K000的籽粒干瘪率显著低于两个突变株系，而K2581的干瘪率又显著低于K2277。此外，K000的粒厚和千粒质量均显著大于K2277和K2581，K2581的千粒质量显著高于K2277。

3 讨论与展望

本研究证实，小麦根系与叶片中NAS活性与植株MAs分泌率及成熟籽粒中铁（Fe）、锌（Zn）含量均呈显著正相关。在K2277和K2581两个株系中，TaNAS4‐A基因发生的错义点突变显著降低了根与叶组织中NAS的催化活性，共同导致籽粒Zn、Fe积累量下降。这主要是由于，一方面，NAS活性下降直接减少了NA的合成。作为细胞质中Zn²⁺和Fe³⁺的关键螯合剂，NA含量不足削弱了其对游离金属离子的螯合能力，降低了离子向木质部的装载效率，最终减少向籽粒的转运量。已有研究报道，当根系NA合成受阻时，木质部汁液中Zn和NA含量均显著下降，Zn、Fe向地上部的转运效率也明显降低^［23］，表明NA能够与Zn和Fe离子结合形成螯合物，促进Zn在木质部的装载及向地上部的转运，该结果与本研究结果一致。另一方面，NA作为MAs生物合成的前体，其合成减少进一步抑制了下游MAs的合成与分泌。MAs分泌量下降不仅降低了根际土壤中难溶性Zn、Fe的活化效率，也减少了根系对螯合态Zn、Fe的吸收，最终导致籽粒Zn、Fe积累显著降低。前人研究表明，小麦根系分泌的DMA可酸化根际环境，提高Zn²⁺的有效性，并能与Zn²⁺螯合，从而增强根系对Zn的吸收及向地上部的转运效率^［24］，这一机制也支持本研究的结论。

在本研究中，K2277根系与叶片中的NAS活性显著高于K2581，这可能与TaNAS4‐A点突变对蛋白功能的影响程度不同或遗传背景中其他突变差异有关。相应地，K2277在生育后期表现出较高的MAs分泌率，最终其籽粒铁和锌含量均高于K2581，铁含量差异显著，而锌含量差异未达显著水平。已有研究指出，禾本科植物在缺铁条件下分泌的MAs虽可螯合铁、锌等多种金属离子，但其对铁的亲和力显著高于锌^［25］。这也从生理角度部分解释了本研究中两株系籽粒铁含量差异显著而锌含量无显著差异的现象。

在本研究中，TaNAS4‐A点突变显著降低了Zn和Fe在苗期向地上部的转运效率，尤其对Fe的影响更为显著。TaNAS4‐A的功能受损可能导致Fe-NA复合物形成效率降低，从而严重阻碍Fe在体内的长距离运输，而Zn由于可与多种有机配体结合，其转运过程对NA的依赖程度相对较低^［26］。K2581向地上部的转运效率介于K000与K2277之间，而K2277表现出最明显的下降。这表明不同突变位点可能对NAS4-A蛋白功能产生不同程度的影响。结合蛋白结构预测与分子对接分析结果显示，K2277（G242E）和K2581（P246S）突变均发生于TaNAS4-A蛋白的关键功能区域，并对SAM结合能力及潜在催化活性产生不同程度的影响。G242E（K2277）突变位点邻近预测的SAM结合口袋，甘氨酸向带负电荷的谷氨酸替换，可能影响局部构象柔性及底物结合的稳定性；而P246S（K2581）突变位点位于催化核心区内，脯氨酸在维持蛋白主链刚性和局部空间结构方面具有重要作用，其被丝氨酸替代后更可能破坏活性中心的结构稳定性，从而对酶功能产生更显著影响。该预测结果与试验结果的NAS催化效率降低、MAs分泌减少以及籽粒Zn和Fe积累显著下降的表型结果相一致，表明该突变对NAS功能具有更强的负面影响。然而在水培条件下，K2277的叶片Zn和Fe含量及向地上部再转运效率均低于K2581。这一差异说明TaNAS4‐A突变对金属元素稳态的影响可能具有明显的环境依赖性。小麦体内Zn、Fe的吸收与跨器官运输是一个多因子协同的复杂过程，其最终效应不仅取决于单一蛋白（如TaNAS4-A）的功能状态，更受到金属供应方式、络合体系及体内调控网络等因素的共同影响^［27］。该结果进一步表明，在解析TaNAS4‐A功能及其在Zn、Fe营养调控中的作用时，有必要结合不同生长条件下的表型表现进行综合评估。

化学诱变具有随机性，可在全基因组范围内引入大量突变，导致TILLING突变体常携带丰富的背景突变。本研究所用的两个TaNAS4‐A突变体K2277和K2581分别携带1 319和3 073个点突变。因此突变体与野生型之间在株高、粒厚和千粒质量等性状上观察到的表型差异，可能部分源于其他背景突变，而非由TaNAS4‐A突变所致。通过回交培育近等基因系，是消除背景突变干扰、明确目标基因功能的有效途径。例如，SHAW等^［28］对基于Kronos的突变体进行5次以上回交并保留目标突变，成功构建了CO1和CO2的功能缺失突变系，其研究表明CO1和CO2与开花促进因子PPD1构成一个复杂的调控网络，在光周期响应中既功能独立又存在互作，共同精确调控开花时间。目前，本研究团队正在通过回交构建TaNAS4‐A突变的近等基因系，以进一步深入探究该基因的生物学功能。

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基金资助

宁夏自然科学基金项目(2024AAC03096)

国家自然科学基金项目(32560455)

宁夏高等学校自然科学项目(NYG2024040)

宁夏自治区重大科技专项“宁夏粮食作物种质创制与生长调控科技创新团队项目”(2022BSB03109)