苦荞半胱氨酸蛋白酶基因的克隆与异源表达

Cloning and heterologous expression of cysteine protease gene from Fagopyrum tataricum

摘要

目的 克隆苦荞半胱氨酸蛋白酶基因（FtCP）并进行原核和真核表达分析，为探究FtCP与苦荞营养物质积累与代谢的关系奠定基础。 方法 提取苦荞灌浆期种子RNA，反转录合成cDNA。采用RT-PCR方法克隆获得FtCP基因，对其进行测序分析。采用半定量RT-PCR检测FtCP基因在苦荞不同组织器官（花、叶、茎、种子）中的表达情况。构建原核表达载体pET47b-FtCP，将其转化原核表达系统BL21 （DE3）中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，对表达产物进行亲和层析纯化；以纯化的FtCP为抗原，制备特异性多克隆抗体，利用Western blotting分析多克隆抗体的特异性。构建FtCP基因的真核表达载体pPICZ（alpha）A-FtCP，将其转化毕赤酵母表达系统进行诱导表达，对表达产物进行酶活性与酶学特性分析。 结果 FtCP基因开放阅读框（ORF）大小为1 059 bp，编码352个氨基酸，具有保守的序列结构特征。FtCP基因在4种组织中均有表达，但在花、叶中的表达水平高于茎和种子，表明FtCP的表达具有组织特异性。原核表达获得FtCP蛋白的分子质量约为39.78 ku；所制备的FtCP多克隆抗体能特异性识别苦荞种子中FtCP及其同源蛋白。真核表达的FtCP酶对底物偶氮酪蛋白具有催化活性，酶活性为159 U/mL；FtCP酶最适pH为6.5，最适温度为55 ℃；苯甲基磺酰氟会显著抑制酶活性，而Mg²⁺和1% Triton X-100对酶活性无影响。 结论 克隆了FtCP基因序列并进行了异源表达，制备了具有活性的FtCP酶，为阐明苦荞种子蛋白质营养积累机理提供了试验材料。

Abstract

Objective This research aims to clone the cysteine protease gene from Fagopyrum tataricum （FtCP），which plays a crucial role in plant growth and development，and serves as a key enzyme in the regulation of protein accumulation in Fagopyrum tataricum seeds. Method The FtCP gene was cloned via RT-PCR，using cDNA that was reverse-transcribed from RNA extracted from F.tataricum seeds during the filling stage as the template，and subsequently subjected to sequencing analysis.The expression levels of FtCP gene in different tissues and organs of F.tataricum （flower，leaf，stem，and seed） were detected by semi-quantitative RT-PCR.A prokaryotic expression vector pET47b-FtCP was constructed and transformed into E.coli BL21（DE3） expression system.Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside （IPTG） was used to induce gene expression，and the expressed product was purified through affinity chromatography.The purified FtCP was used as an antigen to generate specific polyclonal antibodies，and the tissue specificity of the FtCP protein was analyzed by using Western blotting.The eukaryotic expression vector pPICZ （alpha） A-FtCP was constructed，and transformed into the expression system of Pichia pastoris to induce the expression of the gene.The enzyme activity and enzymatic characteristics of the expressed product were analyzed. Result The FtCP open reading frame （ORF） was 1 059 bp，encoding 352 amino acids with conserved structural motifs.The FtCP gene was expressed in all four tissues，but the expression levels in flower and leaf were higher than those in stem and seed，indicating that the expression of FtCP was tissue-specific.The prokaryotically expressed FtCP antigen exhibited a molecular mass of 39.78 ku.The prepared polyclonal antibodies specifically recognized FtCP and its homologous proteins in F.tataricum seeds，with tissue-specific expression patterns observed.The eukaryotically expressed FtCP enzyme displayed catalytic activity towards the substrate azocasein，with a specific activity rate of 159 U/mL.The optimum pH of FtCP enzyme was 6.5 and optimum temperature was 55 ℃.Phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF） notably inhibited the enzyme activity， whereas magnesium ions and 1% Triton X-100 showed no impact on the enzyme activity. Conclusion In this study，the FtCP gene was cloned and an active FtCP enzyme was obtained through heterologous expression， providing the experimental materials for elucidating the mechanism of nutritional accumulation at the protein level in F.tataricum seeds.

Graphical abstract

关键词

苦荞 / 半胱氨酸蛋白酶 / 异源表达 / 酶活性

Key words

Fagogyrum tartaricum / cysteine proteinase / heterologous expression / enzymatic activity

苦荞（Fagogyrum tartaricum）属于双子叶廖科一年生草本植物，是一种多功能的假谷物药食同源作物。随着人们对苦荞营养价值认识的深入，其发展前景日益广阔^［1］。在“大食物观”理念的推动下，苦荞种子优质蛋白质资源的高效利用已成为食品与医药产业突破传统资源的瓶颈，其开发价值亟待系统性挖掘^［2］。大量研究表明，苦荞营养物质积累及种子发育受多个基因的直接或间接调控。

半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease，CP）是植物中一类重要的酶类，在植物的生长发育过程中发挥着关键作用。CP对植物的生理和发育具有多种调控功能^［3］，包括蛋白质的储存与水解、衰老过程调控以及细胞程序性死亡^［4-5］。研究发现，水稻中REP-1（rice endopeptidases-1）是一种功能性CP，可消化种子储存的蛋白，为幼苗的生长提供必需的营养物质^［6］。在反义转基因烟草中，抑制CP基因会导致花粉粒不育^［7］。此外，前人从本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中分离鉴定的NbPIRIN（Nicotiana benthamiana pirin-like protein）能与烟草CP相互作用，增强CP活性，从而抑制中国小麦花叶病毒的感染^［8］。在模式生物拟南芥中，OTU2可通过去泛素化半胱氨酸蛋白酶RD21A，增强拟南芥对根肿病的抗性^［9］。旱生植物牛角瓜乳汁中的5种CP（proce-rain、procerain B、CpCP-1、CpCP-2和CpCP-3）具有抑制植物病原真菌和凝乳的生物学活性，其前体酶翻译后加工过程中释放的活性前肽对癌细胞具有抑制作用^［10］。尽管CP已在多种植物中被鉴定，且从基因与蛋白质水平开展了功能研究^［7，11］，但由于其功能特性存在差异，仍需在基因与蛋白质技术层面深入探讨其在苦荞种子营养物质积累中的功能特性。

WANG等^［12］对苦荞种子进行蛋白质组学分析，鉴定出3 363种蛋白质，这些蛋白质参与核酸代谢、呼吸和能量代谢、蛋白质合成与代谢等生物学过程。GENG等^［13］从苦荞种子中鉴定出1 670个磷酸蛋白的2 613个磷酸化位点及285个N-糖蛋白的404个N-糖基化位点，揭示了苦荞蛋白质翻译后修饰的调控机制。LI等^［14］基于UHPLC-QqQ-MS对苦荞进行了代谢组学分析，获得722种代谢物，其中包括84种关键活性成分和78种抗病活性成分。DENG等^［15］对3个不同发育阶段的苦荞种子进行了蛋白质组学比较分析，发现78个蛋白差异表达，揭示了苦荞种子蛋白质水平上的营养积累机制。进一步蛋白质组学分析表明，酚类物质与蛋白质之间存在多个共价结合位点，芦丁/槲皮素与蛋白质的结合可降低蛋白质表面疏水能力，改善其起泡性、稳定性和抗氧化性能^［16］。为充分开发利用苦荞蛋白资源，研究发现美拉德反应条件下的糖基化可有效增强苦荞蛋白质的食品开发潜力，提高其助消化功效^［17］。

开展苦荞CP基因（FtCP）对种子蛋白质积累的调控机制研究，可为苦荞种质资源改良及其功能性食品开发提供重要理论依据。本研究对FtCP进行了克隆分析和原核表达，制备了FtCP的多克隆抗体，同时对FtCP基因进行了真核表达，分析了FtCP蛋白酶的生物学特性，旨在为探究FtCP与苦荞营养物质积累和代谢的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材　料

苦荞品种Yu-21种植于西北农林科技大学试验大田，开花后3 d，收集灌浆期的种子，并立即分装，用液氮冷冻后储存于-80 ℃冰箱中，以备后续分析。原核表达载体pET47b、大肠杆菌菌株BL21 （DE3）和TOP10、真核表达载体pPICZ（alpha）及毕赤酵母SMD1168H细胞，均由西北农林科技大学生命科学学院蛋白质与酶学实验室保存。

试验仪器包括：THZ-320振荡恒温培养箱，上海精宏生物仪器设备有限公司；JY-SCZ2蛋白电泳系统，北京君意仪器设备公司；5810R低温高速离心机，德国Eppendorf公司；JY 92-IIN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技设备有限公司；HD-21-1核酸蛋白浓度检测仪，上海青浦泸西生物技术仪器公司；JY-ZY4半干转移槽，北京君意东方电泳仪器公司；Universal HoodⅡ化学发光仪，美国伯乐Bio-Rad公司；DK-98-1恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 FtCP基因的克隆

采用Invitrogen公司的Concert^TM plant RNA Reagent从苦荞灌浆期种子中提取与纯化总RNA，参考JIA等^［18］的方法，采用MMLV逆转录酶（NEB，美国）反转录成cDNA，试验步骤均按照RevertAid First strand cDNA Synthes Kit的操作指南进行。设计能扩增FtCP基因全长序列的引物，正向引物F：5′-GTCCCCGCGGCT-TCCCAATCGGAGACTGAATCTTTC-3′，下划线碱基为Sac Ⅱ酶切位点；反向引物R：5′-GCCGCTCGAGCTACTGTGCGGTGGTCTGAACA-G-3′，下划线碱基为Xho Ⅰ酶切位点。以反转录所获cDNA为模板，PCR扩增FtCP基因，扩增体系（25 μL）：cDNA 1 μL，buffer 5 μL，引物F1和R1各1 μL，dNTPs 0.5 μL，iProof酶0.2 μL，ddH₂O 16.3 μL。扩增条件：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，40个循环；72 ℃总延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用回收试剂盒（北京百泰克生物）纯化回收目的片段，送上海生工测序。

1.2.2 FtCP生物信息学分析

采用ExPASy ProtParam工具（http：//www.expasy.ch/tools/proparam.html/）对FtCP基因序列推导出的氨基酸序列进行分析。将FtCP氨基酸序列作为查询序列在NCBI数据库中进行BLAST比对（应用Clustal X2和genedoc软件完成），分析FtCP与其他植物同源蛋白的进化关系，参比的其他植物CP氨基酸序列包括中华猕猴桃（Actinidia chinensis）CP （AcCP，PSS21684.1）、大豆（Glycine max）CP （GmCP，XP_003539008.1）、酸枣（Ziziphus jujuba）CP （ZjCP，XP_015892430.1）、甘薯（Ipomoea batatas）CP （IbCP，AAF40416.1）、开心果（Pistacia vera）CP （PvCP，XP_031273857.1）、南瓜（Cucurbita moschata）CP （CmCP，XP_022944124.1）、石榴（Punica granatum）CP （PgCP，XP_031394263.1）和芝麻（Sesamum indicum）CP （SiCP，XP_011092831.1）。采用在线软件ExPASy-ProtParam对FtCP等电点及分子量进行预测；采用在线SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）构建FtCP三维结构；采用NetOGlyc（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/）预测FtCP蛋白质序列中潜在的O-糖基化位点。

1.2.3 FtCP基因组织器官表达分析

采集苦荞不同组织器官（花、叶、茎和种子）样品，提取总RNA并反转录合成cDNA。以FtGAPDH作为内参基因，采用半定量RT-PCR检测FtCP基因在不同组织器官中的表达量，FtCP半定量正向引物F为5′-GCCAGGATGAAGGAGAAGCC-3′，反向引物R为5′-GTGCGGTGGTCTGAACAGCT-3′；FtGA-PDH正向引物F为5′-AGTTGCACTACCAACTGCCTTG-3′，反向引物R为5′-AGGTCAACCACGGACACATC-3′。PCR反应体系为cDNA 1 μL，buffer 5 μL，正向和反向引物各1 μL，dNTPs 0.5 μL，IProof酶0.2 μL，ddH₂O 16.3 μL。PCR反应条件为：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共28个循环。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分析基因表达量。

1.2.4 FtCP蛋白的原核表达与纯化

（1）FtCP蛋白的原核表达。将FtCP基因和原核表达载体pET47b进行Sac Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切，酶切产物用T₄ DNA Ligase连接，构建重组表达载体pET47b-FtCP。将重组表达载体pET47b-FtCP转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，对转化子进行菌落PCR和质粒PCR鉴定，阳性转化子送北京奥科生物进行双向T7引物测序，对测序结果进行Blast比对。将重组表达载体pET47b-FtCP转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，将转化子接种于含100 μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培养基平面中，于37 ℃培养箱过夜培养。将生长的单菌落转接到含卡那霉素（50 µg/mL）的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至菌液在600 nm吸光度（OD₆₀₀）为0.6~0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）至终浓度1 mmol/L，37 ℃诱导表达3 h。取1.5 mL IPTG诱导表达产物，加入50 μL SDS-PAGE上样缓冲液，沸水保温10 min后进行SDS-PAGE检测。

（2）FtCP蛋白的纯化。取FtCP表达产物，8 000 g离心10 min，收集菌体。取1 g菌体，加入10 mL PBS缓冲液，在冰浴条件下超声破碎30 min（超声和间歇时间均为10 s）后，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，分别取上清和沉淀，进行蛋白电泳检测。沉淀（不溶性包涵体）经尿素复性后，用His-Tag钴离子螯合层析柱进行纯化。目标蛋白先用透析液（50 mmol/LNaCl，20 mmol/LTris-HCl，pH 8.0）透析，再用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000浓缩，最后进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.5 FtCP蛋白多克隆抗体制备

将纯化的FtCP蛋白作为抗原进行多克隆抗体制备。为彻底去除抗原中可能存在的微量杂蛋白，本试验采用目标蛋白条带切胶免疫法制备多克隆抗体。取纯化与浓缩后的FtCP蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，切取目标蛋白质条带，加入1 mL 0.1 mol/L PBS（pH 7.5）进行充分研磨和溶解，加入不完全弗氏佐剂混匀后，背部多点皮下注射免疫大白兔（2~3个月），初次免疫剂量为1 mg/只，每隔2周加强免疫1次（剂量0.5 mg/只），共免疫4次。第4次免疫后1周，心脏穿刺取血，分离血清，-20 ℃冻存备用。取苦荞种子1 g，加液氮充分研磨成粉末，加入蛋白质提取缓冲液（50 mmol/LTris-HCl和25 mmol/LNaCl，pH 7.5），在4 ℃下放置12 h，再10 000 g离心10 min（4 ℃），收集上清液作为种子总蛋白。参考文献［19］的方法，以种子总蛋白为抗原，对制备的FtCP蛋白多克隆抗体的特异性进行Western blotting分析。

1.2.6 FtCP的真核表达与酶活性分析

（1）真核表达。设计毕赤酵母表达载体的特异性引物，正向引物F：5′-CGAGGAATTCTCCCAATCGGAG-ACTGAATCTTTCG-3′，下划线碱基为EcoR Ⅰ酶切位点；反向引物R：5′-TGGACCGCGGCTA-CTGTGCGGTGGTCTGAACAG-3′，下划线碱基为SacⅡ酶切位点。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。从重组质粒pET47b-FtCP中扩增出FtCP基因全长。PCR扩增体系同1.2.1节，PCR扩增程序为：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃总延伸10 min。将扩增得到的FtCP编码序列克隆至真核表达载体pPICZ（alpha）A中，构建重组真核表达载体pPICZ（alpha）A-FtCP。使用SacⅠ酶线性化重组真核表达载体pPICZ（alpha）A-FtCP后，将其转化至毕赤酵母SMD1168H宿主细胞中，根据Easy-Select™毕赤酵母表达手册用甲醇进行诱导表达。对表达产物进行纯化（纯化方法同1.2.4节），对纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。

（2） FtCP酶活性与酶学特性分析。采用偶氮酪蛋白作为底物，参照文献［20-21］的方法并稍作改良，测定FtCP酶活性，将每分钟使反应混合物在440 nm波长处的吸光度变化0.01所需的酶量定义为1个酶活性单位。试验同时考察了pH（5.5，6.5，7.5，8.5）、温度（30，37，42，55，60，65 ℃）、酶抑制剂苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、酶激活剂（5 mmol/L Mg²⁺、1%Triton X-100）对FtCP酶活性的影响。

2 结果与分析

2.1 FtCP基因的PCR扩增

FtCP基因PCR扩增后获得了一条特异性扩增片段（图1），片段长度与预期大小（1 059 bp）基本一致。

2.2 FtCP基因生物信息学分析

在NCBI数据库中通过BLAST进行FtCP序列相似性比对，结果显示，FtCP基因与其他植物CP基因的核苷酸相似度较高（76%~79%），氨基酸相似度也较高（78%~81%）。DNA Star软件分析结果表明，FtCP序列结构中有11个半胱氨酸（图2），可形成具有多个二硫键的复杂空间结构。用ClustalX2.0和Genedoc软件对FtCP与其他植物CP氨基酸序列进行比对分析，结果表明FtCP序列中有4个酶活性位点关键氨基酸残基，分别是Q₁₃₈、C₁₄₄、H₂₈₇和N₃₁₄；有典型的保守非连续ERFNAQ基序、GNFD基序和GCNGG基序（图3）。

用ExPASy-ProtParam预测FtCP理论分子质量约为39.78 ku，等电点为6.04。SWISS-MODEL三维结构同源建模结果显示，FtCP蛋白以单体形式存在（图4-A），属于木瓜蛋白酶（C1）家族成员，与人源前蛋白酶体的空间模型相似，中间多为凹陷或裂隙状结构，形状大小像口袋，有利于蛋白酶活性中心与作用底物充分结合。通过在线NetOGlyc预测蛋白质序列中的O-糖基化位点，结果表明在蛋白质序列的37和107位S及117位T上可发生O-糖基化（图4-B）。

2.3 FtCP基因组织器官表达分析

由图5可知，FtCP基因在苦荞叶、花、茎和种子中均有表达，但在叶、花中表达量高于茎和种子，表明FtCP基因在不同组织中的表达水平有明显差异。

2.4 FtCP重组蛋白的原核表达与纯化

重组表达载体pET47b-FtCP转入大肠杆菌TOP10，菌落和质粒PCR鉴定结果（图6）显示，扩增的片段长度与预期大小一致。pET47b-FtCP测序和序列比对分析结果表明，FtCP基因开放阅读框正确，全长1 059 bp，编码352个氨基酸。pET47b-FtCP表达产物SDS-PAGE电泳检测结果（图7）表明，FtCP重组蛋白诱导表达成功，其分子质量大小与预期结果（约39.78 ku）相符；诱导表达产物经超声波裂解后离心，取上清和沉淀进行电泳检测，结果表明FtCP蛋白以不正确折叠的包涵体存在；包涵体经尿素复性、层析纯化、透析与浓缩后，结果显示FtCP蛋白纯化效果较好，几乎无杂蛋白。

图6　重组表达载体pET47b-FtCP的PCR鉴定

Fig.6　PCR identification of positive recombinant plasmid pET47b-FtCP

2.5 FtCP多克隆抗体的制备

对制备的多克隆抗体的特异性进行Western blotting分析，结果如图8所示。由图8可知，制备的FtCP多克隆抗体特异性较强，多克隆抗体与种子总蛋白杂交条带清晰，且与种子总蛋白杂交出现了2条条带，表明种子总蛋白中还存在分子量较小的FtCP同源蛋白。

2.6 真核表达FtCP的活性与酶学特性分析

将pPICZ（alpha）A-FtCP重组质粒转化至毕赤酵母SMD1168H感受态细胞，进行诱导表达，表达产物纯化后进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示单一条带，FtCP蛋白浓度较高，条带实际分子质量（45.0 ku）与预测分子质量（约38.66 ku）有差异（图9），推测O-糖基化是分子量差异的重要原因。

酶活性分析结果显示，FtCP酶活性为159 U/mL，酶比活力为636 U/mg。酶学特性分析结果表明，FtCP酶最适pH为6.5，最适温度为55 ℃，PMSF会显著抑制酶活性，而Mg²⁺和Triton X-100对酶活性无明显影响。

3 讨 论

苦荞种子中蛋白质、脂肪、膳食纤维、维生素B2及微量元素等营养物质的含量均显著高于小麦和水稻^［22］，在营养与健康领域具有极高的研究价值，在食品加工及医药领域有巨大潜力。CP是一类在植物体内参与蛋白质代谢调控的关键蛋白酶，苦荞各组织均涉及由CP介导的生理调节过程，其对揭示苦荞种子优质蛋白质资源的调控机制具有重要价值。

目前，多种植物CP基因已被鉴定，但研究焦点多集中于植物受环境胁迫时该基因转录水平的响应表达，而翻译水平上的蛋白酶活性研究则相对匮乏。为深入解析FtCP的代谢机理，本研究成功克隆FtCP基因，其编码产物属于木瓜蛋白酶（C1）家族成员。序列分析表明，在进化过程中FtCP特征结构域高度保守，包含α螺旋中典型的保守非连续ERFNAQ基序、β-折叠弯曲处的GNFD七肽基序，以及紧邻螺旋并向下延伸至4个酶活性位点的QxCxHxN基序。FtCP结构中，底物催化三联体（半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺）及维持酶活性构象的关键谷氨酰胺活性位点残基，均与CP活性抑制剂（胱抑素）的作用区域密切相关^［23-24］。此外，FtCP凹陷或裂隙状结构链上存在高度保守的GCNGG基序，该基序参与FtCP高级结构二硫键的形成，并通过半胱氨酸残基介导细胞内外蛋白质的降解与调节^{［20，25］}。已有研究表明，植物C1家族CP已在原核表达系统中实现异源表达，但萌芽大豆种子中的CP异源表达多以包涵体形式存在^［26］。本研究通过基因原核表达试验证实，FtCP在原核系统中的表达同样以包涵体为主，经蛋白质复性技术^［27］处理，虽在试验条件下未能使FtCP酶恢复活性，但成功获得了高纯度的FtCP蛋白质，为制备FtCP多克隆抗体提供了材料。免疫印迹分析进一步证实，用FtCP制备的多克隆抗体具有较高的特异性，其与苦荞种子总蛋白质杂交时出现了2条条带，揭示种子中存在FtCP的2种同源蛋白，其中一种同源蛋白的分子质量较FtCP更小。采用半定量RT-PCR分析FtCP基因在不同组织中的表达情况，结果发现种子和茎中FtCP基因表达量较低，表明FtCP具有组织表达特异性，这为后续研究FtCP在转录与翻译水平上调控苦荞营养物质积累奠定了基础。

探讨FtCP酶功能不仅对解析苦荞种子总蛋白的贮藏与降解机制、逆境应答、细胞程序性凋亡及抗病性具有重要意义，还可为开发功能性植物源酶制剂应用于工业化生产提供依据^［28］。CP可作为作物抗病育种的分子靶点，其能够通过降解铜伴侣蛋白ATX1来抑制植物疫霉菌的抗性^［29］，这一机制揭示了植物与卵菌互作的新途径，填补了该领域的理论空白。在肉类嫩化过程中，半胱氨酸植物蛋白酶的应用可显著改善牛肉等肉类的整体质地和适口性^［30］。目前，已有优化蛋白质折叠与分泌的策略^［31］，通过构建安全可靠的异源表达载体^［32-33］，可为FtCP酶的大规模生产提供技术保障；在此基础上，进一步分析FtCP酶的催化特性，将有助于开拓其潜在的市场应用需求。该研究分别利用大肠杆菌和毕赤酵母实现FtCP酶的原核与真核系统异源表达，诱导表达结果显示，真核表达的FtCP酶分子量大于原核表达的重组FtCP酶，这是由于毕赤酵母对表达的FtCP酶进行了O-糖基化修饰所致。此外，真核表达的FtCP酶对偶氮酪蛋白底物的酶比活力达到636 U/mg，且在较宽的温度和pH范围内均保持活性。试验测得FtCP的最适作用条件为55 ℃和pH 6.5，PMSF可显著抑制其酶活，而Mg²⁺和Triton X-100对酶活性无显著影响。FtCP酶的催化温度及金属离子敏感性等关键活性参数与从沙姜根茎中分离的KgCP酶^［32］一致。

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基金资助

西安市科技计划项目(25FWQY10)

陕西省教育厅自然科学专项(20JK0876)

西安市科技计划梧桐树科转行动创新团队项目(25WTCY03)