‘翠碧一号’不同部位鲜烟叶成熟过程中代谢物差异分析

Metabolite differences in different parts of fresh CB‐1 tobacco leaves during maturation

摘要

目的 明确‘翠碧一号’（CB-1）成熟过程中上部叶和中部叶物质转化规律及代谢物差异，为‘翠碧一号’上部叶和中部叶适宜采收成熟度的判断提供理论依据。 方法 设置尚熟（M1）、成熟（M2）和过熟（M3）3个成熟梯度，利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）对上部和中部烟叶代谢物进行分析。 结果 不同成熟度鲜烟叶代谢物差异显著，上部叶和中部叶分别筛选出149和271种差异代谢物；上部叶的关键代谢通路为各种生物碱的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，色氨酸代谢及苯丙氨酸代谢；中部叶的关键代谢通路为α-亚麻酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢及抗坏血酸和醛糖酸代谢。3-吲哚丙烯酸、8-羟基-7-甲氧基香豆素、氧化苦参碱是‘翠碧一号’上部叶成熟过程中的关键代谢物，随烟叶采收成熟度的提高，3-吲哚丙烯酸和氧化苦参碱相对含量呈逐渐上升趋势，8-羟基-7-甲氧基香豆素相对含量呈先上升后下降的趋势；α-戊基肉桂醛、壬二酸、2-十二烯二酸是‘翠碧一号’中部叶的关键代谢物，三者相对含量随烟叶采收成熟度的提高呈先上升后下降的趋势。 结论 3-吲哚丙烯酸、8-羟基-7-甲氧基香豆素、氧化苦参碱、α-戊基肉桂醛、壬二酸、2-十二烯二酸可作为‘翠碧一号’烟叶成熟的潜在标志物。

Abstract

Objective The study aims to clarify the patterns of material transformation and metabolite differences in the upper and middle leaves of CB-1 during maturation，providing a theoretical basis for determining the suitable harvesting maturity of upper and middle leaves in CB-1. Method Three maturation gradients were set：immature （M1），mature （M2），and over-mature （M3）.Metabolites in upper and middle tobacco leaves were analyzed using liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） combined with principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）. Result Significant differences in metabolites were observed in fresh tobacco leaves of different maturities.A total of 149 and 271 differential metabolites were screened from the upper and middle leaves，respectively.The key metabolic pathways in the upper leaves involved the biosynthesis of various alkaloids，biosynthesis of phenylalanine，tyrosine，and tryptophan，tryptophan metabolism，and phenylalanine metabolism.The key metabolic pathways in the middle leaves included α-linolenic acid metabolism，cysteine and methionine metabolism，and ascorbate and aldarate metabolism.3-indolepropionic acid，8-hydroxy-7-methoxycoumarin，and oxymatrine were key metabolites in the maturation process of the upper leaves of CB-1.With increasing maturity of the tobacco leaves，the relative contents of 3-indolepropionic acid and oxymatrine showed a gradual upward trend， while the relative content of 8-hydroxy-7-methoxycoumarin first increased and then decreased.α-pentylcinnamaldehyde，azelaic acid，and traumatic acid were key metabolites in the middle leaves，and their relative contents first increased and then decreased with increasing maturity of the tobacco leaves. Conclusion 3-indolepropionic acid，8-hydroxy-7-methoxycoumarin，oxymatrine，α-pentylcinnamaldehyde，azelaic acid，and traumatic acid may serve as potential markers for the maturation of CB-1 tobacco leaves.

Graphical abstract

关键词

烤烟 / 翠碧一号 / 鲜烟叶 / 代谢组学 / 差异代谢物 / 代谢通路

Key words

flue-cured tobacco / CB-1 / fresh tobacco leaves / metabolomics / differential metabolites / metabolic pathways

烟叶适熟采收是决定烟叶品质好坏的关键因素^［1］，对烟叶的工业可用性有重要影响^［2］。研究发现，烟叶成熟度过高或不足会导致烟叶外观质量差、化学成分失衡，如碳水化合物、生物碱和酚类物质异常积累，进而影响烟叶的燃烧性、香气特征及工业可用性^［3-5］，无法满足工业原料需求。烟叶成熟过程是细胞经过一系列复杂生理代谢活动，内在物质不断积累和转化的结果，从而影响烟叶品质^［6］。彭翠云等^［7］基于代谢组学分析发现，延迟采收8 d后，上部烟叶的萜类化合物等关键代谢物含量下调，据此确定了豫中烟区烤烟的最佳采收时间。贾中林等^［8］通过研究烟叶物质代谢变化，发现打顶后第40天是上部烟叶生理功能变化的一个分水岭，标志着其从旺盛期进入衰退期；金国慧等^［9］通过研究代谢物组成，初步确定了浓香型、中间香型、清香型上部烟叶的最佳成熟期分别为打顶后80，52，45 d。因此研究鲜烟叶成熟过程中代谢产物的合成与转化，分析其物质转化规律，可为烟叶成熟度判断提供关键理论支撑。

‘翠碧一号’是福建省三明烟区自主选育的清香型特色烤烟品种，该品种烟叶吃味醇和、香气清雅、品质优良、工业可用性高，深受卷烟企业青睐，并于2012年获得农业部农产品地理标志保护 ^［10-11］。烟叶成熟度与其可用性和品质密切相关^［12］。研究发现随采收成熟度的提高，‘翠碧一号’烤后上部叶和中部叶的香气成分总量和中性组分含量呈先增加后减少趋势，酸性组分逐渐减少，碱性组分则逐渐增加 ^［13］。王涛等^［14］研究表明，‘翠碧一号’随采收成熟度的提高，产量和产值呈先升高后降低趋势，并最终明确‘翠碧一号’上部叶以叶面九到十成黄、主脉全白、支脉变白1/2以上为适宜采收标准，中部叶以叶面八到九成黄、主脉变白2/3以上、支脉变白1/3以上为最佳采收期，此时烤烟彰显出优良的综合品质：外观上结构疏松，橘黄色泽鲜亮，油分彰显；内在化学成分协调，感官评吸体验好，最终凸显出较高的中上等烟比例和产质量。

目前关于烤烟采收成熟度的研究已经取得了一定进展，主要集中在外观形态学指标的判定，即通过观察烟叶的颜色、叶脉、茸毛等外部特征来界定采收时机^［15-17］。此外部分研究也开始深入到单一代谢物，如烟碱、淀粉和蛋白质等关键化学成分的动态变化检测。尽管外观形态和单一代谢物的研究为生产提供了指导，但对特定品种的复杂生理变化缺乏深入挖掘，特别是针对‘翠碧一号’这一特色烤烟品种，目前鲜有报道涉及其成熟过程中多条代谢通路的协同变化。为此，本研究以‘翠碧一号’上部叶和中部叶为研究对象，利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）非靶向代谢组学技术，研究烟叶成熟过程中代谢物的变化规律，旨在为‘翠碧一号’上部叶和中部叶适宜采收成熟度的判断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地概况

供试烤烟品种为‘翠碧一号’。试验于2024年在福建省龙岩市武平县象洞镇富岭村（东经116°23′，北纬25°29′）进行。试验田土壤理化性质为pH值5.4，有机质含量29.81 g/kg，全氮含量2.57 g/kg，全磷含量1.78 g/kg，全钾含量16.34 g/kg，碱解氮含量161 mg/kg，有效磷含量7.18 mg/kg，速效钾含量168.21 mg/kg。其他田间管理和施肥按当地优质烤烟生产技术规范进行。

1.2 试验设计

结合当地烟农上部叶和中部叶实际采收情况，上部叶设置叶面黄绿面积占比70%~80%且主脉变白2/3以上（尚熟，BM1）、叶面黄绿面积占比80%~90%且主脉变白4/5以上（成熟，BM2）、叶面黄绿面积占比90%~100%且主脉全白（过熟，BM3）3个采收成熟度处理；中部叶设置叶面黄绿面积占比60%~70%且主脉变白1/2以上（尚熟，CM1）、叶面黄绿面积占比70%~80%且主脉变白2/3以上（成熟，CM2）、叶面黄绿面积占比80%~90%且主脉变白4/5以上（过熟，CM3）3个采收成熟度处理。2024年1月5日移栽，每个处理设置5个重复，采用随机区组排列，共30个小区，小区面积30 m²，每个小区种植50株烤烟，种植密度为16 500株/hm²。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 样品采集

按照试验设计，于采收当天选取长势一致，正常、无明显病虫害的烟株，上部叶取从上往下第4片叶，中部叶取从上往下第9片叶。取样时，每3片烟叶混合组成一个生物学重复，重复5次。剔除主脉和支脉，将样品用锡箔纸包裹后立即放于液氮中速冻，干冰包埋运输至武汉迈维代谢生物科技股份有限公司检测。

1.3.2 烟叶代谢组学测定

代谢物检测使用LC-MS/MS^［18］，具体操作参考LC-30A超高效液相色谱仪（Shimadzu日本）、TripleTOF 6600+质谱仪（Shimadzu美国）仪器说明书。

1.4 数据分析

利用R（base package）4.1.2对代谢物进行主成分分析（PCA）和R（MetaboAnalystR）1.0.1正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）；再根据OPLS-DA模型得到的变量投影重要度VIP>1.2、差异倍数（fold change）≥2或≤0.5及组间变化的显著性P<0.000 1筛选得到极显著差异代谢物；采用KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析，并基于P≤0.05的显著性阈值，筛选得到显著富集代谢通路。使用迈维云平台（https：//cloud.metware.cn）绘图，Excel 2019绘制三线表。

2 结果与分析

2.1 不同采收成熟度鲜烟叶代谢物主成分分析

如图1所示，不同采收成熟度上部叶和中部叶样品在组内紧密聚类，说明各处理的不同生物学重复之间一致性高、变异小；不同处理组的样品则分布距离较远，这表明采收成熟度是引起烟叶代谢物显著变化的关键因素，代谢物组分随成熟度提高而发生规律性演变。

2.2 不同采收成熟度鲜烟叶差异代谢物筛选

为进一步研究不同采收成熟度鲜烟叶代谢物差异，建立OPLS-DA模型，结果见图2。由图2可以看出，不同采收成熟度上部叶和中部叶整体预测能力（Q²）分别达到0.95和0.93，对OPLS-DA模型进行200次置换检验，Q²回归线与纵轴的交点处于零值以下，且R²Y值大于Q²值。这表明该模型未出现过度拟合问题，可用于后续分析。

根据OPLS-DA模型S-plot分析结果，对其两两分组比较，筛选不同部位差异代谢物，结果如图3所示。由图3可以看出，上部叶中，BM2 vs BM1与BM3 vs BM1组均筛选出58个差异代谢物，BM3 vs BM2组筛选出99个差异代谢物；中部叶中，CM2 vs CM1组筛选出206个差异代谢物，CM3 vs CM2组筛选出159个差异代谢物，CM3 vs CM1组筛选出24差异代谢物。去除3个对比组中重复代谢物后，上部叶和中部叶分别筛选出149和271个差异代谢物，上部叶差异代谢物数量低于中部叶。

分别对不同采收成熟度鲜烟叶差异代谢物类别变化进行分析，结果见图4。

由图4可以看出，M2与M1对比，在上部叶中，苯类、醇胺类、甘油磷脂类、生物碱、萜类、有机酸、杂环化合物和脂质的差异代谢物大多呈现上调趋势，而氨基酸、酚酸类、黄酮、醌类、木脂素和香豆素及其它类的差异代谢物下调数量高于上调数量；在中部叶中，苯类、糖类、醇胺类、酚酸类、黄酮、生物碱、萜类、杂环化合物和甾体的差异代谢物下调数量低于上调数量，而氨基酸、甘油磷脂类、有机酸、脂质、脂肪酰类及其它类的差异代谢物下调数量高于上调数量。M3与M2对比，在上部叶中，糖类、酚酸类、核苷酸类、黄酮、醌类、木脂素和香豆素、生物碱和甾体的差异代谢物多表现为上调，而氨基酸、醇胺类、甘油磷脂类、有机酸、杂环化合物、脂肪酰类、脂质及其它类的差异代谢物下调数量高于上调数量；在中部叶中，脂肪酰类和脂质的差异代谢物上调数量高于下调数量，而氨基酸、苯类、糖类、醇胺类、酚酸类、甘油磷脂类、核苷酸类、黄酮、醌类、木脂素和香豆素、生物碱、萜类、杂环化合物、甾体及其它类的差异代谢物下调数量高于上调数量。

2.3 不同采收成熟度鲜烟叶差异代谢物KEGG富集分析

将上、中部叶中筛选得到的差异代谢物映射到KEGG数据库进行功能注释和通路富集分析，以P≤0.05为阈值筛选出显著富集代谢通路，结果见图5。由图5可以看出，上部叶差异代谢物主要富集的通路包括各种生物碱的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，色氨酸代谢及苯丙氨酸代谢4条代谢通路；中部叶差异代谢物显著富集在α-亚麻酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢及抗坏血酸和醛糖酸代谢3条代谢通路。说明这些代谢途径在烟叶成熟过程中发挥着重要作用。

2.4 不同采收成熟度鲜烟叶核心差异代谢物分析

基于VIP值对显著差异代谢物进行排序，选取排序前10的差异代谢物，并依据其表达量进行层次聚类分析，结果如图6所示。由图6-A可以看出，在上部叶中，相比于BM1，BM2中的苯胺、赖氨酰赖氨酸、分支酸、十二烷基肉碱、氧化苦参碱、8-羟基-7-甲氧基香豆素、3-吲哚丙烯酸等7种差异代谢物上调，没食子酸乙酯、3-甲基-4，8-二羟基-3，4-二氢异香豆素、苦味素等3种差异代谢物下调。由图6-B可以看出，在上部叶中，相比于BM2，BM3中D-NMAPPD、L-色氨酸、绿原酸（3-O-咖啡酰奎宁酸）、3-吲哚丙烯酸等4种差异代谢物上调，癸酰基间硝基苯胺、分支酸、N-（2-羟乙基-1，1，2，2-d4）-5Z，8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酰胺、十二烷基肉碱、N6-乙酰-L-赖氨酸、8-羟基-7-甲氧基香豆素等6种差异代谢物下调。3-吲哚丙烯酸和8-羟基-7-甲氧基香豆素在上部叶中均上调，说明其可能是上部叶成熟过程中的主要代谢物。

由图6-C可以看出，在中部叶中，相比于CM1，CM2中的羟甲苯丁酰胺、对甲氧基苯酚、壬二酸、三叶草碱、槲皮素-3-O-芸香糖苷（芦丁）、去氧那奇诺A等6种差异代谢物上调，D-阿洛糖、12-氧代-5，8，10，14-二十碳四烯酸、6-甲氨基嘌呤、8-羟基-7-甲氧基香豆素等4种差异代谢物下调。由图6-D可以看出，在中部叶中，相比于CM2，CM3中的差异代谢物5，6，7，8-四氢-2-喹诺酮上调，对甲氧基苯酚、槲皮素-3-O-芸香糖苷（芦丁）、莱鲍迪甙D、苦味素、豆蔻明、异绿原酸A、Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、欣巴辛、羟甲苯丁酰胺等9种差异代谢物下调。

Venn结果表明，在上部叶中，不同采收成熟度鲜烟叶共有的差异代谢物有3个，分别是3-吲哚丙烯酸、8-羟基-7-甲氧基香豆素和氧化苦参碱；在中部叶中，不同采收成熟度鲜烟叶共有的差异代谢物有3个，分别是α-戊基肉桂醛、壬二酸和2-十二烯二酸（图7）。上述代谢物可能作为判断烟叶成熟度的潜在标志物，其在上、中部叶中的差异表达可能参与了成熟过程的关键调控。

分析不同采收成熟度对上述核心代谢物相对含量的影响，结果见表1。由表1可以看出，随烟叶采收成熟度的提高，在上部叶中，3-吲哚丙烯酸和氧化苦参碱相对含量呈逐渐上升趋势，8-羟基-7-甲氧基香豆素相对含量呈先上升后下降的趋势，且不同成熟度间差异显著；在中部叶中，α-戊基肉桂醛、壬二酸和2-十二烯二酸相对含量呈先上升后下降的趋势，且不同成熟度间差异显著。这些核心代谢物在不同采收成熟度鲜烟叶的相对含量变化显著，表明其可以作为判断2个部位烟叶是否成熟的潜在标志物。

3 讨 论

烟叶成熟是物质合成、分解、转化、消耗和积累的过程，其代谢物的动态变化可充分且直观反映内在物质的转化过程^［19］。本研究结果显示，在不同采收成熟度下上部叶和中部叶差异代谢物数量变化有所不同，随采收成熟度的提高，上部叶差异代谢物数量总体呈上升趋势，而中部叶则呈下降趋势，这可能是由于上部叶光照强，碳同化旺盛，促进了某些次级代谢产物如酚类物质和生物碱的积累^［20-21］，而中部叶光照弱，光合效率较低，碳同化产物相对较少^［22-23］。

植物生殖生长阶段通常伴随着营养物质从成熟组织流向下沉组织的过程^［24］，因此包括氨基酸在内的营养物质在叶片中的含量会随成熟过程推进而降低。烟叶成熟过程伴随着氮代谢强度的减弱与碳代谢强度的增强^［25］。本研究结果显示，上部叶和中部叶差异代谢物均显著富集在氨基酸生物合成和代谢途径，这表明烟叶成熟过程中伴随着复杂的氨基酸动态变化。氨基酸是植物体内的必需化合物，可以用来合成各种不同功能蛋白质，从而影响植物的生长发育。现有研究表明，随烟叶成熟度的提高，氨基酸生物合成途径中的中间代谢物（脯氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸），其含量呈下降趋势^［26-27］。这与本研究结果一致，即氨基酸类差异代谢物在上部叶和中部叶的M2到M3时期多表现为下调。

在烤烟生产的各个环节中，烟叶成熟度具有重要作用，影响着最终的烟叶品质。成熟度的判断成为确保优质烟叶的重要环节。基于对烟叶成熟的判断，人工评估主观性强^［28］，而现有的数字化方法（机器视觉、光谱法）或局限于外部特征，或易受环境干扰^［29-31］。LC-MS/MS结合代谢分析能深入揭示内部化学变化，是了解烟叶成熟内在驱动因素的有效途径。因此通过建立可量化的判断方法以确定适宜采收成熟度具有重要意义。本研究筛选了判断‘翠碧一号’上部叶和中部叶成熟的核心代谢物，其中上部叶核心差异代谢物为3-吲哚丙烯酸、8-羟基-7-甲氧基香豆素、氧化苦参碱。生物碱的合成与积累是调控烟叶核心品质因子（如吃味、刺激性）的关键生理过程 ^［32］。本研究发现，3-吲哚丙烯酸和氧化苦参碱两种生物碱类物质随烟叶成熟度的增加逐渐积累，与前人研究发现烟叶在成熟过程中生物碱含量逐渐积累^［33-34］相一致。3-吲哚丙烯酸可通过诱导ROS积累破环叶绿体结构，叶绿素降解速度大于合成，从而导致叶片衰老^［35］。氧化苦参碱的合成是由赖氨酸在赖氨酸脱羧酶的催化作用下生成尸胺，通过一系列生化反应合成苦参碱，苦参碱氧化为氧化苦参碱^［36］。苦参碱可通过诱导活性氧（ROS）积累引起光合系统受损，加速叶绿素降解，从而促进叶片进入衰老进程^［37］。8-羟基-7-甲氧基香豆素是香豆素的羟基和甲氧基取代衍生物，香豆素类化合物是一类来源于苯丙烷途径的代谢产物，在植物发育及其与环境因子的相互作用中发挥着重要作用。本研究发现，8-羟基-7-甲氧基香豆素随采收成熟度的提高呈先升高后降低的趋势，这与在祁沙参中香豆素含量随采收时间的延长结果^［38-39］一致。在本研究中，中部叶核心差异代谢物为α-戊基肉桂醛、壬二酸和2-十二烯二酸，其均随采收成熟度提高呈先上升后下降的趋势。α-戊基肉桂醛是一种具有茉莉花香的香气成分，与前人研究证实烟叶香气成分含量随采收成熟度的提高呈先升高后降低的趋势^［40-41］相一致。壬二酸作为细胞膜脂中不饱和脂肪酸氧化的产物，在成熟前期因膜降解和脂氧合酶（LOX）活性增强而大量生成并积累，但在成熟后期因氧化前体耗尽，且其自身作为信号分子被进一步代谢消耗而导致含量下降^［42-43］。2-十二烯二酸属于脂质类物质，其在成熟前期因膜脂降解，并通过β-氧化和ω-氧化途径合成积累而含量升高；在成熟后期，其自身作为底物被进一步β-氧化降解为更短链物质，导致含量下降^［44］。综上所述，3-吲哚丙烯酸、8-羟基-7-甲氧基香豆素、氧化苦参碱、α-戊基肉桂醛、壬二酸和2-十二烯二酸可能作为判断‘翠碧一号’上部叶和中部叶成熟的标志代谢物，其具体的调控机理与判别标准仍需进一步深入研究。

4 结 论

利用代谢组学方法检测和分析‘翠碧一号’上部叶和中部叶在成熟过程中的代谢物变化，结果表明：上部叶成熟过程中起重要调控作用的关键代谢通路可能为各种生物碱的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，色氨酸代谢及苯丙氨酸代谢；中部叶的关键代谢通路为α-亚麻酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢及抗坏血酸和醛糖酸代谢；上部叶在成熟过程中的关键代谢物为3-吲哚丙烯酸、8-羟基-7-甲氧基香豆素和氧化苦参碱，中部叶为α-戊基肉桂醛、壬二酸和2-十二烯二酸。

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基金资助

福建省烟草公司龙岩市公司科技项目(2023350800240041)

福建省烟草公司龙岩市公司科技项目(2022350824240020)

广东中烟工业有限责任公司科技项目(2023440000340013)

广东省基础与应用基础研究基金项目(2024A1515011304)