外源褪黑素对山楂果实品质及软化相关基因表达的影响

Effects of exogenous melatonin on fruit quality and expression of softening‐related genes in hawthorn

摘要

目的 探究外源褪黑素对山楂果实贮藏品质和软化相关基因表达模式的影响，筛选出适宜的褪黑素质量浓度，为山楂贮藏保鲜提供参考。 方法 以‘豫北红’山楂成熟果实为试验材料，分别用0（CK），10，25，75和150 mg/L褪黑素溶液处理，研究不同处理山楂在常温（25±1）℃、相对湿度（85±5）%贮藏过程中的失重率、色泽、硬度、果胶组分及其降解酶活性、丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量、多酚氧化酶（PPO）和抗氧化酶活性等贮藏品质，通过转录组分析软化相关基因的变化规律，结合相关性分析解析生理指标与关键基因表达量之间的关联性。 结果 与CK相比，外源褪黑素处理不仅可以有效抑制贮藏期间山楂果实水分流失，延缓硬度下降，维持果实外观色泽；同时有效抑制多聚半乳糖醛酸酶（PG）和β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性，减缓共价结合型果胶（CSP）降解和水溶性果胶（WSP）含量的升高，降低果实软化速率，起到维持果实硬度的作用。贮藏30 d时，与CK相比，10和25 mg/L褪黑素处理山楂的β-Gal活性分别降低20.37%和24.07%，WSP含量分别降低16.98%和17.57%，CSP含量分别升高101.08%和76.01%。与CK相比，褪黑素处理能显著降低MDA和H₂O₂含量，贮藏至30 d时，10和25 mg/L 褪黑素处理MDA含量分别下降了47.01%和41.84%，H₂O₂含量分别降低了39.69%和30.11%；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）以及抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性在贮藏期间较CK显著提高，其中以10和25 mg/L褪黑素处理的增幅较大，有效维持山楂采后贮藏过程中活性氧（ROS）的代谢平衡。转录组分析表明，外源褪黑素处理促使PME40、PMEU1、PGLR、PLY3、XTH6、EXPA3等多个细胞壁降解相关基因下调表达，延缓了细胞壁的降解和果实软化，维持贮藏期间山楂果实品质。 结论 外源褪黑素可通过下调细胞壁降解相关基因（PME40、PMEU1、PGLR、PLY3、XTH6、EXPA3）的表达，抑制多聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶的活性，延缓共价结合型果胶的降解和水溶性果胶含量的积累，起到维持果实硬度的作用；外源褪黑素还可通过提升超氧化物歧化酶、过氧化物酶以及抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶的活性，维持活性氧的代谢平衡，延缓衰老过程，维持果实品质，且以10~25 mg/L褪黑素处理效果较佳。

Abstract

Objective This study aims to investigate the effects of exogenous melatonin on the storage quality and the expression patterns of softening-related genes in hawthorn fruit，and to screen for an optimal melatonin concentration，thereby providing a reference for hawthorn storage and preservation. Method Using mature ‘Yubeihong’ hawthorn fruits as experimental material，the fuits were treated with melatonin solutions at concentrations of 0 （CK），10，25，75，and 150 mg/L.The fruits were stored at （25±1） ℃ room temperature， and （85±5）% relative humidity.Parameters measured during storage included weight loss rate，color，firmness，pectin composition and the activities of its degrading enzymes，malondialdehyde （MDA） and hydrogen peroxide （H₂O₂） contents，as well as the activities of polyphenol oxidase （PPO） and antioxidant enzymes.Transcriptome analysis was conducted to investigate the changes in softening-related genes，and correlation analysis was combined to analyze the correlation between physiological indicators and the expression levels of key genes. Result Compared with CK，exogenous melatonin treatments not only effectively inhibited water loss of hawthorn fruit during storage，delayed firmness decline，and maintained the external color of hawthorn fruit，but also significantly suppressed the activities of polygalacturonase （PG） and β-galactosidase （β-Gal），slowed down the degradation of covalently-bonded pectin （CSP） and increased water-soluble pectin （WSP） content，thereby reducing the fruit softening rate and playing a role in maintaining fruit firmness.After 30 days of storage，compared with the control，the β-Gal activity of hawthorn treated with 10 and 25 mg/L melatonin decreased by 20.37% and 24.07%，the WSP content decreased by 16.98% and 17.57%，and the CSP content increased by 101.08% and 76.01%，respectively.Compared with CK，melatonin treatments significantly lowered MDA and H₂O₂ contents，after 30 days of storage，the 10 and 25 mg/L melatonin treatments showed the largest reductions in MDA （47.01% and 41.84%） and H₂O₂ （39.69% and 30.11%）.The activities of superoxide dismutase （SOD），peroxidase （POD），and ascorbate peroxidase （APX） were significantly higher than those of the control during storage，among which the 10 and 25 mg/L melatonin treatments showed the largest increases，effectively maintaining the metabolic balance of reactive oxygen species （ROS） in postharvest hawthorn.Transcriptome analysis revealed that exogenous melatonin treatment downregulated the expression of several cell wall degradation-related genes，including PME40，PMEU1，PGLR，PLY3，XTH6，and EXPA3，thereby delaying cell wall degradation and fruit softening，and maintaining fruit quality during storage. Conclusion Exogenous melatonin can maintain fruit firmness by downregulating the expression of cell wall degradation-related genes （PME40，PMEU1，PGLR，PLY3，XTH6，EXPA3），inhibiting the activities of PG and β-Gal，and slowing down the degradation of CSP and the accumulation of WSP.Furthermore，it enhances the activities of antioxidant enzymes such as SOD，POD，and APX，maintains ROS metabolic balance，delays senescence，and preserves fruit quality.The treatments with 10-25 mg/L melatonin show the most favorable effects.

Graphical abstract

关键词

山楂保鲜 / 外源褪黑素 / 果实品质 / 抗氧化酶 / 基因表达分析

Key words

hawthorn fresh preservation / exogenous melatonin / fruit quality / antioxidant enzyme / gene expression analysis

山楂（Crataegus pinnatifida）为蔷薇科山楂属植物，既是我国重要的药食同源经济林树种，也是推动精准扶贫与乡村振兴的重点产业之一^［1］。我国山楂种植面积达466 667 hm²，年产量超过210万t，山楂果实富含酚类及黄酮类化合物等活性成分，具有防治心血管疾病、抗炎、抗氧化和降血脂等多种生理功能^［2］。目前，我国山楂的利用形式主要包括鲜食、加工干片和作药材使用。随着产业规模持续扩大，市场对山楂品质的要求日益提高，然而山楂采收期集中（多集中于9-10月），采后果实生理代谢旺盛，易出现失水软化、果皮褐变、腐烂等品质劣变现象。据统计，常温贮藏条件下山楂采后损耗率高达25%~35%，严重降低了其商品价值和加工利用率。目前，山楂常用的保存方法包括硫化氢处理^［3］、涂膜^［4-5］和包装保鲜^［6-7］等，但因安全性、性价比以及操作困难等因素，应用效果并不理想。因此，寻求安全高效的保鲜技术，实现优质山楂原料全年供应与低成本贮藏，已成为破解山楂产业发展瓶颈，推动山楂产业提质增效的关键。

褪黑素（melatonin，MT），化学名为N-乙酰基- 5-甲氧基色胺，是一种具有多种细胞和生理活性的多功能小分子化合物，具有体内自然降解、无毒、无残留和成本低廉等特点。褪黑素已广泛应用于农产品采后贮藏保鲜^［8］，能显著延缓果蔬成熟和衰老进程，保持感官和营养品质，有效延长货架期^［9］。周甲云等^［10］研究证实，100 μmol/L褪黑素处理可有效维持贮藏期间枇杷的果实品质；许桐等^［11］研究发现，褪黑素处理可抑制李果实采后软化与腐烂，并通过上调PsCHS、PsF3H等结构基因的表达促进花色苷的合成；还有研究表明，10 μmol/L褪黑素处理可通过抑制内源激素合成及延缓细胞壁降解，从而延缓柿果实成熟软化进程^［12］；0.1和1 mmol/L褪黑素处理可促进采后草莓果实内源褪黑素和酚类物质积累、抑制膜脂过氧化，使草莓果实保持较好的感官品质并有效降低腐烂发生率^［13］；150 mg/L外源褪黑素处理可有效保持蓝莓果实的果胶含量，抑制多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶甲酯酶和β-半乳糖苷酶等细胞壁降解酶活性，延缓细胞壁多糖的降解^［14］。因此，作为来源于植物中的天然物质，褪黑素具有显著的贮藏保鲜效果。

目前，关于外源褪黑素对山楂采后贮藏品质的影响及生理机制尚不清楚。因此，本研究以‘豫北红’山楂为试验材料，采用不同质量浓度褪黑素处理，探究外源褪黑素对山楂果实贮藏品质、生理特性及软化相关基因表达的影响，以期筛选出适宜的外源褪黑素处理浓度，初步阐释外源褪黑素延缓山楂果实采后品质劣变的机制，为山楂采后保鲜提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为‘豫北红’山楂果实，于2024-10-08采自河南省新乡市辉县三官庙山楂种植基地，树龄30年，成熟时果面鲜红色，果点明显，果肉粉白色，种子基本褐变，色泽指数为32.5。

1.2 试验处理

山楂果实采收后立即运回实验室，挑选大小一致、着色均匀、无机械损伤和病虫害的果实，随机分为5组，每组150颗，其中4组分别用10，25，75，150 mg/L褪黑素溶液浸泡20 min，依次记为MT1、MT2、MT3、MT4处理，另外一组采用蒸馏水浸泡20 min，记为CK（对照），取出晾干后置于PET保鲜盒中，在温度（25±1） ℃、相对湿度（85±5）%的培养箱中贮藏。分别在贮藏0，6，12，18，24，30 d取样，每组每次随机取20个果实进行指标测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 失重率、色差和果实硬度

采用电子秤称量山楂鲜果质量（精确到0.01 g），失重率参照刘讯等^［15］的方法计算；使用日本柯尼卡美能达CR-400型色差仪测定并记录果实最大横径两侧果皮的色差值L^*、a^*、b^*值，计算C^*值（C^*2=a^*2+b^*2）；采用质构仪（P/2探头，直径2 mm）测定果实硬度，测试距离10 mm，穿刺深度3 mm。

1.3.2 果胶含量和果胶降解酶活性

果胶组分的提取和测定参考ZHI等^［16］的方法，采用咔唑比色法，以半乳糖醛酸为标准来测定水溶性果胶（water-soluble pectin，WSP）、离子结合型果胶（ionically-soluble pectin，ISP）、共价结合型果胶（covalently-bonded pectin，CSP）含量，结果以mg/hg表示。多聚半乳糖醛酸酶（polylacturonase，PG）活性测定参考REN等^［17］的方法，β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）活性测定参考LIN等^［18］的方法，以每分钟引起吸光度值变化0.1为一个酶活力单位（U），结果表示为U/g。

1.3.3 MDA和H₂O₂含量

采用硫代巴比妥酸法^［19］ 测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，采用HUAN等^［20］的方法测定H₂O₂含量。

1.3.4 多酚氧化酶活性

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性测定参照GE等^［19］的方法，以每克新鲜组织每分钟引起吸光度变化0.01为一个酶活力单位（U），结果表示为U/g。

1.3.5 抗氧化酶活性

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性采用双抗体夹心法测定，过氧化物酶（peroxidase，POD）活性参照GE等^［19］的方法测定，以每克新鲜组织每分钟引起吸光度变化0.01为一个酶活力单位（U），结果表示为U/g。

1.3.6 转录组分析

选用蒸馏水处理0 d（CK），10 mg/L（MT1）褪黑素处理6 d（MT6）、12 d（MT12）和24 d（MT24）的山楂果实进行转录组测序，由北京诺禾致源提取样本RNA、进行质量检测，提供建库和测序分析服务，从基因组网站下载山楂的参考基因组和基因模型注释文件（PRJNA-823924）。测序数据经过质量控制、比对和差异表达分析，其中转录组数据通过DESeq 2软件包进行差异表达分析^［21］，筛选出显著差异表达基因（DEGs），DEGs的筛选条件为|log₂FC|≥1.5且FDR<0.05。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2019对试验数据进行整理与分析，结果用“平均值±标准差”表示；使用SPSS 23.0软件进行Dunnett检验、方差分析和相关性分析，采用GraphPad Prism 10软件绘图。

2 结果与分析

2.1 外源褪黑素对山楂外观品质的影响

采后贮藏期间山楂果实外观变化如图1所示。由图1可知，贮藏30 d时，各组山楂果实均出现不同程度的品质劣变现象，与褪黑素处理组相比，对照组（CK）山楂果皮及果肉失水皱缩、褐变现象更明显。

图2-A显示，在整个贮藏过程中，褪黑素处理组和对照组山楂果实的失重率均随贮藏时间的延长而逐渐上升，但褪黑素处理组的上升速度明显低于CK，说明褪黑素处理能有效抑制果实水分流失，延缓果实品质劣变，降低贮藏过程的果实损耗，其中MT1处理效果最为显著。贮藏30 d时，对照组失重率为18.16%，MT1、MT2、MT3和MT4处理组失重率分别为16.22%，18.57%，17.69%和17.83%。

果实硬度是评价果实质地和贮藏品质稳定性的关键指标，硬度值下降通常反映细胞壁的降解以及由此引发的质地软化现象^［22］。由图2-B可知，在山楂贮藏期间，其硬度呈持续下降趋势，且褪黑素处理组的硬度下降速度明显低于CK。贮藏30 d时，CK组山楂果实硬度由初始的1.61 N下降至0.76 N，MT1、MT3和MT4处理组则分别下降至1.24，1.12，0.98 N，极显著高于CK（P<0.01），说明外源褪黑素处理能有效延缓山楂果实硬度的下降，其中MT1和MT3组效果较优。

L^*值代表果实亮度，a^*正值表示果皮的红色程度，b^*正值表示果皮的黄色程度。贮藏期间，山楂果实色泽变化如图2-C~F所示。由图2-C~E可知，贮藏期间L^*、a^*和b^*值均呈下降趋势，且4个外源褪黑素处理组的下降速度明显低于CK，说明褪黑素处理能有效维持贮藏期间山楂果实外观色泽。C^*代表颜色的彩度，C^*值越大表示颜色越纯，色泽越鲜艳^［23］。从图2-F来看，褪黑素处理组延缓了果实C^*值的下降，使果实在贮藏期间保持更好的外观品质。

2.2 外源褪黑素对山楂果胶含量的影响

果胶主要存在于细胞壁中，对果实起支撑作用，其含量与果实质地密切相关^［24］。在果实贮藏期间，共价结合型果胶可逐渐转化为离子结合型果胶和水溶性果胶，因此抑制共价结合型果胶含量的降低可以有效维持山楂果实的硬度^［25］。由图3可知，贮藏期间，对照组和褪黑素处理组山楂果实的共价结合型果胶含量逐渐下降，离子结合型果胶含量先升高后下降，水溶性果胶含量不断升高，说明在果实贮藏初期山楂共价结合型果胶发生去甲酯化反应，解离为离子结合型果胶，且随着贮藏时间的延长，离子结合型果胶不断降解为水溶性果胶。贮藏30 d时，4个褪黑素处理组的共价结合型果胶含量无显著差异，分别为0.81，0.70，0.71和0.72 mg/g，但均极显著高于对照组（0.40 mg/g，P<0.01）；4个褪黑素处理组的水溶性果胶含量分别为2.98，2.96，3.14和3.10 mg/g，均极显著低于对照组（3.59 mg/g）（P<0.01）。

综上可知，4个褪黑素处理组的水溶性果胶含量上升速度和共价结合型果胶含量下降趋势均极显著低于对照组，说明外源褪黑素处理可有效抑制共价结合型果胶的降解和水溶性果胶含量的升高，延缓细胞壁中胶层解体进程，维持果实硬度。

2.3 外源褪黑素对山楂果胶降解酶活性的影响

多聚半乳糖醛酸酶是细胞壁降解的关键限速酶，其活性与果实软化速率呈正相关^［26-27］。β-半乳糖苷酶通过水解果胶侧链半乳糖，破坏细胞壁多糖交联网络从而导致果实软化^［28-30］。图4-A显示，随着贮藏时间的延长，多聚半乳糖醛酸酶活性均上升，与水溶性果胶含量的变化趋势基本一致。贮藏30 d时，对照组多聚半乳糖醛酸酶活性由0.70 U/g升高至1.68 U/g，升高幅度140.0%；4个褪黑素处理组多聚半乳糖醛酸酶活性由高到低依次为MT1（1.62 U/g）>MT2（1.61 U/g）>MT3（1.54 U/g）=MT4（1.54 U/g），均低于对照组（1.68 U/g）。

外源褪黑素对山楂果实β-半乳糖苷酶活性的影响如图4-B所示。由图4-B可知，贮藏期间对照组β-半乳糖苷酶活性波动较大，贮藏0~12 d其活性迅速升高，随后逐渐下降；4个褪黑素处理组山楂果实β-半乳糖苷酶活性的变化相对平缓，均呈先升后降趋势。贮藏30 d时，褪黑素处理组山楂果实β-半乳糖苷酶活性由高至低依次为MT4（0.48 U/g）>MT3（0.46 U/g）>MT1（0.43 U/g）>MT2（0.41 U/g），均极显著低于对照组（0.54 U/g，P<0.01）。因此，外源褪黑素能通过抑制共价结合型果胶降解和水溶性果胶含量升高来维持贮藏期间果实细胞结构，筑牢保护细胞壁结构；同时显著抑制多聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶活性，协同延缓山楂果实软化。

2.4 外源褪黑素对山楂果实丙二醛、过氧化氢含量和多酚氧化酶活性的影响

丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量的增加是反映果实衰老加剧和品质劣变的重要生理指标^［31］。由图5可知，贮藏期间山楂果实的丙二醛和H₂O₂含量均呈上升趋势，且4个褪黑素处理组的上升幅度明显低于对照组。贮藏30 d时，4个褪黑素处理组山楂果实的丙二醛含量均极显著低于对照组（P<0.01），由高到低依次为CK（48.78 μmol/g）>MT4（36.63 μmol/g）>MT3（31.94 μmol/g）>MT2（28.37 μmol/g）>MT1（25.85 μmol/g）； 4个褪黑素处理组山楂果实的H₂O₂含量也均极显著低于对照组（P<0.01），由高到低依次为CK（177.62 μmol/g）>MT4（133.04 μmol/g）和MT3（132.23 μmol/g）>MT2（124.13 μmol/g）>MT1（107.13 μmol/g）。其中10和25 mg/L 褪黑素处理组山楂果实的MDA和H₂O₂含量与CK相比降幅较大，MDA含量较CK分别降低了47.01%和41.84%，H₂O₂含量较CK分别降低了39.69%和30.11%。综上可知，贮藏期间，外源褪黑素处理后山楂果实中的丙二醛和H₂O₂含量降低，说明外源褪黑素能有效抑制山楂果实中丙二醛和H₂O₂含量的积累，这可能与褪黑素激活抗氧化相关酶基因表达，进而提升抗氧化酶活性水平相关^［32］。

多酚氧化酶（PPO）是一种含铜离子的膜蛋白酶，主要分布在细胞质中，能与酚类物质氧化聚合产生黑色物质，是造成果实褐变的主要原因^［33］。图5-C显示，除MT4外，其他褪黑素处理组多酚氧化酶活性均低于对照组。贮藏30 d时，MT3和MT4处理组多酚氧化酶活性与对照组无显著差异，但MT1和MT2处理组多酚氧化酶活性极显著低于对照组（P<0.01）。说明MT1和MT2处理均能有效抑制贮藏期间山楂果实多酚氧化酶活性，抑制贮藏过程中酚类化合物的非酶促褐变反应，降低褐变率。综上可知，外源褪黑素处理能够显著抑制丙二醛和H₂O₂的积累，降低多酚氧化酶活性，从而延缓山楂在贮藏过程中的品质劣变。

2.5 外源褪黑素对山楂果实抗氧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）是植物体内的重要保护酶，在清除自由基中起着重要的作用。其中超氧化物歧化酶是果实抗氧化的第一道防线，在维持组织氧化还原平衡状态中起着重要作用，超氧化物歧化酶催化O^2-转变为毒性相对较低的H₂O₂；过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶协同作用清除细胞中的H₂O₂^［34］。由图6可知，在贮藏期间，褪黑素处理组山楂果实超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性均高于对照组。贮藏30 d时，4个褪黑素处理组超氧化物歧化酶活性均极显著高于对照组（P<0.01）；4个褪黑素处理组过氧化物酶活性均呈先升后降趋势，贮藏18 d时达到峰值，由高到低依次为MT1（10.95 U/g）>MT2（8.33 U/g）>MT3（8.00 U/g）>MT4（6.43 U/g），且均极显著高于CK（4.68 U/g）（P<0.01）。贮藏期间，抗坏血酸过氧化物酶活性呈上升的趋势，贮藏30 d时，4个褪黑素处理组抗坏血酸过氧化物酶活性均极显著高于对照组（P<0.01）。综上所述，外源褪黑素处理能够提高超氧化物歧化酶、过氧化物酶及抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶活性，从而延缓山楂在贮藏过程中的品质劣变。

2.6 外源褪黑素对山楂果实软化相关基因表达的影响

对蒸馏水处理0 d（CK）和10 mg/L褪黑素处理后6 d（MT6）、12 d（MT12）和24 d（MT24）的4份山楂果实进行转录组测序，4个样品的干净数据（clean data）均不低于6.20 Gb，与参考基因组比对效率为82.37%~85.66%，Q30≥95.64%，组内样本间Pearson相关系数的平方（R²）均大于0.90。表明测序数据质量高、重复性良好，可满足转录组分析需求。

随处理时间的延长，外源褪黑素处理组（MT6、MT12、MT24）与对照组（CK）的DEGs数量呈持续增加趋势，其中MT6 vs CK上调基因数为283，下调基因数为1 187；MT12 vs CK上调基因数为522，下调基因数为1 693；MT24 vs CK上调基因数为783，下调基因数为1 913。在所有时间点下调基因数量均显著超过上调基因数量，表明外源褪黑素在山楂果实中引发了以转录抑制为主导的表达过程。

3个比较组中有663个共同上调表达基因和135个共同下调表达基因，其中与果胶和细胞壁代谢相关的关键酶基因有果胶甲酯酶（PME）、果胶裂解酶（PL）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、木葡聚糖内聚糖基转移酶（XTH）、扩张蛋白（EXP）等，这些酶在果实软化和细胞壁降解过程中发挥重要作用^［35］。与对照组相比，外源褪黑素处理极显著下调了PME40、PMEU1、PGLR和PLY3的表达水平（图7- A~D），表明果胶去甲酯化及降解过程受到抑制，有利于维持果实细胞壁结构稳定性、进而维持果实硬度；XTH6的表达呈先升后降趋势，表明褪黑素处理在短期内可延缓细胞壁降解进程（图7-E）；而EXPA3表达持续下调，则表明褪黑素可有效抑制细胞壁松弛速率，降低细胞壁延展性（图7-F）。因此，外源褪黑素处理可通过基因层面上系统性调控细胞壁组织与细胞周边相关通路，协同抑制果胶降解和细胞壁松弛相关关键酶基因的表达，从而在分子水平上延缓果实细胞壁解聚与软化进程，进而影响山楂果实品质。

2.7 山楂果实品质指标与软化相关基因表达水平的相关性

各指标的相关性分析结果（图8）显示，山楂果实的失重率与硬度、a^* 、b^*、共价结合型果胶含量均呈显著负相关（P<0.05），与水溶性果胶和丙二醛含量、多酚氧化酶活性呈显著正相关（P<0.05）；果实硬度与a^* 、共价结合型果胶含量呈显著正相关（P<0.05），与水溶性果胶含量和多酚氧化酶活性呈显著负相关（P<0.05）。说明贮藏期间山楂果实的软化伴随着可溶性果胶含量的增加和褐变的发生。水溶性果胶含量与多聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶活性呈显著正相关（P<0.05），但共价结合型果胶含量则与多聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶活性呈负相关，且与多酚氧化酶活性呈极显著负相关（P<0.01），说明β-半乳糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶共同促进共价结合型果胶降解，导致水溶性果胶含量升高，加剧果实软化。超氧化物歧化酶活性与丙二醛和H₂O₂含量呈显著正相关（P<0.05），抗坏血酸过氧化物酶活性与丙二醛含量呈极显著正相关（P<0.01），说明在采后衰老过程中，活性氧的积累可激活并上调内源抗氧化酶防御系统，超氧化物歧化酶与抗坏血酸过氧化物酶协同响应氧化应激，有助于延缓衰老与品质劣变。PME40、PMEU1、PGLR、PLY3、XTH6、EXPA3基因的相对表达量与果实硬度和L^* 值呈显著正相关（P<0.05），与共价结合型果胶含量呈正相关关系，与水溶性果胶、离子结合型果胶含量以及β-半乳糖苷酶、多酚氧化酶和过氧化物酶活性呈负相关关系，进一步从分子水平支持上述生理代谢的关联性。

3 讨论

3.1 外源褪黑素显著延缓山楂采后外观品质劣变

山楂属于呼吸跃变型果实，贮藏期极易发生软化、褐变及腐烂等品质劣变现象，严重降低其商品价值，因此，采取有效措施延缓品质衰退已成为山楂产业中亟需解决的关键问题。作为植物调节剂和抗氧化系统激活剂，褪黑素在果蔬采后保鲜中有多种生理功能^［36］，能够显著延缓果实品质劣变^［37］。李庚辰等^［38］研究发现，150 μmol/L外源褪黑素能有效保持冬枣贮藏品质并延缓色泽劣变；周甲云等^［10］研究发现，外源褪黑素能够改善枇杷果实的外观品质、生理特性及营养品质。该研究发现，采用外源褪黑素处理山楂果实，可有效抑制贮藏期间的水分流失、延缓硬度下降、维持外观色泽、减缓软化速率，从而保持较高的贮藏品质，其中以10~25 mg/L处理效果较好，这与WANG等^［39］在枇杷上的研究结果一致。

山楂采后外观品质的维持与色泽参数（L^*，a^*，b^*，C^* ）及果实硬度密切相关。贮藏期间，a^*，b^*，C^* 、硬度与多酚氧化酶活性显著负相关（P<0.05），与共价结合型果胶含量显著正相关（P<0.05）。L^* 值、硬度与细胞壁降解相关基因（PME40、PMEU1、PGLR、PLY3、XTH6、EXPA3）的相对表达量显著正相关（P<0.05），说明山楂外观品质的劣变由酶促褐变和细胞壁结构降解共同驱动。外源褪黑素一方面抑制多酚氧化酶活性，另一方面抑制细胞壁降解相关基因表达，显著延缓细胞壁胶层解体进程，从而显著抑制山楂果实在采后贮藏期间的外观品质下降。

3.2 外源褪黑素增强山楂抗氧化能力以缓解采后氧化损伤与衰老

依据自由基衰老理论，果实衰老和品质劣变实质上源于细胞内活性氧（ROS）代谢紊乱。果实在后熟或遭受逆境胁迫时，细胞内活性氧积累可诱导细胞膜脂过氧化，产生脂质自由基，进而引起细胞氧化损伤和膜功能障碍。丙二醛是膜脂过氧化的主要产物之一^［40］，其含量可反映脂质过氧化程度。H₂O₂是一种具有破坏性的活性氧，可引发细胞膜脂过氧化和生物大分子氧化损伤，加剧果实细胞衰老并降低果实贮藏品质^［41］。本研究显示，贮藏期间山楂果实的丙二醛和H₂O₂含量以及多酚氧化酶活性均呈上升趋势，而外源褪黑素处理可显著抑制活性氧关键标志物的积累，维持细胞氧化还原稳态，延缓果实衰老进程。

超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶共同构成植物体内关键的活性氧清除系统，在抵御自由基损伤中发挥核心作用^［42-43］。当活性氧过量积累时，果实防御系统被激活，超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性升高以清除活性氧。本研究证实，褪黑素通过显著激活超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶，提高果实活性氧清除能力，其中10~25 mg/L外源褪黑素处理效果较好。

3.3 外源褪黑素通过抑制细胞壁降解相关酶和基因表达延缓山楂果实软化进程

果胶是维持细胞间粘连与果实质地的关键组分，对细胞壁结构和果实硬度具有重要作用^［44-45］。根据其溶解性差异，通过去离子水、螯合剂和稀碱溶液依次提取，可分别获得水溶性果胶、离子结合型果胶和共价结合型果胶。水溶性果胶作为细胞壁降解的最终产物，其含量与果实软化程度呈正相关^［46］。本研究显示，贮藏期间山楂果实硬度与水溶性果胶含量呈显著负相关（P<0.05），而共价结合型果胶含量与多聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶活性呈显著负相关（P<0.05），表明多聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶通过催化共价结合型果胶降解促进其向水溶性果胶转化，从而导致山楂果实逐渐软化。外源褪黑素处理有效抑制了多聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶的活性，延缓共价结合型果胶降解，有助于维持果实硬度，且以10~25 mg/L外源褪黑素处理效果最为显著，该结果与LI等^［47］提出的褪黑素抑制辣椒细胞壁降解的结论一致。

此外，果实中的PME40、PMEU1、PGLR、PLY3、XTH6、EXPA3等基因在调控细胞壁降解及果实软化和衰老过程中发挥关键作用^［48］。本研究表明，外源褪黑素可显著下调上述基因的表达水平，且这些基因表达的变化与果实硬度、共价结合型果胶和水溶性果胶含量，以及β-半乳糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶、多酚氧化酶和过氧化物酶等活性之间存在不同程度的相关性，推测褪黑素可能通过调节上述基因的表达影响相关酶活性，进而调节果胶代谢、延缓细胞壁降解，最终减缓山楂果实软化和品质劣变。

4 结论

外源褪黑素可有效维持山楂果实采后品质，一方面通过下调细胞壁降解相关基因（PME40、PMEU1、PGLR、PLY3、XTH6、EXPA3）的表达，抑制多聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶的活性，从而延缓共价结合型果胶的降解和水溶性果胶的积累，起到维持果实硬度的作用；另一方面，通过提升超氧化物歧化酶、过氧化物酶以及抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶活性，维持活性氧的代谢平衡，延缓衰老进程，进而维持果实品质，且以10~25 mg/L外源褪黑素处理效果较好。

参考文献

[1] 王玉凤，冯军仁，陈斌，等.3个山楂新品种在张掖地区引种表现及栽培技术［J］.林业科技通讯，2025（1）：66-69.

[2] WANG Y F， FENG J R， CHEN B，et al.Introduction performance and efficient cultivation techniques of 3 new Crataegus pinnatifida in Zhangye area［J］.Forest Science and Technolo-gy，2025（1）：66-69.

[3] 任伟光，张翠英.山楂的研究进展与质量标志物的预测研究［J］.西北药学杂志，2023，38（4）：214-220.

[4] REN W G， ZHANG C Y.Research progress and prediction of quality markers of Crataegi fructus ［J］.Northwest Pharmaceutical Journal，2023，38（4）：214-220.

[5] AGHDAM M S， MAHMOUDI R， RAZAVI F，et al.Hydrogen sulfide treatment confers chilling tolerance in hawthorn fruit during cold storage by triggering endogenous H₂S accumulation，enhancing antioxidant enzymes activity and promoting phenols accumulation［J］.Scientia Horticulturae，2018，238：264-271.

[6] 李娜，张海锋，曹金锋，等 ．纤维素纳米晶-肉桂精油-壳聚糖复合涂膜制备及其对黄山楂金如意的保鲜效果［J］.果树学报，2023，40（3）：556-565.

[7] LI N， ZHANG H F， CAO J F，et al.Preparation of cellulose nanocrystal-cinnamon essential oil-chitosan composite coating and its effect on fruit preservation of Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.［J］.Journal of Fruit Science，2023，40（3）：556-565．

[8] 范春丽，刘晓娟，曲金柱.壳聚糖涂膜处理对山楂贮藏保鲜效果的影响［J］.贵州农业科学，2021，49（6）：108-112.

[9] FAN C L， LIU X J， QU J Z.Effect of chitosan coating treatment on preservation of hawthorn［J］.Guizhou Agricultural Scie-nces，2021，49（6）：108-112.

[10] 王丹.山楂采后MA贮藏品质变化和活性氧代谢的研究［D］.新疆石河子：石河子大学，2015.

[11] WANG D.Study on the changes of storage quality and reactive oxygen species metabolism in hawthorn under modified atmosphere packaging after harvest［D］.Shihezi，Xinjiang：Shihezi University，2015.

[12] 王亮，赵迎丽，闫根柱，等.不同MAP包装内气体变化情况及其对山楂果实品质的影响［J］.中国农学通报，2014，30（24）：283-288.

[13] WANG L， ZHAO Y L， YAN G Z，et al.Changes of gas in diffe-rent MAP and effect of the changes on quality of hawthorn fruit［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2014，30（24）：283-288.

[14] 宋聪慧，郭水欢，史小强，等.褪黑素调控果蔬采后保鲜研究进展［J］.食品科学，2023，44（3）：228-236.

[15] SONG C H， GUO S H， SHI X Q，et al.Research progress on the regulatory effect of melatonin on postharvest preservation of fruits and vegetables［J］.Food Science，2023，44（3）：228-236.

[16] 王洁琼，王军萍，朱丽娟，等.褪黑素对低温贮藏期间荠菜衰老和抗氧化能力的影响［J］.食品科学，2022，43（17）：263-271.

[17] WANG J Q， WANG J P， ZHU L J，et al.Effect of melatonin on the senescence and antioxidant capacity of Capsella bursa-pastoris during low-temperature storage［J］.Food Science，2022，43（17）：263-271.

[18] 周甲云，谭碧其，王羊，等.褪黑素对枇杷果实贮藏品质的影响［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2026，54（1）：57-65.

[19] ZHOU J Y， TAN B Q， WANG Y，et al.Effect of melatonin on the quality of loquat fruit during storage［J］.Journal of Northwest A&F University （Natural Science Edition），2026，54（1）：57-65.

[20] 许桐，王越，吴丽娜，等.褪黑素处理对‘桃形李’采后果实品质及花色苷代谢的影响［J］.园艺学报，2025，52（2）：395-405.

[21] XU T， WANG Y， WU L N，et al.Effects of melatonin treatment on fruit quality and anthocyanin metabolism of postharvest‘Taoxingli’plum［J］.Acta Horticulturae Sinica，2025，52（2）：395-405.

[22] 王雨薇.转录组和代谢组联合分析揭示褪黑素延缓柿果实软化的机制［D］.陕西杨凌：西北农林科技大学，2025.

[23] WANG Y W.Integrated transcriptomic and metabolomic an-alyses revealed the effect of melatonin on delaying persimmon fruit softening［D］.Yangling，Shaanxi：Northwest A&F University，2025.

[24] LIU C H， ZHENG H H， SHENG K L，et al.Effects of melatonin treatment on the postharvest quality of strawberry fruit［J］. Postharvest Biology and Technology，2018，139：47-55.

[25] 孙萌萌，陶乐仁.不同浓度褪黑素对采后蓝莓果实硬度和果胶的影响［J］.亚热带植物科学，2023，52（6）：475-480.

[26] SUN M M， TAO L R.Effects of different concentrations of melatonin treatment on the hardness and pectin of postharvest blueberry fruits［J］.Subtropical Plant Science，2023，52（6）：475-480.

[27] 刘讯，李旭，张运林，等.云南顶瓶梗霉对不同含水率的针叶和阔叶凋落物的降解效果［J］.中南林业科技大学学报，2025，45（9）：12-18，38.

[28] LIU X， LI X， ZHANG Y L，et al.Degradation effect of Acrophialophora yunnanensis on coniferous and broad-leaved litter of different moisture content［J］.Journal of Central South University of Forestry & Technology，2025，45（9）：12-18，38.

[29] ZHI H H， LIU Q Q， XU J，et al.Ultrasound enhances calcium absorption of jujube fruit by regulating the cellular calcium distribution and metabolism of cell wall polysaccharides［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2017，97（15）：5202-5210.

[30] REN Y Y， SUN P P， WANG X X，et al.Degradation of cell wall polysaccharides and change of related enzyme activities with fruit softening in Annona squamosa during storage［J］.Postharvest Biology and Technology，2020，166：111203.

[31] LIN Y F， LIN Y Z， LIN Y X，et al.A novel chitosan alleviates pulp breakdown of harvested longan fruit by suppressing disassembly of cell wall polysaccharides［J］.Carbohydrate Polymers，2019，217：126-134.

[32] GE Y H， DUAN B， LI C Y，et al.γ-aminobutyric acid delays senescence of blueberry fruit by regulation of reactive oxygen species metabolism and phenylpropanoid pathway［J］.Scientia Horticulturae，2018，240：303-309.

[33] HUAN C， HAN S， JIANG L，et al.Postharvest hot air and hot water treatments affect the antioxidant system in peach fruit during refrigerated storage［J］.Postharvest Biology and Technology，2017，126：1-14.

[34] LOVE M I， HUBER W， ANDERS S.Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2［J］.Genome Biology，2014，15（12）：550.

[35] LIU Z W， YAN X W， WANG P W，et al.Changes in fruit texture and cell structure of different pumpkin varieties （lines） during storage［J］.Postharvest Biology and Technology，2024，208：112647.

[36] HAN W J， CAO K， DIAO S F，et al.Characterization of browning during CO₂ deastringency treatment in astringent persimmon fruit［J］.Journal of Food Measurement and Characteri-zation，2022，16（3）：2273-2281.

[37] FAN X G， JIANG W B， GONG H S，et al.Cell wall polysaccharides degradation and ultrastructure modification of apricot during storage at a near freezing temperature［J］.Food Chemistry，2019，300：125194.

[38] 陆玲鸿，马媛媛，古咸彬，等.猕猴桃果实贮藏期间细胞壁多糖物质降解特性及组织结构差异分析［J］.核农学报，2023，37（3）：550-558.

[39] LU L H， MA Y Y， GU X B，et al.Degradation characteristics of cell wall polysaccharides and differences in tissue structure of kiwifruit fruits during storage［J］.Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2023，37（3）：550-558.

[40] 曹森，巴良杰，张鹏，等.水杨酸对蓝莓贮藏品质及果实软化的影响［J］.中国食品学报，2023，23（7）：337-344.

[41] CAO S， BA L J， ZHANG P，et al.Effects of salicylic acid on the storage quality and fruit softening of blueberry［J］.Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2023，23（7）：337-344.

[42] LI R M， ROSADO-SOUZA L， SAMPATHKUMAR A，et al.The relationship between cell wall and postharvest physiological deterioration of fresh produce［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2024，210：108568.

[43] CHEN Y Z， ZHANG S， LIN H T，et al.The role of cell wall polysaccharides disassembly in Lasiodiplodia theobromae-induced disease occurrence and softening of fresh longan fruit［J］.Food Chemistry，2021，351：129294.

[44] 曹如霞，徐舒，李玲，等.甘薯块根贮藏期间细胞壁成分及降解酶活性变化［J］.中国农业大学学报，2020，25（5）：59-69.

[45] CAO R X， XU S， LI L，et al.Changes of cell wall components and degradation enzyme activity in sweet potato storage roots during storage［J］.Journal of China Agricultural University，2020，25（5）：59-69.

[46] LIN L J， CHEN Y Z， LIN H T，et al.The difference of the cell wall metabolism between ‘Fuyan’ and ‘Dongbi’ longans and its relationship with the pulp breakdown［J］.Current Research in Food Science，2023，6：100496.

[47] WANG H， FENG Y C， ZHANG S H，et al.Phosphorylation of MdWRKY70L by MdMPK6/02G mediates reactive oxygen accumulation to regulate apple fruit senescence［J］.Plant Biotechnology Journal，2025，23（6）：2386-2399.

[48] WAN J， WU Y， TONG Z，et al.Melatonin treatment alleviates chilling injury of loquat fruit via modulating ROS metabolism［J］.Journal of Future Foods，2024，13（19）：3050.

[49] HUANG J， GAO X G， SU L L，et al.Purification，characteri-zation and inactivation kinetics of polyphenol oxidase extracted from Cistanche deserticola ［J］.Planta，2023，257（5）：85.

[50] RAO M J， DUAN M Z， IKRAM M，et al.ROS regulation and antioxidant responses in plants under air pollution：molecular signaling，metabolic adaptation，and biotechnological solutions［J］.Antioxidants，2025，14（8）：907.

[51] 葛廷，黄雪，谢让金.多聚半乳糖醛酸基因在果树中的研究进展［J］.植物生理学报，2019，55（8）：1075-1088.

[52] GE T， HUANG X， XIE R J.Recent advances in polygalacturonase gene in fruit tree species［J］.Plant Physiology Journal，2019，55（8）：1075-1088.

[53] 刘建龙.外源褪黑素对梨果实发育、采后品质和抗轮纹病的影响及其调控机制研究［D］.陕西杨凌：西北农林科技大学，2019.

[54] LIU J L.Regulatory function of exogenous melatonin on fruit development，postharvest fruit quality and ring rot disease resistance in pears［D］.Yangling，Shaanxi：Northwest A&F University，2019.

[55] 黄帅，张琪，雷雅馨，等.外源褪黑素延缓哈密瓜果实采后冷害及对品质的影响［J］.保鲜与加工，2025，25（3）：9-17.

[56] HUANG S， ZHANG Q， LEI Y X，et al.Effects of exogenous melatonin on postharvest chilling injury and quality of Hami melon fruits［J］.Storage and Process，2025，25（3）：9-17.

[57] 李庚辰，黑鸿爱，耿子凡，等.褪黑素处理对采后冬枣贮藏期间品质的影响研究［J/OL］.食品与发酵工业，2025：1-14. （2025-08-19）.

[58] LI G C， HEI H A， GENG Z F，et al.Effect of melatonin treatment on the quality of postharvest winter jujube during storage［J/OL］.Food and Fermentation Industries，2025：1-14.（2025- 08-19）.

[59] WANG D， CHEN Q Y， CHEN W W，et al.Melatonin treatment maintains quality and delays lignification in loquat fruit during cold storage［J］.Scientia Horticulturae，2021，284：110126.

[60] LIU J， LI Q X， CHEN J J，et al.Revealing further insights on chilling injury of postharvest bananas by untargeted lipidomics［J］.Foods，2020，9（7）：894.

[61] 高媛，薛艳红，刘士平.植物抗氧化动态平衡研究进展［J］.生物资源，2019，41（1）：14-21.

[62] GAO Y， XUE Y H， LIU S P.Advances in antioxidative stress metabolism in plants［J］.Biotic Resources，2019，41（1）：14-21.

[63] 刘晓龙，叶世河，廖俊婕，等.灌浆初期高温胁迫对水稻籽粒活性氧积累及产量形成的影响［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2024，52（5）：33-47.

[64] LIU X L， YE S H， LIAO J J，et al.Effect of heat stress during early filling stage on ROS accumulation and yield formation in rice grain［J］.Journal of Northwest A&F University （Natural Science Edition），2024，52（5）：33-47.

[65] 韩敏，张文娟，刘丽，等.贮藏温度对潍县萝卜肉质根抗氧化能力的影响［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2021，49（8）：91-100.

[66] HAN M， ZHANG W J， LIU L，et al.Effects of storage temperature on antioxidant capacity of Weixian radish taproots［J］.Journal of Northwest A&F University （Natural Science Edition），2021，49（8）：91-100.

[67] 韩卫娟，刁松锋，张悦，等.无核君迁子果实发育成熟过程中生理指标变化规律［J］.浙江农林大学学报，2022，39（3）：554-561.

[68] HAN W J， DIAO S F， ZHANG Y，et al.Variation patterns of physiological indices of seedless Diospyros lotus during fruit development and ripening［J］.Journal of Zhejiang A&F University，2022，39（3）：554-561.

[69] 韩卫娟，傅建敏，王丽媛，等.油柿果实成熟过程中生理指标的变化规律［J］.中南林业科技大学学报，2021，41（9）：14-21.

[70] HAN W J， FU J M， WANG L Y，et al.Research on physiological qualities during fruit ripening of Diospyros oleifera Cheng［J］.Journal of Central South University of Forestry & Technology，2021，41（9）：14-21.

[71] 乔沛，李慧星，罗建成，等.外源褪黑素对采后西梅的贮藏品质及软化相关基因表达的影响［J］.食品工业科技，2025，46（9）：340-351.

[72] QIAO P， LI H X， LUO J C，et al.Effect of exogenous melatonin on postharvest storage quality and softening-related gene expression of Prunus domestica ［J］.Science and Technology of Food Industry，2025，46（9）：340-351.

[73] LI P P， ZHANG R H， ZHOU H D，et al.Melatonin delays softening of postharvest pepper fruits （Capsicum annuum L.） by regulating cell wall degradation，membrane stability and antioxidant systems［J］.Postharvest Biology and Technology，2024，212：112852.

[74] XU J Y， ZHANG Y， HUO H L，et al.Integrated omics reveal the mechanisms underlying softening and aroma changes in pear during postharvest storage and the role of melatonin［J］.BMC Plant Biology，2025，25（1）：679.

基金资助

国家重点研发计划项目(2023YFD1600803)