近年来地球温室效应加重,干旱频发,严重影响我国尤其西北地区蔬菜生长发育。番茄(
Solanum lycopersicum L.)作为我国栽培面积较大的蔬菜之一,受到干旱的严重影响
[1],研究提高番茄植株的抗旱性具有重要意义。在干旱胁迫下,植物体内会发生一系列形态和生理生化变化,以维持其营养生长和生殖生长,提高干旱胁迫下生存概率,这种能力统称为植物的抗旱性
[2-3]。干旱胁迫使植物叶片的水分含量下降,从而阻碍叶绿素的合成,导致植物光合作用减弱
[4]。光合作用是植物体内进行能量转化和物质积累的重要过程之一,为植物生长发育提供能量
[5]。研究表明干旱胁迫下红豆草的净光合速率和气孔导度等光合气体交换参数降低,气孔关闭,导致光合能力下降
[6]。叶绿素荧光参数能够反映植物对光能的吸收及利用效率
[7],是研究植物光合作用的重要手段之一。因此,本研究使用叶绿素荧光与光合气体交换参数来分析植物受干旱胁迫的程度。
转录因子(transcription factor,TF),也称为反式作用因子,特异性地与基因启动子上的顺式作用元件结合后,激活或抑制相应基因表达
[8]。MYB转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一,广泛参与调控植物的多种生命活动
[9],已被证实参与植物响应干旱、低温、高温等多种非生物胁迫的响应过程
[10]。例如,水稻
OsMYB1
R1基因负调控水稻抗旱性
[11];
ZmMYB69基因通过参与清除活性氧、提高渗透调节物质含量使玉米在干旱胁迫下具有更强的抗旱性
[12];在甘薯中也发现
IbMYB1基因能够提高植株体内抗氧化酶活性,从而增强甘薯对干旱胁迫的抗性
[13]。以上研究结果说明,MYB转录因子家族能够通过多种方式参与植物对干旱胁迫的响应过程,从而影响植物的抗旱性。
在干旱胁迫环境下,多种转录因子被激活或抑制,从而调控下游基因的表达。这些转录因子主要包括AREB/ABFs、DREBs、NACs、MYBs和WRKYs等家族成员
[14]。DREB通过调控蜡质的合成进而提高拟南芥的抗旱性
[15]。除此之外,植物在受到干旱胁迫后会通过调节体内的抗氧化酶活性来增强自身抗旱性
[16],例如,茄子中
SmMYB13基因在干旱胁迫中对植株体内抗氧化酶活性起正调控作用,从而提升植株的抗旱性
[17]。抗氧化酶活性的提高主要与增强体内抗氧化酶相关基因的表达有关
[18]。例如,
PdbMYB6转基因杨树的
PdbSOD1、
PdbPOD6和
PdbP5
CS等基因表达水平均升高
[19];玉米中的
ZmPOD5则通过调节植株对活性氧的清除能力来调节植株的抗旱性
[20];在干旱胁迫下,番茄体内的
SlCAT1基因表达水平显著升高,从而提高番茄植株的CAT活性,增强其抗旱性
[21]。本课题组前期研究发现,在番茄植株中过表达油菜素内酯受体基因
SlBRI1使其抗旱性更弱,且RNA-seq数据(PRJNA745152)及RT-qPCR试验结果显示,在干旱胁迫下和
SlBRI1过表达植株中
SlMYB43基因的表达水平显著升高
[22]。因此,本试验使用番茄品种‘Micro Tom’及过表达
SlMYB43番茄植株作为试验材料,研究干旱胁迫下过表达
SlMYB43对番茄植株光合特性的影响及干旱胁迫响应基因表达水平的变化,从而探究
SlMYB43与植物抗旱性之间的关系,旨在为后续完善油菜素内酯受体基因
SlBRI1参与调控植物抗旱性的机制提供参考,并为阐明MYB家族参与响应干旱的机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料及设计
试验材料为番茄‘Micro Tom’野生型植株(WT)种子及其SlMYB43过表达T3代种子。根据PCR鉴定结果以及表达量高低选取2个独立的纯合SlMYB43过表达株系(SlMYB43-6、SlMYB43-19)进行试验。试验在西华师范大学生命科学学院实验室内进行。选取饱满且大小一致的试验材料种子,消毒、浸种后置于25 ℃培养箱中催芽,种子露白后播于营养钵内(育苗基质与MIKSKAAR草炭基质体积比为1∶1),幼苗生长在温度为25 ℃、光周期为16 h/8 h(光/暗)的温室中。当番茄幼苗长至五叶一心时,对WT、SlMYB43-6和SlMYB43-19幼苗进行5 d不供水处理,试验设3次重复,每次重复均含有20株幼苗。测定干旱胁迫0和5 d后幼苗叶片的失水率、光合作用参数以及逆境相关基因转录水平。
1.2 转基因植株DNA提取和鉴定
植物总DNA提取采用CTAB法,参考刘秀丽等
[23]的方法,略有改动。取适量叶片研磨,加入60 ℃预热好的CTAB溶液,加入0.1 μL RNase后在60 ℃水浴锅中温育。取出冷却后加入等体积异戊醇混匀后离心。取300 μL上清液加入750 μL无水乙醇和30 μL的NaAc溶液,轻轻颠倒混匀后在-20 ℃冰箱中沉淀1 h以上。沉淀完成后立即离心,弃上清液,加入体积分数75%乙醇漂洗离心3 min,重复2次后去除上清液并干燥沉淀,用10 μL无菌水溶解,即得到所需DNA溶液。将获得的DNA溶液在T100-Thermal Cycler(BIO-RAD Laboratories,美国)进行PCR扩增,体系如下:3.5 μL ddH
2O,5 μL 2×
Taq mix,正反引物各0.5 μL,DNA溶液0.5 μL。扩增后使用1.2%琼脂糖凝胶电泳并在Gel-Doc XR+凝胶成像系统(BIO-RAD Laboratories,美国)成像。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 离体叶片失水率
离体叶片失水率参照LIU等
[24]的方法测定,略有改动。将生长状态一致的番茄叶片剪下,先测量其叶片质量,后分别放于干燥培养皿中,培养皿置于无风处,分别于2,4,8,16,24,36 h测量其质量,最后计算叶片失水率。
1.3.2 气体交换参数
气体交换参数参照杨文文等
[25]的方法测定。在晴朗天气下8:00-10:00使用Li-6400XT便携式光合作用测量系统(Li-COR公司,美国)测量干旱处理0和5 d后番茄幼苗从上至下第3片叶光合参数,具体测量指标包括净光合速率(
Pn)、气孔导度(
Gs)、胞间CO
2浓度(
Ci)、蒸腾速率(
Tr),各处理均测量6株番茄幼苗。
1.3.3 叶绿素荧光参数
参照李佳佳等
[26]的方法测定叶绿素荧光参数。叶片进行30 min暗处理后,使用Mini-PAM Ⅱ超便携式调制叶绿素荧光仪(WALZ公司,德国)测定叶绿素荧光参数值。具体包括光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学效率(
Fv/Fm)、实际光能转化效率(
ΦPSⅡ=(
Fm'-
Fo')/
Fm')、开放PSⅡ反应中心最大光能转化效率(
Fv'/Fm'=(
Fm'-
Fo')/
Fm') 及光化学淬灭系数(
qP=(
Fm'-
F)/(
Fm'-
Fo'))。其中,
Fm为最大荧光产量,是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量,可反映经过PSⅡ的电子传递情况;
Fo为固定荧光,或者初始荧光,是PSⅡ反应中心处于完全开放时的荧光产量,它与叶片叶绿素浓度有关;
Fv(
Fm-
Fo)为可变荧光,反映了Q
A的最大还原情况;
F为任意时间实际荧光产量;
Fm'为光下最大荧光;
Fo'为光下最小荧光。各处理均测量6株番茄幼苗。
1.3.4 基因转录水平
参照杨文文等
[25]的方法测定基因转录水平。取干旱处理0,5 d番茄幼苗叶片,使用TIANGEN植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取RNA。质量合格的RNA使用Vazyme反转录试剂盒(R312)合成cDNA。在Bio-Rad CFX 96实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad Laboratories,美国)中进行RT-qPCR反应,每个样品3次重复。以番茄基因
SlUBI3为内参基因,计算所有相关逆境响应基因(
SlCAT1、
SlDREB、
SlFe-
SOD、
SlLeP5
CS)的转录水平。
1.4 数据处理
试验数据均使用SPSS26.0软件分析,采用LSD多重比较进行差异显著性分析和多重比较(P<0.05),数据用“平均值±标准误”表示。
2 结果与分析
2.1 过表达SlMYB43番茄植株的筛选与鉴定
系统发育分析结果(
图1)表明,
SlMYB43与茄科植物枸杞
LbMYB20密切相关。
图2-A显示,通过PCR鉴定并筛选了
SlMYB43的阳性植株。同时,以T
0代转基因植株的表型以及收获的种子数量较多为标准,选择其中5个株系进行播种,对T
1代植株进行
SlMYB43表达水平的检测(
图2-B),并根据表达水平的检测结果选择其中表达量较高的2个株系(
SlMYB43-6、
SlMYB43-19)收获种子,作为试验材料进行后续试验。
2.2 干旱胁迫对番茄植株SlMYB43表达水平的影响
图3-A显示,在干旱胁迫0~5 d内,野生型番茄植株体内
SlMYB43表达水平均比胁迫前显著提升,先在干旱处理1 d时达到最高值,之后逐渐降低,又在干旱处理5 d时再次升高,但此时仍显著低于干旱处理1 d时水平。这说明干旱胁迫能显著诱导番茄体内
SlMYB43基因表达,且在干旱处理5 d时再次回升,故选择干旱处理5 d作为试验时间点进行后续试验。
同时,在干旱胁迫5 d后,过表达番茄植株体内
SlMYB43表达水平如
图3-B所示。其中,在干旱处理0 d时,过表达番茄植株
SlMYB43-6和
SlMYB43-19的
SlMYB43基因表达水平均显著高于野生型,分别是野生型的5.38倍和13.25倍;在干旱处理5 d之后,各类植株
SlMYB43表达水平显著升高,此时过表达植株
SlMYB43-6和
SlMYB43-19的
SlMYB43表达水平仍显著高于野生型,分别是野生型的2.04倍和4.07倍,表明过表达番茄植株中
SlMYB43基因的表达水平受干旱胁迫诱导而显著增强。
2.3 干旱胁迫对两类番茄植株表型和叶片失水率的影响
图4-A表明,在干旱胁迫0 d时,所有番茄植株间的生长状态均无明显差异;在干旱胁迫5 d后,所有植株均出现不同程度的萎蔫。其中,野生型植株仅出现叶片下垂、叶缘轻微卷曲现象,而过表达植株
SlMYB43‐6与
SlMYB43‐19叶片下垂与叶缘卷曲程度更明显,植株萎蔫程度更严重。由此可见,
SlMYB43过表达植株的抗旱能力比野生型更弱。
进一步将各类植株叶片剪下,测量离体叶片失水率。结果(
图4-B)显示,所有番茄植株的离体叶片失水率均随干旱胁迫时间增加而逐渐增大,且
SlMYB43过表达株系离体叶片失水率在所有时间均显著高于同期野生型,两个过表达株系之间始终无显著性差异。这表明过表达
SlMYB43导致番茄植株叶片锁水能力下降,叶片失水增强,造成叶片中叶绿素生物合成受阻,吸收光能的能力下降,从而降低了植株的抗旱能力。
2.4 干旱胁迫对两类番茄植株叶片气体交换参数的影响
干旱胁迫植株叶片气体交换参数的测定结果(
图5)显示,在干旱胁迫0 d时,番茄叶片的
Pn、
Gs以及
Ci在所有植株间均无显著差异;在干旱胁迫5 d后,所有植株的
Pn、
Gs、
Tr均比0 d时大幅度降低,而
Ci值则明显升高。在各类植株间相比较,干旱胁迫5 d后过表达株系
SlMYB43-6
、SlMYB43-19的
Pn显著低于野生型植株,分别是野生型的60.11%和52.08%,而其
Gs、
Tr和
Ci均显著高于同期野生型,
Gs分别是野生型的1.17倍与1.19倍,
Tr分别是野生型的2.08倍与1.54倍,
Ci分别是野生型的1.49倍与1.15倍。以上结果表明干旱胁迫会抑制所有番茄植株叶片的气孔活动,影响番茄植株气体交换,损伤植株光合作用;过表达
SlMYB43会导致番茄植株净光合速率显著降低,使番茄植株光合作用能力显著下降,导致其抗旱能力明显减弱。
2.5 干旱胁迫对两类番茄植株叶片叶绿素荧光参数的影响
图6显示,在干旱胁迫0 d时,所有番茄植株间叶片叶绿素荧光参数
Fv/Fm、
ΦPSⅡ以及
qP均无显著差异,但过表达植株
Fv´
/Fm´显著低于野生型植株;在干旱处理5 d后,所有植株的荧光参数均比0 d时显著降低。其中,干旱胁迫5 d后,过表达株系
SlMYB43-6
、SlMYB43-19的叶绿素荧光参数均显著低于野生型植株,
Fv/Fm分别是野生型的96.84%和97.85%,
ΦPSⅡ分别是野生型的86.82%和88.23%,
Fv´
/Fm´分别是野生型的95.49%和97.67%,
qP分别是野生型的91.92%和89.81%。以上结果说明,干旱胁迫对各类番茄植株叶片的叶绿体结构均会造成损伤,显著限制了PSⅡ的光能吸收和利用,导致光抑制现象发生,番茄植株的光合作用效率显著减弱;过表达
SlMYB43基因会加强干旱胁迫对植株荧光特性的影响,进一步显著降低番茄植株抗旱性。
2.6 干旱胁迫对两类番茄植株逆境响应基因表达水平的影响
图7显示,在干旱胁迫5 d时,过表达
SlMYB43基因番茄植株的逆境响应基因表达水平大多显著低于野生型植株,仅
SlDREB基因表达水平显著高于野生型植株,所有基因干旱胁迫后表达水平均比胁迫前大幅度提升。
其中,干旱胁迫0 d时,过表达株系SlMYB43-6、SlMYB43-19的SlFe-SOD相对表达量分别是野生型的53.67%和54.00%,其SlDREB相对表达量分别是野生型的1.68倍和1.35倍,且差异均达到显著水平;SlMYB43-6番茄植株SlLeP5CS相对表达量与野生型无显著差异,SlMYB43-19番茄植株SlLeP5CS相对表达量显著高于野生型,是野生型的1.47倍;两个过表达株系SlCAT1相对表达量与野生型均无显著差异。在干旱胁迫5 d后,过表达株系SlMYB43-6、SlMYB43-19的SlFe-SOD、SlLeP5CS、SlCAT1相对表达量均显著低于相应的野生型,SlFe-SOD相对表达量分别是野生型的53.74%和61.80%,SlLeP5CS相对表达量分别是野生型的66.58%和82.19%,SlCAT1相对表达量分别是野生型的55.47%和66.66%;过表达株系SlMYB43-6、SlMYB43-19的SlDREB相对表达量均显著高于野生型,分别是野生型的1.81倍和1.91倍。以上结果表明,过表达SlMYB43会导致番茄植株多数干旱胁迫响应相关基因的表达水平更低,从而抑制植株对干旱胁迫的适应能力。
3 讨论
光合作用制造有机物并提供其他生命活动所需能量,是植物生长发育过程中的重要生理活动
[27]。光合气体交换参数是植物进行光合作用能力的直观体现,其中光合速率是反映干旱胁迫对植物光合系统危害程度的重要指标
[28]。有研究发现,干旱胁迫导致植物水分含量降低,影响植物的气孔开合以及气体交换,导致植物光合作用受阻
[22]。本研究结果显示,过表达
SlMYB43番茄植株叶片的失水更严重,表明过表达
SlMYB43可能使番茄植株的保水能力减弱,阻碍其光合作用。同时,本研究中干旱胁迫5 d后所有番茄植株的
Pn、
Gs、
Tr降低,
Ci升高,表明干旱胁迫导致植株气孔活动受到影响,气体交换受阻,光合能力降低。这与许照绮等
[29]发现在干旱胁迫下荨麻叶片的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均降低,气孔导度降低趋势更明显的结果一致。表明本研究中过表达
SlMYB43番茄植株光合能力降低的直接原因与气孔有关。另外,在干旱胁迫5 d后,本研究中过表达
SlMYB43番茄植株的
Pn显著低于野生型,其余气体交换参数显著高于野生型,表明在干旱胁迫下过表达
SlMYB43会导致番茄植株叶片净光合速率下降更严重,光合能力更低。
叶绿素荧光参数能直接反映光系统Ⅱ(PSⅡ)对光能吸收和利用情况,是衡量植物响应干旱的重要指标之一
[30],其中
Fv/
Fm和
ΦPSⅡ的变化能反映植物光抑制程度,
Fv'/Fm'与
qP的变化能体现植物光合作用暗反应受到的影响
[31]。叶绿素荧光参数降低表明植株光抑制现象加重,光合效率降低
[32]。本研究结果显示,在干旱胁迫5 d后,所有番茄植株的各荧光参数均显著降低,表明在干旱胁迫下番茄植株光系统Ⅱ受到破坏,光能的吸收与利用受到限制,这与谢丰璞等
[33]在药用大黄中发现干旱胁迫导致植株
Fv/
Fm、
ΦPSⅡ和
qP下降的结果一致,表明干旱胁迫会导致CO
2同化受阻,光合电子传递效率降低,阻碍植株进行光合作用。同时,在干旱胁迫5 d后,
SlMYB43过表达番茄植株的
Fv/
Fm、
ΦPSⅡ、
Fv'/Fm'和
qP均显著低于野生型,表明过表达
SlMYB43导致干旱胁迫下番茄植株光系统受到损伤更严重,光能吸收效率更低,缓解干旱损伤能力降低。
植物受到非生物胁迫后体内多种转录因子被激活或抑制,从而调控下游基因的表达,并诱导一系列生理生化过程抵御非生物胁迫,其中抗氧化系统是最重要的系统之一
[34]。抗氧化酶活性是代表植株清除体内活性氧能力的最直接指标之一
[35]。DREBs、NACs、MYBs和WRKYs等转录因子家族中许多成员受到非生物胁迫,尤其是干旱胁迫的诱导
[14]。本研究结果显示,在干旱胁迫0 d时,
SlMYB43过表达番茄植株
SlFe-
SOD和
SlDREB表达水平显著高于野生型,
SlCAT1表达水平与野生型植株无显著差异;在干旱处理5 d后,过表达番茄植株
SlLeP5
CS、
SlFe-
SOD和
SlCAT1表达水平均显著低于野生型,
SlDREB表达水平显著高于野生型,这表明在干旱胁迫下
SlMYB43能一定程度抑制番茄植株体内抗氧化酶合成基因的表达,这与CHEN等
[21]发现干旱胁迫下番茄体内的
SlCAT1表达水平显著升高,从而提高番茄植株CAT活性,增强其抗旱性这一结果相对应。表明
SlMYB43可以抑制植物体内抗氧化酶合成基因表达,减弱植株抗氧化能力,导致植株抗旱能力降低。
4 结论
与WT植株相比,过表达SlMYB43基因将显著加重干旱胁迫对番茄幼苗的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、叶绿素荧光参数的影响,降低相关逆境响应基因SlCAT1、SlDREB、SlLeP5CS和SlFe-SOD的表达水平。过表达SlMYB43可能通过减弱干旱胁迫下番茄植株的光合特性,下调响应干旱胁迫相关基因的表达,使干旱胁迫对番茄植株光合作用的抑制更加严重,导致番茄植株抗旱性显著降低。
四川省科技厅面上基金项目(2024NSFSC0396)