纤维素降解菌ZZ04的分离鉴定及产酶条件优化

Isolation，identification，and cellulase production optimization of cellulolytic bacterium ZZ04

摘要

目的 筛选高效纤维素降解菌，并对其产酶条件进行优化，为玉米秸秆等农业废弃物的工业化处理和利用提供参考。 方法 使用纤维素-刚果红透明圈法，从玉米种植基地腐殖层土壤中分离具有高纤维素酶活性的降解菌，通过形态学观察并结合分子生物学方法，对筛选出的菌株进行鉴定，然后对该菌株的营养条件和培养条件进行优化。 结果 从土壤中分离获得一株纤维素降解菌ZZ04，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌株培养时的最适碳源为羧甲基纤维素钠（CMC-Na），氮源为蛋白胨与酵母粉的等量混合物，碳氮比为2∶4，接种量为3%，培养基初始pH值为7，培养温度为35 ℃，培养时间为48 h，在此条件下菌株ZZ04产羧甲基纤维素酶（CMC）活性和滤纸酶（FPA）活性分别高达222.14和171.21 U/mL。 结论 筛选的贝莱斯芽孢杆菌ZZ04在最佳培养条件下的纤维素酶活性较高，具有开发微生物降解菌剂的潜力。

Abstract

Objective This study aims to screen for efficient cellulose-degrading strains，and optimizes their enzyme production condition，thereby providing a reference for the industrial treatment and utilization of such agricultural waste as corn straw. Method Using the cellulose-Congo red clear zone method，strains with high cellulase activity were isolated from the humus layer soil of a corn planting base.The selected strains were identified by morphological observation combined with molecular biological analysis，followed by optimization of their nutritional and cultural conditions. Result A cellulose-degrading strain ZZ04 was isolated from soil and identified as Bacillus velezensis.The optimal culture conditions for this strain were as follows：CMC-Na as the carbon source，an equal mixture of peptone and yeast extract as the nitrogen source，a carbon-to-nitrogen ratio of 2∶4，an inoculation size of 3%，an initial medium pH of 7，a culture temperature of 35 ℃，and an incubation time of 48 h.Under these conditions，the carboxymethyl cellulase （CMC） activity and filter paper activity （FPA） of the strain reached 222.14 U/mL and 171.21 U/mL，respectively. Conclusion The screened strain B.velezensis ZZ04 exhibits high cellulase activity under optimal culture conditions， indicating its potential for development as a microbial degradation agent.

Graphical abstract

关键词

纤维素降解菌 / 贝莱斯芽孢杆菌 / 微生物降解菌剂 / 营养条件 / 培养条件 / 纤维素酶活性

Key words

cellulose-degrading bacterium / Bacillus velezensis / microbial degradation agent / nutritional conditions / culture conditions / cellulase activity

纤维素是地球上储量最丰富的天然高分子化合物，也是高等植物细胞壁的核心结构成分，在植物中的含量占比达35%~50%，全球纤维素的年产量规模约为10¹⁰~10¹¹ t，其高效降解与资源化利用对于缓解能源危机及治理环境污染具有重要的战略意义^［1-2］。作为自然界中分布最广、储量最多的多糖类物质，纤维素的最小组成单元为葡萄糖，但天然纤维素结构稳定、难以降解，传统处理方式普遍存在效率低下、污染严重等问题，限制了其资源潜力的发挥^［3-4］。在自然界中，纤维素的自然降解主要依赖纤维素降解菌的代谢作用，这类微生物可分泌纤维素酶将纤维素逐步分解为寡糖、纤维二糖，最终转化为葡萄糖，因此获取高产纤维素酶菌株是纤维素资源高效开发利用的核心要素^［5］。相较于传统处理技术，微生物降解法具有分解效率高、环境友好等优势，在生物质固体废弃物资源化领域展现出广阔应用前景^［6-7］。

福建省依托独特的亚热带气候条件，鲜食玉米种植面积与产量逐年攀升，一年可收获两季，该产业快速发展的同时产生了大量富含纤维素的秸秆及加工残渣，这类农业废弃物的合理处置与资源化利用已成为玉米产业可持续发展的迫切需求^［8］。针对这一特殊产业背景，筛选获得高效纤维素降解菌株对推动玉米秸秆等农业废弃物的资源化利用具有重要理论与实践意义。据此，本研究以福建省鲜食玉米种植基地土壤为材料，筛选高产纤维素酶菌株；通过形态学观察与分子生物学鉴定明确菌株分类地位，并对其营养条件和培养条件进行优化，旨在为玉米秸秆等农业生产废弃物的高效处理提供优质菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

土壤样品采集自三明玉米种植基地腐殖质层10~15 cm，共采集30份土样，土样装于自封袋中，封口，带回实验室于4 ℃保存。

1.1.2 供试培养基

羧甲基纤维素钠（CMC-Na）筛选培养基：CMC-Na 10 g，KH₂PO₄ 1 g，（NH₄）₂ SO₄ 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，NaCl 0.5 g，酵母粉1 g，琼脂 15 g，蒸馏水1 L。产酶发酵培养基：CMC-Na 10 g，蛋白胨5 g，（NH₄）₂SO₄ 2 g，酵母粉1 g，KH₂PO₄ 2 g，MgSO₄ 0.5 g，CaCl₂ 0.1 g，NaCl 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.05 g，MnSO₄ 0.02 g，蒸馏水1 L。

1.2 菌株的分离与筛选

称量1 g土壤样品，加入100 mL无菌水，用玻璃棒搅匀，沉淀后取上清液，分别用无菌水稀释至10⁴，10⁵和10⁶倍，将稀释液涂布于CMC-Na筛选培养基平板上，以涂布无菌水为对照，每个稀释度设3个重复。28 ℃恒温倒置培养2 d，挑取生长较快的菌株进行三区划线纯化得到单菌落。参考李治玲等^［9］和郭琪等^［10］的方法筛选纤维素降解菌，将纯化好的菌株接种在CMC-Na筛选培养基平板中央，在28 ℃下倒置培养2 d，将CMC-Na筛选培养基平板用1 g/L刚果红染色30 min后，弃去染液，加入1 mol/L NaCl溶液脱色30 min，再用无菌水洗涤2~3次，观察培养基是否产生黄色水解圈，测量水解圈直径和菌落直径，计算水解圈和菌落直径的比值，选择比值最大的菌株ZZ04进行纤维素酶活性测定。

1.3 菌株纤维素酶活性测定

将所筛选的菌株ZZ04活化后接入LB培养基中，28 ℃、180 r/min培养24 h后作为种子液。将种子液以2%（体积分数，下同）的接种量接入50 mL产酶发酵培养基中，在28 ℃、150 r/min条件下发酵培养48 h，取发酵液于4 ℃、8 000 r/min下离心15 min后取上清液即为粗酶液。参考江国忠^［11］、谢洁等^［12］和吴旭东等^［13］的方法测定粗酶液中羧甲基纤维素酶（carboxymethyl cellulase，CMC）和滤纸酶（filter paper activity，FPA）活性。试验重复3次。

1.4 纤维素降解菌的鉴定

将菌株接种至LB固体培养基中，于28 ℃培养24 h，观察菌落的形态、大小、边缘、透明度等特征，对照《常见细菌系统鉴定手册》^［14］，对菌株从形态特征初步进行形态学鉴定。采用OMEGA细菌DNA提取试剂盒提取降解菌菌株的DNA，分别采用16S rDNA基因通用引物（27F/1492R）^［10］、gyrA基因引物（42F/1066R）^［15］和gyrB基因引物（UP1/UP2r）^［16］进行PCR扩增，这3个基因PCR扩增体系均为25 μL：2×Taq PCR StarMix 12.5 μL，引物各1 μL，DNA模板2.0 μL，ddH₂O 8.5 μL。16S rDNA和gyrA基因PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。gyrB的PCR扩增条件与gyrA基本相同，只需要将退火温度改成60 ℃即可。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序，结果经BLAST同源性比对分析后上传登录至NCBI的GenBank数据库中，并从GenBank数据库获得相关菌株的16S rDNA、gyrA和gyrB基因序列，使用Phylosuite对上述3个基因序列进行串联；用Partition Finder 2确定的最佳数据分区，最后在MEGA 6.0上用Neighbor-joining分析法构建系统发育进化树^［17］。

1.5 纤维素降解菌营养条件的优化

1.5.1 最佳碳源

以质量分数2%的蛋白胨为氮源，再分别以质量分数1%的CMC-Na、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖和果糖为碳源，代替原产酶发酵培养基中的碳源。将筛选的菌株ZZ04种子液以2%的接种量，分别接种于40 mL装有不同碳源的产酶发酵培养基中，通气塞封口，置于水浴摇床中，于37 ℃、150 r/min条件下培养36 h后，提取粗酶液，测定粗酶液的CMC和FPA活性，每处理重复3次，确定最佳碳源。

1.5.2 最佳氮源

选用最佳碳源后，再分别以质量分数2%的蛋白胨、酵母粉、（NH₄）₂SO₄、KNO₃、NH₄Cl和NH₄NO₃为氮源。将菌株ZZ04种子液以2%的接种量，分别接种于装有40 mL不同氮源的产酶发酵培养基中，通气塞封口，置于水浴摇床中，于37 ℃、150 r/min条件下培养36 h，提取粗酶液，测定粗酶液的CMC和FPA活性，每处理重复3次，确定最佳氮源。

1.5.3 最佳碳氮比（C∶N）

通过碳源与氮源的筛选试验确定菌株ZZ04产纤维素酶的最适碳氮源种类，但所采用的碳源与氮源配比（1∶2）仍沿用了肉汤保藏培养基的经典参数，未必适用于该菌株的酶活性表达，因此进一步设置C∶N分别为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，2∶1，2∶2，2∶3，2∶4，3∶1，3∶2，3∶3，3∶4，4∶1，4∶2，4∶3和4∶4等16个配比，每处理重复3次，以对两者的用量比例进行优化。在优化过程中，除碳氮比外，其他培养条件与操作步骤均保持与碳源筛选试验一致。

1.6 纤维素降解菌培养条件的优化

确定菌株ZZ04产纤维素酶的最适培养基组成后，再观察接种量、培养基初始pH值、培养温度及培养时间等影响菌株产酶的培养条件，优化最佳发酵工艺。

1.6.1 最佳接种量

将菌株ZZ04种子液按1%，2%，3%，4%，5%，6%和7%的接种量，接种于装有40 mL产酶发酵培养基的三角瓶（250 mL）中，通气塞封口，置于水浴摇床中，于37 ℃、150 r/min条件下培养36 h，测定各接种量条件下粗酶液的CMC和FPA活性，每处理重复3次，确定产酶的最佳接种量。

1.6.2 最佳培养基初始pH值

将菌株ZZ04种子液按3%接种量，接种于pH值分别为4，5，6，7，8和9的40 mL产酶发酵培养基中，封口后，置于37 ℃、150 r/min条件的水浴摇床中培养36 h，测定不同pH条件下粗酶液的CMC与FPA活性，每处理重复3次，确定产酶的最适pH值。

1.6.3 最适培养温度

将菌株ZZ04种子液按3%接种量，接种于pH值为7的40 mL产酶发酵培养基中，通气塞封口后，分别置于25，30，35，40和45 ℃ 水浴摇床中，150 r/min培养36 h，测定粗酶液的CMC与FPA活性，每处理重复3次，确定产酶的最适培养温度。

1.6.4 最佳培养时间

将菌株ZZ04种子液按3%接种量，接种于pH值为7的40 mL产酶发酵培养基中，通气塞封口后，置于45 ℃、150 r/min的水浴摇床中分别培养12，24，36，48，60，72和96 h，测定粗酶液的CMC与FPA活性，每处理重复3次，确定产酶的最适培养时间。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的筛选

通过涂布稀释法，从土壤中分离出13株菌株，经CMC-Na筛选培养基筛选得到具有明显水解圈的菌株共4株，经刚果红染色后发现菌株ZZ04的黄色水解圈较大（图1）；且其水解圈与菌落直径比值最大，CMC和FPA活性均最高（表1），因此选择菌株ZZ04作为进一步试验的菌株。

2.2 纤维素降解菌ZZ04的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

将菌株ZZ04接种至LB固体培养基上，于37 ℃培养24 h后生长良好，菌落呈淡黄色、边缘不规则、表面平滑、干燥（图1）；属革兰氏阳性菌，菌体杆状，长度2.2~9.7 µm，宽度0.2~0.6 µm；具鞭毛，芽孢间生，初步将此菌株归为芽孢杆菌属。

2.2.2 分子学鉴定

对菌株ZZ04的DNA进行16S rDNA、gyrA和gyrB扩增、测序后，分别获得1 516，989，1 160 bp的序列片段，BLAST比对后，菌株ZZ04与GenBank中贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的16S rDNA基因序列（登录号：MK641661）相似度为100%，与gyrA基因（登录号：MZ357346）相似度为99.90%，与gyrB基因（登录号：MT119762）序列相似度到100%。将菌株ZZ04的16S rDNA、gyrA和gyrB的测序结果提交至NCBI的GenBank数据库中，获得登录号分别为OR467309、OR474251和OR474252。将获得的序列与GenBank中同源性较高种的序列构建多基因系统发育树，结果（图2）发现，菌株ZZ04与贝莱斯芽孢杆菌为一支，其遗传距离最近。结合形态学特征和分子生物学，将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

2.3 纤维素降解菌ZZ04营养条件的优化

2.3.1 最佳碳源

图3显示，菌株ZZ04对碳源的利用比较广泛，但在以CMC-Na为碳源的培养液中，其CMC与FPA活性分别为84.74和70.62 U/mL，总体高于其他碳源。因此，确定CMC-Na为培养菌株ZZ04的最佳碳源。

2.3.2 最佳氮源

图4表明，不同氮源处理菌株ZZ04的纤维素酶活性存在明显差异。当添加无机氮源时，菌株ZZ04的CMC和FPA活性都较低。当以蛋白胨、酵母粉为氮源时，菌株ZZ04的CMC和FPA活性都较高，但CMC与FPA活性最高值却并非在同一氮源条件下取得。当以蛋白胨为氮源时，CMC活性最高，为94.25 U/mL，此时PFA活性为71.80 U/mL；当以酵母粉为氮源时，FPA活性最高，为77.71 U/mL，此时CMC活性为73.88 U/mL。为使菌株ZZ04产纤维素酶组分均衡，其最佳氮源确定为蛋白胨与酵母粉的等量混合物。

2.3.3 最佳碳氮比

图5表明，培养基中的碳氮比（C∶N）对菌株ZZ04的纤维素酶活性具有明显影响，在C∶N为2∶4时CMC与FPA活性均较高。基于上述结果，确定菌株ZZ04产纤维素酶的最佳C∶N为2∶4，即碳、氮源用量分别为2%和4%。综合各优化试验结果，最终确定贝莱斯芽孢杆菌ZZ04产纤维素酶的最适产酶发酵培养基组成为：CMC-Na 20 g，蛋白胨20 g，酵母粉20 g，KHPO₄ 2 g，MgSO₄ 0.5 g，CaCl₂ 0.1 g，NaCl 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.05 g，MnSO₄ 0.02 g，蒸馏水1 L。

图5　碳氮比对菌株ZZ04羧甲基纤维素酶（CMC）和滤纸酶（FPA）活性的影响

Fig.5　Effects of carbon-to-nitrogen ratio on CMC and FPA activities of strain ZZ04

2.4 纤维素降解菌ZZ04培养条件的优化

2.4.1 最佳接种量

图6表明，随着接种量的逐步提高，菌株ZZ04的CMC与FPA活性均呈先上升后下降趋势，其中CMC活性在接种量为3%~4%时维持较高水平，并于接种量为4%时达到峰值（158.28 U/mL）；而FPA活性则在接种量为3%~5%时保持较高，且在接种量为3%最高（125.30 U/mL）。基于酶活性最大化原则，综合考虑两种酶活性的变化规律，最终确定3%为最佳接种量。

2.4.2 最适培养基初始pH值

图7表明，当培养基初始pH值为4~9时，菌株ZZ04的粗酶液中均检测到纤维素酶活性。当pH值为4~7时，CMC和FPA活性均呈升高趋势，且当pH值为7时，CMC和FPA活性均达到最高，分别为197.65和160.35 U/mL；当pH值为8~9时，CMC和FPA活性均呈下降趋势。表明菌株ZZ04的纤维素酶活性在中性环境下较高，最适pH值为7。

2.4.3 最适培养温度

培养温度对菌株ZZ04羧甲基纤维素酶（CMC）和滤纸酶（FPA）活性的影响如图8所示。图8表明，培养温度对ZZ04产纤维素酶影响较大。25~45 ℃下，在菌株ZZ04的粗酶液中均检测到CMC和FPA活性。当培养温度在25~35 ℃时，CMC和FPA活性均呈升高趋势，并在35 ℃达到最大，分别为203.42和164.12 U/mL；当温度高于35 ℃时，CMC和FPA活性均有所下降。该结果表明，菌株ZZ04产纤维素酶活性的最适温度为35 ℃。

2.4.4 最适培养时间

培养时间对菌株ZZ04羧甲基纤维素酶（CMC）和滤纸酶（FPA）活性的影响如图9所示。图9表明，当培养时间为12~48 h时，随着培养时间延长，菌株ZZ04的纤维素酶活性均呈上升趋势，并于培养48 h时达到峰值，此时CMC和FPA活性分别为222.14和171.21 U/mL；之后，随着培养时间延长，CMC和FPA活性总体下降。基于酶活性最大化及发酵效率的综合考量，确定菌株ZZ04产纤维素酶的最适培养时间为48 h。

图8　培养温度对菌株ZZ04羧甲基纤维素酶（CMC）和滤纸酶（FPA）活性的影响

Fig.8　Effects of culture temperature on CMC and FPA activities of strain ZZ04

3 讨论与结论

本研究从福建省鲜食玉米种植基地采集的30份土壤样品中，分离筛选获得一株高产纤维素酶菌株ZZ04。为确保鉴定结果的准确性，采用形态学鉴定与分子生物学鉴定相结合的方法对该菌株进行系统鉴定，初筛结果显示，菌株ZZ04可在CMC-Na筛选培养基上正常生长，染色洗脱后可形成明显的黄色水解透明圈，表明其具备分泌纤维素酶及降解纤维素的能力。形态学特征分析表明，菌株ZZ04在LB固体培养基上的菌落呈淡黄色，边缘不规则，表面平滑且干燥；菌体形态为杆状，具鞭毛，芽孢间生，上述表型特征与芽孢杆菌属（Bacillus）细菌的典型特征高度吻合。分子生物学鉴定中，通过扩增菌株ZZ04的16S rDNA、gyrA及gyrB基因并构建系统发育进化树，结果显示，菌株ZZ04与贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）聚于同一分支。综合形态学观察与多基因系统发育分析结果，将菌株ZZ04鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。本研究对菌株ZZ04的纤维素酶活性分析结果显示，其产纤维素酶CMC和FPA活性较高，具有较高应用价值。纤维素酶活性受培养温度、培养基pH值等诸多因素的影响^［18-19］。本研究中，株ZZ04在30~37 ℃、pH值6.0~8.0条件下产纤维素酶活性较高，体现出良好的环境适应性，其产酶温度范围与燕红等^［20］报道的芽孢杆菌产酶温度（30~35 ℃）基本一致，这为后续菌株ZZ04发酵工艺优化提供了重要参考。​

营养条件和培养条件对微生物的生长繁殖、代谢活动具有重要影响，合适的碳源、氮源、接种量、pH值、温度及培养时间，能够为菌株生长发育提供所需的结构物质和能量，并创造适宜的代谢环境和生理条件^［21］。本研究对对菌株ZZ04产纤维素酶的最适培养条件进行了优化，结果表明，最适碳源为CMC-Na，最适氮源为蛋白胨与酵母粉的等量混合物，适宜碳氮比为2∶4，接种量为3%，这与李治玲等^［9］报道的柑橘皮渣降解菌枯草芽孢杆菌B.subtillis L520相近；最适培养时间为48 h，这与吴旭东等^［13］发现的烟用产纤维素酶菌株枯草芽孢杆菌B. subtillis FX-1一致；在中性或偏碱性环境中酶活性较高，最适培养基初始pH值为7，这与佀胜利等^［22］报道的纤维素降解菌枯草芽孢杆菌B. subtillis DT13，及钟斌等^［23］报道的纤维素降解菌产碱杆菌Alcaligenes faecalis F3的最适培养基初始pH值相符；最适培养温度35 ℃，这与陈诗瑶等^［24］的研究结果一致。

综上，本研究虽明确了菌株ZZ04的基本特性，但仍存在进一步完善的空间。首先，本研究仅在实验室摇瓶培养条件下进行单因素试验确定了其最佳产酶条件，未涉及发酵罐规模化培养，未采用正交试验对通气量、搅拌速度等参数进行优化；其次，对菌株ZZ04产纤维素酶的纯化及酶学特性研究不足，限制了菌株ZZ04在极端环境下的应用拓展，需通过蛋白纯化技术明确酶的核心功能结构；最后，关于菌株ZZ04降解纤维素的分子机制尚未阐明，需通过基因组测序、转录组分析等技术挖掘关键产酶基因，为菌株的基因工程改造提供靶点，从而实现纤维素酶活性的明显提升。

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基金资助

福建省属公益类科研院所专项(2023R1022004)

福建省属公益类科研院所专项(2023R1071)

福建省农业高质量发展超越“5511”协同创新工程项目(XTCXGC2021011)

福建省农业高质量发展超越“5511”协同创新工程项目(XTCXGC2021017)