黄瓜转录因子CsWIP1互作蛋白的筛选与鉴定

Screening and identification of proteins interacting with the CsWIP1 transcription factor in cucumber

摘要

目的 筛选黄瓜隐性全雌控制基因g（CsWIP1）编码蛋白的互作蛋白，为进一步阐明其影响黄瓜性别决定的分子机制奠定基础。 方法 基于本实验室已构建的黄瓜顶芽酵母双杂交cDNA文库，使用同源重组法构建CsWIP1-pGBKT7诱饵表达载体，检测其自激活活性后，将CsWIP1-pGBKT7与黄瓜cDNA文库进行酵母双杂交筛选；对获得的阳性克隆进行检测及BLAST分析，筛选CsWIP1蛋白的互作蛋白；对筛选到的互作蛋白CsIDD-3的氨基酸序列进行分析，并构建系统进化树。对CsWIP1与CsIDD-3的互作关系进行酵母双杂交（Y2H）点对点回转验证、双分子荧光互补（BiFC）验证和荧光素酶互补成像（LCI）验证。 结果 诱饵表达载体CsWIP1-pGBKT7构建成功，该载体无自激活活性；筛选到的互作蛋白包括热激蛋白类、组蛋白类、蛋白激酶类和转录因子类等，选取CsIDD-3进行后续试验；CsIDD-3基因的CDS序列编码363个氨基酸，具有2个C2H2型锌指蛋白结构域，IDD-3基因在其他物种中的氨基酸序列相对保守，黄瓜IDD-3基因与甜瓜的亲缘关系最近。互作验证试验表明，CsWIP1与CsIDD-3存在互作关系。 结论 推测CsWIP1与CsIDD-3蛋白互作参与黄瓜的性型分化通路，CsIDD-3基因可能具有调控雌雄花比例的功能。

Abstract

Objective This study aims to screen proteins interacting with the product of recessive all-female control gene g （CsWIP1） in cucumber，thereby laying a foundation for further elucidating the molecular mechanism underlying cucumber sex determination. Method Based on the cucumber terminal bud yeast two-hybrid （Y2H） cDNA library constructed in this laboratory，the CsWIP1-pGBKT7 bait vector was constructed by homologous recombination.After detecting autoactivation，CsWIP1-pGBKT7 and cucumber cDNA library were screened using Y2H approach.Positive clones were detected and analyzed by BLAST to identify proteins interacting with CsWIP1.The amino acid sequence of the interacting protein CsIDD-3 was characterized，fo-llowed by phylogenetic tree construction.The interaction between CsWIP1 and CsIDD-3 was verified by Y2H point-to-point assay，bimolecular fluorescence complementation （BiFC） and luciferase complementation ima-ging （LCI）. Result The bait vector CsWIP1-pGBKT7 was successfully constructed and showed no autoactivation.The identified interacting proteins included heat shock proteins，histones，protein kinases and transcription factors.Among them，CsIDD-3，which was also a transcription factor，was selected for subsequent experiments.The CDS sequence of CsIDD-3 encodes 363 amino acids and contains two C2H2-type zinc finger domains.The IDD-3 amino acid sequence is relatively conserved across other species，with the cucumber IDD-3 showing the closest phylogenetic relationship to that of melon.Interaction assays confirmed that CsWIP1 interacts with CsIDD-3. Conclusion These findings suggest that the protein interaction between CsWIP1 and CsIDD-3 participates in cucumber sexual differentiation，and the CsIDD-3 gene may function in regulating the female-to-male flower ratio.

Graphical abstract

关键词

黄瓜 / 性型分化 / CsWIP1转录因子 / 互作蛋白

Key words

cucumber / sexual differentiation / CsWIP1 transcription factor / interacting protein

黄瓜（Cucumis sativus L.）为葫芦科黄瓜属一年生攀援草本植物，果实质地脆嫩、营养丰富，可鲜食、熟食、腌制，市场需求量大，经济效益高^［1］。近年来设施栽培已成为我国黄瓜生产的主要方式，培育高产、优质的黄瓜品种对产业发展至关重要^［2］。黄瓜具有单性结实的能力，即无需授粉可自然形成果实，所以雌花数量是产量的基础。在杂交制种过程中，用强雌系黄瓜作为母本，方便在早期去掉为数不多的雄花，降低人工成本，增加杂交种纯度。因此，提高黄瓜的雌性率，不仅可以增加种植户的经济效益，助力菜农增收，还可以使黄瓜的杂交育种过程轻简化，减少用工成本。

性型分化（性别决定）作为花发育的一个重要阶段，其调控机制影响雌雄花的比例，与瓜类作物的生物学产量密切相关，是植物发育生物学和农业生产应用的重要内容^［3-4］。黄瓜由于其花性型分化多样，具有被子植物中全部的性别类型，并且各性别类型之间受多种因素的影响容易转变，已成为研究双子叶植物性型分化机制的模式作物^［5-8］。黄瓜为雌雄异花作物，自然条件下可分化出雄花和雌花，部分特异种质还可形成两性花。依据3种花在单株上的分布特征，黄瓜株型可分为：雌雄异花同株，植株下部多为雄花，上部雌雄花交替着生；全雄株，全株各节位仅着生雄花；全雌株，全株各节位仅着生雌花；强雌株，植株基部少数节位着生雄花，上部各节均为雌花；雄全同株，植株下部着生雄花，上部雄花与两性花交替出现；完全花株，全株各节位均着生两性花^［7，9］。黄瓜隐性全雌控制基因g（CsWIP1）、F（CsACS1G）、M（CsACS2）、A（CsACS11）和CsACO2作为性型分化的主效基因已被相继克隆和研究。其中CsWIP1是唯一的转录因子，其余均是乙烯合成途径中的关键酶^［10-14］。乙烯具有调节性别转化，诱导雌花形成的作用，生产上用乙烯利处理可以使黄瓜在更早的节位着生雌花，增加雌花数量^［15-19］。CsWIP1基因是性别决定的保守因子，可抑制雌蕊发育，其突变会导致全雌株^［20］。

目前已明确的黄瓜雌性分化调控途径主要有两种，一种是以显性F基因为核心的乙烯依赖途径，其作用机制已较为清晰：F基因在花芽发育早期表达，与CsACO2协同作用促进乙烯合成，通过抑制CsWIP1并激活CsACS2基因的表达，最终促进雌花发育，且该途径可绕过CsACS11，为雌花发育建立独立的显性调控通路^{［12，21］}；另一种是以CsWIP1转录因子为核心的隐性调控途径，尽管已有研究证实CsWIP1具有诱导雄蕊发育和抑制雌蕊发育的关键功能，且其正常表达会间接抑制CsACS2基因的表达，导致乙烯释放量减少^［20］，但该途径的具体作用机制仍不完全清楚，如CsWIP1直接抑制雌蕊发育的机制及其与乙烯代谢通路的分子互作关系尚不明确，这也成为制约黄瓜性别决定机制研究深入推进的关键因素。为此，本研究基于已构建的黄瓜顶芽cDNA酵母文库，以CsWIP1为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术筛选并分析其潜在的互作蛋白，同时利用其他互作系统进行验证，以期为CsWIP1抑制雌蕊发育的分子机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄瓜顶芽cDNA酵母文库，酵母双杂交（Y2H）相关载体pGBKT7、pGADT7及其阳性对照载体LARGET-pGADT7和p53-pGBKT7，双分子荧光互补（BiFC）相关载体pSPYNE（NE）和pSPYCE（CE），荧光素酶互补成像（LCI）相关载体pCAMBIA1300-nLUC（nLUC）和pCAMBIA1300-cLUC（cLUC），均由宁夏大学葡萄酒与园艺学院瓜菜分子育种实验室保存；酵母菌株Y2H Gold、大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株GV3101，均购于上海唯地生物技术有限公司。

用于BiFC、LCI蛋白互作试验的本氏烟草（Nicotiana benthamiana），在宁夏大学葡萄酒与园艺学院分子遗传育种实验室种植。种植时将基质（泥炭藓、蛭石和珍珠岩的混合物，其体积比为2∶1∶1）装入穴盘，轻轻压实，浇透水。烟草种子在基质中撒播后放置于人工气候培养箱中，2周后将长出的幼苗移植到营养钵中，以确保根系有足够的生长空间。培养箱的温度保持在22~25 °C，提供充足的光照（16 h光照/8 h黑暗），光照强度为100~150 µmol/（m²·s）。待植株生长4~6周，叶片完全展开后可用于农杆菌的侵染试验。

1.2 诱饵表达载体CsWIP1-pGBKT7的构建

取黄瓜406、406a、GY14、9930品种的顶芽组织混合，加液氮研磨后，采用Trizol法提取总RNA，利用反转录试剂盒（全氏金，中国）反转录得到cDNA，备用。从葫芦科植物基因组数据库（http：//cucurbitgenomics.org/）下载CsWIP1的基因序列（登录号：Csa4M290830），利用 Primer Premier 5.0软件设计特异性引物CsWIP1-F1和CsWIP1-R1（引物序列见表1），引物由生工生物工程（西安）股份有限公司合成。

采用同源重组的方法，使用TaKaRa公司的 Prime STAR Max高保真酶对CsWIP1片段进行扩增。PCR反应体系总体积为50 μL，其中包括ddH₂O 21 μL，Prime STAR Max 25 μL，cDNA 2 μL，引物CsWIP1-F1和CsWIP1-R1各1 μL。PCR反应程序为：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共38个循环；72 ℃ 终延伸5 min；4 ℃恒温保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳（电压150 V，电泳30 min）检测后，使用北京天根TIANGEN公司通用型DNA纯化回收试剂盒回收目标片段，具体操作见试剂盒说明书。使用诺维赞同源重组试剂盒（ClonExpress^®Ⅱ One Step Cloning Kit）将CsWIP1基因与经EcoR I和Sal I酶切线性化的pGBKT7载体进行连接（连接体系于50 ℃金属浴上反应30 min），构建CsWIP1-pGBKT7诱饵表达载体。将CsWIP1-pGBKT7载体转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，样品混匀后置于冰上孵育30 min，42 ℃热激90 s，冰上再孵育2~3 min，随即加入900 µL无抗性的LB液体培养基，置于37 ℃培养箱摇菌45 min。将转化产物涂布至含有50 mg/L卡那霉素（Kan）抗性的LB固体平板，培养12~14 h后，对长出的单克隆菌落进行PCR阳性鉴定。提取PCR鉴定为阳性的单克隆菌落抽提质粒，送至生工生物工程（西安）股份有限公司进行鉴定。

1.3 诱饵表达载体CsWIP1-pGBKT7的自激活活性检测

为避免筛库出现假阳性结果，需要对诱饵表达载体进行自激活活性检测，试验设置CsWIP1-pGBKT7+pGADT7为自激活检测组，并设置LARGET-pGADT7+p53-pGBKT7为阳性对照组。将Carrier DNA置于金属浴100 ℃ 5 min，随即快速冰浴，混合Carrier DNA、pGADT7空载质粒、CsWIP1-pGBKT7诱饵载体质粒、Y2H GoLd酵母感受态和1×TE/LiAc/PEG，将样品30 ℃水浴30 min；42 ℃水浴15 min，5 000 r/min高速离心2 min，去上清后涂布至SD/-Leu/-Trp二缺培养基（DDO），28 ℃下培养4~5 d。将生长状况良好的单克隆菌落转接至SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade/X-α-gal四缺显色培养基（QDO/X）上，监测酵母生长状态，判定CsWIP1-pGBKT7是否有自激活活性。

1.4 CsWIP1互作蛋白的筛选与分析

1.4.1 CsWIP1-pGBKT7诱饵载体与黄瓜cDNA文库的酵母双杂交筛选

参考文献［22］，采用PEG/LiAc法将CsWIP1-pGBKT7诱饵表达载体（5 μg）与cDNA酵母文库质粒（10 μg）对酵母Y2H感受态细胞进行共转化。将转化产物涂布在SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade四缺培养基（QDO）上，30 ℃下培养5 d，待酵母菌落生长到合适大小（菌落直径1.5~2 mm），挑取生长状况良好的单克隆接种到QDO/X培养基上进行复筛，30 ℃下培养4~7 d。

1.4.2 阳性克隆检测及BLAST分析

将1.4.1节得到的阳性克隆（蓝色）菌落接种于2 mL液体DDO培养基中，30 ℃下振荡培养2 d，采用酵母质粒小提试剂盒提取阳性克隆酵母质粒。将抽提得到的酵母质粒通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50 mg/L氨苄霉素（Amp）的LB固体平板上，37 ℃下培养12~14 h，使用pGADT7载体通用引物pGADT7-F和pGADT7-R（序列见表1）对生长状态良好的单克隆菌落进行PCR鉴定，扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，目标条带送生工生物工程（西安）股份有限公司测序。将测序所获序列通过葫芦科植物基因组数据库（http：//cucurbitgenomics.org/）、拟南芥基因组数据库（https：//www.arabidopsis.org/）等工具网站进行比对，初步筛选CsWIP1互作蛋白，预测其结构和功能。

1.4.3 互作蛋白CsIDD-3的生物信息学分析

从NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取黄瓜和其他物种的IDD-3氨基酸序列，利用ExPasy软件（https：//web.expasy.org/protparam/）预测分析CsIDD-3蛋白的相对分子质量、理论等电点等基本理化性质，采用DNAMAN软件对上述氨基酸序列进行同源性比对分析，用MEGA5软件进行系统发育分析，具体方法参见文献［23］。

1.5 CsWIP1与CsIDD-3的互作验证

1.5.1 酵母双杂交（Y2H）点对点回转验证

使用软件Primer Premier 5.0设计CsIDD-3基因的pGADT7重组引物CsIDD-3-F1和CsIDD-3-R1（序列见表1）。用CsIDD-3-F1和CsIDD-3-R1克隆黄瓜CsIDD-3基因的CDS序列（反应体系和程序同1.2节），将其与pGADT7载体连接，构建CsIDD-3-pGADT7载体，并进行自激活活性和互作验证。将CsIDD-3-pGADT7分别和pGBKT7、CsWIP1-pGBKT7质粒在Y2H GoLd酵母感受态中进行共转化，方法同1.3节。同时设置阳性对照组合（LARGET-pGADT7+p53-pGBKT7）和阴性对照组合（CsWIP1-pGBKT7+pGADT7）。再将转化产物接种于DDO培养基上培养，将DDO培养基上长出的酵母菌落转接至QDO/X培养基进行培养，验证自激活活性和互作结果。

1.5.2 双分子荧光互补（BiFC）互作验证

用CsIDD-3-F2/CsIDD-3-R2和CsWIP1-F2/CsWIP1-R2引物（序列见表1）分别克隆CsIDD-3和CsWIP1基因的CDS序列（反应体系和程序同1.2节），分别连接到N端带有黄色荧光蛋白（YFP）标签的载体NE和C端带有YFP的载体CE，构建CsIDD-3-NE和CsWIP1-CE载体，送生工生物工程（西安）股份有限公司测序。将测序正确的CsIDD-3-NE和CsWIP1-CE载体共转化GV3101农杆菌感受态细胞，以CsIDD-3-NE+CE和CsWIP1-CE+NE转化的农杆菌为对照组。使用烟草Buffer重悬液对农杆菌菌液进行重悬，调整菌液在600 nm处吸光度（OD₆₀₀）为0.4。将上述菌液注射本氏烟草叶片的背部，黑暗环境下培养24 h后移至光照培养箱正常培养2 d后，在激光共聚焦荧光显微镜（Olympus BX63）下观察结果。

1.5.3 荧光素酶互补成像（LCI）互作验证

用CsWIP1-F3/CsWIP1-R3、CsIDD-3-F3/CsIDD-3-R3引物（序列见表1）分别克隆CsWIP1和CsIDD-3基因的CDS序列（反应体系和程序同1.2节），分别与nLUC和cLUC载体连接，构建CsWIP1-nLUC和CsIDD-3-cLUC载体，送生工生物工程（西安）股份有限公司测序。将测序正确的CsWIP1-nLUC和CsIDD-3-cLUC质粒共转化农杆菌菌株GV3101，试验设nLUC+cLUC、CsWIP1-nLUC+cLUC、CsIDD-3-cLUC+nLUC质粒共转化农杆菌菌株GV3101为对照组，将各组菌液分别注射本氏烟草同一片叶子的不同区域，3 d后叶片涂上荧光素钾盐溶液（碧云天生物，中国）在植物活体拍照成像系统（CCD）（Lumazone Pylon 2048B，美国）中检测荧光信号的表达。

2 结果与分析

2.1 诱饵表达载体CsWIP1-pGBKT7的鉴定

CsWIP1-pGBKT7诱饵表达载体的PCR鉴定结果显示，扩增得到了CsWIP1基因片段，长度约为1 062 bp，条带单一且明亮（图1），与预期目的片段大小一致。对CsWIP1-pGBKT7诱饵表达载体进行测序，将测序结果与CsWIP1基因CDS区进行序列比对分析，结果显示插入片段的碱基序列与目标基因序列完全匹配。PCR和测序鉴定结果表明，诱饵表达载体CsWIP1-pGBKT7构建成功。

2.2 CsWIP1-pGBKT7诱饵表达载体的自激活活性检测

在筛选CsWIP1互作蛋白之前，首先对诱饵表达载体CsWIP1-pGBKT7进行自激活活性检测。试验结果表明，CsWIP1-pGBKT7+pGADT7组酵母菌在筛选培养基上无法正常生长，而阳性对照LARGET-pGADT7+p53-pGBKT7组酵母菌能正常生长，且菌落变成蓝色（图2）。结果表明，诱饵表达载体无自激活活性，可用于文库的筛选。

2.3 CsWIP1互作蛋白的筛选

将CsWIP1-pGBKT7诱饵表达载体与cDNA酵母文库质粒共转化酵母Y2H感受态细胞后，在QDO培养基上进行筛选，一周后单克隆陆续长出（图3-A）。将长出的单克隆菌落接种在QDO/X培养基上，经过筛选后获得蓝色的阳性酵母菌落（图3-B）。蓝色酵母菌落活化提取质粒后，应用pGADT7载体通用引物进行PCR检测，结果（图3-C）显示，大部分菌落获得了单一且明亮清晰的特异性条带，但片段长度大小不一。选取具有单一条带的样品进行测序，并将测序结果在拟南芥和葫芦科植物基因组数据库进行比对，初步预测CsWIP1互作蛋白，结果见表2。

由表2可知，筛选的CsWIP1互作蛋白包括热激蛋白类、组蛋白类、蛋白激酶类、转录因子类、微管蛋白类、合成酶类、转运相关蛋白类、光系统蛋白类、核糖体蛋白类、水解酶类、代谢酶类和其他蛋白类，蛋白的功能以及分类涉及较广。后文选取互作蛋白中具有核定位功能的转录因子CsIDD-3（Csa4G646130）进行互作验证。CsIDD-3在拟南芥中的同源基因是具有C2H2型锌指结构域的核定位转录因子，但其功能尚未被深入研究，其他物种中亦无IDD-3的相关报道，表明IDD-3基因在植物中的调控功能尚未被全面揭示。C2H2型锌指蛋白广泛参与植物的生长发育，据此推测CsIDD-3与CsWIP1互作可能共同调控黄瓜的性型分化通路。

2.4 CsWIP1互作蛋白CsIDD-3的生物信息学分析

对转录因子CsIDD-3（Csa4G646130）的序列进行分析，结果表明CsIDD-3基因的CDS全长为1 092 bp，编码363个氨基酸，预测其相对分子质量为40 933.15 ku，理论等电点为8.88，亲水性总平均值为-0.714，包含2个C2H2型锌指蛋白结构域。将CsIDD-3蛋白序列与其他物种IDD-3进行相似性比对，结果发现甜瓜（Cucumis melo）、西瓜（Citrullus lanatus）、冬瓜（Benincasa hispida）、番木瓜（Carica papaya）、番茄（Solanum lycopersicum）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）等物种的IDD-3蛋白同样含有2个C2H2型锌指蛋白结构域（图4），表明IDD-3基因的功能相对保守。

进一步分析CsIDD-3与其他物种IDD-3的进化关系，结果表明CsIDD-3与甜瓜CmIDD-3、西瓜ClIDD-3、冬瓜BhIDD-3聚为同一分支，其中与甜瓜的亲缘关系最近（图5）。

2.5 CsWIP1与CsIDD-3互作的Y2H验证

对CsIDD-3-pGADT7载体同样进行自激活验证，结果显示CsIDD-3-pGADT7+pGBKT7共转化酵母菌落在QDO/X培养基上无法生长（图6），表明CsIDD-3-pGADT7无自激活活性，可用于与CsWIP1互作的验证。阴性对照组合CsWIP1-pGBKT7+pGADT7共转化酵母在QDO/X培养基上也无法生长。CsWIP1-pGBKT7+CsIDD-3-pGADT7载体质粒共转化酵母菌落在QDO/X培养基上能正常生长并且变成蓝色，与阳性对照组合LARGET-pGADT7+p53-pGBKT7共转化酵母的生长状态一致（图6）。结果表明，CsWIP1与CsIDD-3在Y2H系统中存在互作关系。

2.6 CsWIP1与CsIDD-3互作的BiFC验证

为了验证CsWIP1与CsIDD-3蛋白在植物体内是否存在互作关系，在本氏烟草中进行了BiFC试验。结果显示，CsWIP1-CE+CsIDD-3-NE组合烟草检测到绿色荧光信号（BiFC载体携带黄色荧光蛋白YFP，但显微镜通常采用灵敏度更高的绿色荧光蛋白GFP检测通道，以有效捕获YFP信号，YFP在GFP通道检测时呈绿色），并且定位在细胞核中；而对照CsWIP1-CE+NE和CsIDD-3-NE+CE的组合均未检测到荧光信号（图7）。

2.7 CsWIP1与CsIDD-3互作的LCI验证

CsWIP1与CsIDD-3互作的LCI验证试验结果（图8）显示，nLUC+cLUC、CsWIP1-nLUC+cLUC和CsIDD-3-cLUC+nLUC对照处理均未检测到荧光信号，而CsWIP1-nLUC+CsIDD-3-cLUC共转化农杆菌注射烟草可检测到荧光信号，表明该处理可恢复荧光素酶的活性，这与Y2H和BiFC的试验结果一致。3个互作系统的验证结果表明，CsWIP1和CsIDD-3在蛋白水平上存在互作，在功能上可能有相似之处。

3 讨 论

性别决定与分化是葫芦科作物发育生物学研究的核心科学问题，其分子调控机制直接影响植株性型构成与生产应用价值^［24］。WIP1基因作为瓜类作物中保守的性别决定关键因子，在甜瓜、西瓜和黄瓜的雌雄花分化过程中均发挥着核心调控作用。在甜瓜中，CmWIP1基因启动子区域因转座子插入引发的甲基化修饰会抑制其表达，进而促使雄花向雌花转变^［25］；在西瓜中，ClWIP1基因的缺失突变同样可产生全雌株系^［26］；而在黄瓜中，利用CRISPR/Cas9技术敲除CsWIP1也能获得连续着生雌花的突变表型^［20］。CsWIP1对黄瓜雌性分化的调控作用主要通过参与乙烯与生长素信号通路实现，其既可响应内源激素信号变化，又能调控相关功能基因的表达^［27-29］。结合黄瓜、甜瓜、西瓜等物种的相关报道，可证实WIP1是调控瓜类作物性别表型的关键保守基因。目前，已有研究进一步表明，WIP1通常通过蛋白互作发挥功能，如甜瓜中CmWIP1与CmTPL形成复合物，通过组蛋白去乙酰化抑制心皮发育基因CmCRC的表达^［30］，说明WIP1的调控功能依赖于复杂的蛋白互作网络。为解析黄瓜CsWIP1在性别决定通路中的分子调控机制，明确其蛋白水平的互作调控模式，本研究以CsWIP1为诱饵蛋白，利用酵母双杂交系统从黄瓜顶芽cDNA文库中筛选互作因子，经阳性克隆PCR鉴定、测序比对及功能分类，获得了热激蛋白、组蛋白、蛋白激酶及转录因子等多类候选互作蛋白。基于结构特征，本研究选取具有C2H2型锌指结构域的转录因子CsIDD-3开展深入验证。生物信息学分析显示，CsIDD-3在葫芦科作物中序列高度保守，与甜瓜同源蛋白亲缘关系最近，且具备典型的转录因子结构特征，提示其可能参与植物生长发育的转录调控过程。本研通过Y2H、BiFC及LCI三重验证体系证实，CsWIP1与CsIDD-3在酵母体内和植物细胞中均存在稳定且特异性的相互作用。

结合黄瓜性别决定调控通路推测，CsIDD-3可能作为共调控因子与CsWIP1结合形成转录调控复合物，参与下游性别分化相关基因的表达调控，进而影响雌雄花发育进程。本研究结果不仅丰富了CsWIP1介导的黄瓜性别决定调控网络，也为IDD家族转录因子参与植物花器官发育提供了新的试验证据，为深入解析黄瓜隐性全雌调控途径的分子机制奠定了基础。本研究也存在一定局限性：其一，由于黄瓜遗传转化体系效率较低，本研究仅完成了CsWIP1与CsIDD-3蛋白的互作验证，尚未在植株水平开展CsIDD-3基因的功能鉴定；其二，CsWIP1与CsIDD-3的互作结构域、协同调控下游靶基因的具体分子机制，以及与乙烯合成通路的关联均有待进一步解析。在后续的研究中，可通过优化黄瓜转基因体系，利用基因编辑技术敲除CsIDD-3，分析其对雌性率及花器官发育的影响；结合RT-qPCR、原位杂交等技术明确CsIDD-3与CsWIP1的时空表达模式；通过ChIP-seq测序等手段解析下游调控靶点，系统阐明CsIDD-3与CsWIP1协同调控黄瓜性别决定的分子机制，为黄瓜全雌系种质的分子育种提供理论依据与基因资源。

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基金资助

宁夏自然科学基金项目(2024AAC03122)

中央引导地方专项(2024FRD05010)

宁夏回族自治区科技创新团队项目(2024CX-TD010)