牡丹花瓣发育中细胞增殖与扩张转换机制的多组学分析

Multi‐omics analysis the transition mechanism between cell proliferation and expansion during petal development in tree peony

摘要

目的 阐明牡丹花瓣发育过程中细胞增殖与细胞扩张转换的细胞学进程与分子调控网络，为牡丹花瓣发育障碍的消除调控提供理论依据。 方法 以牡丹‘户川寒’为材料，采集春季开花过程中8个花瓣发育关键时期样品，结合形态学观测、转录组测序、代谢组检测及多组学联合分析，解析牡丹花瓣发育调控网络。 结果 ①牡丹花瓣发育可分为细胞增殖期、转换期和扩张期3个阶段。花瓣面积达到最终大小约10%时，可能是花瓣细胞增殖向细胞扩张转换的关键节点；细胞数量增长主导增殖期，而细胞伸长是扩张期的主要驱动力。②生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸含量在不同花瓣发育阶段呈现动态变化，可能参与发育时序调控。③筛选到PsCKX3、PsGAI、PsARF2、PsEXPA11等12个在花瓣发育时序上呈现特异性表达模式、具有作为发育阶段标志基因潜力的核心候选基因，初步构建了以激素信号转导为核心、整合细胞周期调控与细胞扩张相关基因的层级调控网络框架。 结论 牡丹花瓣形态发育依赖细胞增殖和扩张，花瓣面积达到约终态面积10%时为转换关键节点。植物激素通过调控细胞周期与扩张相关基因的表达，协同介导花瓣发育进程的时序转换。

Abstract

Objective This study aims to clarify the cytological processes and molecular regulatory network underlying the transition from cell proliferation to cell expansion during the petal development of tree peony（Paeonia×suffruticosa），and to provide a theoretical basis for the regulation of petal developmental disorders. Method Using tree peony ‘Yusenkan’ as the material，samples were collected at eight key stages of petal development during spring flowering.Through the integration of morphological observation，transcriptome sequencing，metabolome profiling， and multi-omics analysis，we aimed to elucidate the underlying regulatory network. Result ① Petal development of tree pony could be divided into three phases：the cell proliferation phase，the transition phase，and the cell expansion phase.The stage at which the tree peony petal area reached approximately 10% of its final size might be the key node for the proliferation-to-expansion transition.Increase in cell number dominated the proliferation phase，whereas cell elongation was the main driver of the expansion phase.②The content levels of auxin，cytokinin，gibberellin，and abscisic acid exhibited dynamic changes across different stages，and may be involved in the sequential regulation of development.③ Twelve core candidate genes，inclu-ding PsCKX3，PsGAI，PsARF2，and PsEXPA11，were identified，which exhibited stage-specific expression pa-tterns during petal development and had the potential to serve as marker genes for developmental phases.A preliminary hierarchical regulatory network framework was established，which centered on hormone signal transduction and integrated genes involved in cell cycle regulation and cell expansion. Conclusion The morphogenesis of tree peony petals relies on both cell proliferation and cell expansion，with the petal area reaching about 10% of the final size，serving as a critical transition node between these two processes.Phytohormones coordinately mediate the temporal transition of petal development by regulating the expression of genes related to the cell cycle and cell expansion.

Graphical abstract

关键词

牡丹 / 花瓣发育 / 细胞增殖 / 细胞扩张 / 植物激素 / 转录组 / RT-qPCR

Key words

Paeonia×suffruticosa / petal development / cell proliferation / cell expansion / phytohormone / transcriptome / RT-qPCR

牡丹（Paeonia Sect.Moutan）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属牡丹组植物的统称，原产中国。花朵是牡丹观赏价值的核心，尤其是花瓣形态直接决定了其“花大色艳”的特性。牡丹花瓣的形态建成是一个快速而集中的过程，在冬季休眠前花芽已完成形态分化^［1］。观察发现，在春季，牡丹自花芽萌动（芽体直径<2 cm）至开花（单瓣品种花径可达15~20 cm）仅需约40 d，期间花瓣表型发生显著变化。目前关于牡丹花朵形态的研究集中于品种分类^［2］和花器官变异引起的花型成因^［3-7］等方面，而对花瓣本身的发育机制探索相对匮乏。然而，在牡丹专类园建设、秋季二次开花牡丹（秋发）和冬季催花等实际应用中，花瓣发育不良（如花瓣变小、生长终止）导致观赏价值严重降低的情况时有发生，其内在的生物学机制尚不明确，亟待深入解析。

花瓣发育通常经历启动、身份决定、形态发育和成熟4个关键过程，其中的形态发育是指由原基发育成完整花器官的过程^［8］。研究表明，花瓣形态发育过程受到多种植物激素（如生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸等）和其信号转导相关因子^［9-15］以及miR159、miR396、miR319等多个microRNA的协同调控^［16-18］。不同激素间存在互作，TCP（teosinte branched1/cycloidea/proliferating cell factor）、ZFP（zinc finger proteins）等转录因子在整合不同激素信号中发挥重要作用^{［13，19-20］}。与叶片一样，花瓣也属于侧生器官，其形态建成依赖于细胞增殖与扩张的时序协调：增殖阶段的细胞分裂速率与持续时间共同决定细胞数量，而扩张阶段的细胞伸长速率与持续时间则主导细胞最终形态与大小，其中任何一个环节的异常均可能引起花瓣最终尺寸变异，且不同物种中主导该过程的细胞学机制存在差异^［21］。

为此，本研究以单瓣型寒牡丹品种‘户川寒’（P.×suffruticosa ‘Yusenkan’）为材料，系统整合了形态学观测、转录组与靶向激素代谢组分析，旨在明确花瓣发育的细胞学动态规律，阐释关键激素的互作网络，并筛选调控花瓣形态建成的核心候选基因，以期为牡丹花期调控及分子育种实践提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 植物材料与采样时期

以春、秋二次开花的单瓣型牡丹品种‘户川寒’^［22］为试验材料。材料种植于洛阳国际牡丹园，株龄12年以上，长势良好。于2023年3月上旬花蕾可见时开始采样，至4月中旬群体花期结束。根据最外层花瓣的形态变化，将花朵发育过程划分为10个连续时期（S1-S10）。由于S6至S10在采样群体中同时存在，且花朵在此时发育迅速、间隔时间短，推测S6至S10均处于花瓣扩张期；为避免数据冗余，本研究从中选取S6、S8与S10共3个代表性时期进行采样及后续试验。具体采样时间及其对应发育时期见表1，试验期间气温变化情况见图1。

1.2 表型观察及测量

在群体中选择生长旺盛，具代表性的3~5个花芽进行标记，定期拍照并用游标卡尺测量花蕾横径和纵径，以记录花蕾发育动态。于每次田间观察的当天上午，选取有发育代表性的花蕾采样。花蕾离体后快速剖离花瓣，并依据试验目的分别处理：用于生理和分子分析的花瓣样品，以锡箔纸包裹、标记、液氮速冻后置于干冰中转运至实验室，并保存于-80 ℃超低温冰箱；用于扫描电镜观察的样品，取自花瓣中脉附近约0.25 cm²的方形组织片，置于戊二醛固定液中固定，运回实验室后存于4 ℃冰箱；同时，每时期随机选取3枚最外侧花瓣进行拍照，用于后续花瓣面积的精确测量。

按扫描电镜标准制样方法处理花瓣样品后，在S-4700型扫描电镜（日立，日本东京）下观察并拍照。用Image J软件对所得照片多个视野中具有代表性的6个细胞进行细胞长、宽及面积测量。所有花蕾、花瓣及花瓣表皮细胞的测量数据均在Excel 2023和SPSS 27中进行整理与分析。计算内容包括花蕾、花瓣、表皮细胞直径（长）和高度（宽）的平均值、标准差、显著性差异、增长速率和花蕾高宽比及其增长率。同时，通过花瓣总面积除以表皮细胞平均面积，估算平均单个花瓣所含细胞数量。

1.3 植物激素靶向代谢组测试及数据分析

基于AB Sciex QTRAP 6500 LC-MS/MS平台使用MetWare（http：//www.metware.cn/）对8个采样时期的花瓣样品进行9大类、109种内源激素的靶向绝对定量检测，所测激素包括生长素、细胞分裂素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸、赤霉素、乙烯类、独脚金内酯及褪黑素。每个时期样品包括3个生物学重复。以差异倍数（fold change，FC）≥2.0或者FC≤0.5，结合OPLS-DA模型中变量重要性投影（variable importance projection，VIP）≥1.0筛选差异代谢物。

1.4 转录组测序与分析

表型观测表明，花瓣发育经历细胞增殖与细胞扩张2个主要细胞过程，其间存在转换阶段。因此该研究利用S2和S6的样本分别代表增殖期和扩张期进行转录组测序分析。每个时期包括3个生物学重复。试验材料送至测序公司（MetWare，http：//www.metware.cn/）后提取总RNA，使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Nanodrop 2000C分光光度计（Thermo scientific，USA）检测RNA纯度和浓度，结果符合cDNA文库构建要求，完成cDNA文库构建。利用Illumina HiSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序。

原始数据经过滤、测序错误率检查、GC含量分布检查，获得后续分析使用的高质量序列（clean reads）。将质控后的高质量序列（clean reads）比对到参考基因组^［23］上。参照NCBI NR（NCBI non-redundant protein sequences）、KEGG、Swiss-Prot、KOG、Trembl、GO、Pfam数据库进行基因功能的注释。结合RESM和bowtie 2进行比对，利用FPKM值表示基因的表达量。使用DESeq2^［24］进行样品组间的差异表达分析，采用Benjamini-Hochberg 方法对假设检验概率（P value）进行多重假设检验校正，得到错误发现率（false discovery rate，FDR）。差异表达基因的筛选条件为 |log₂（FC）|≥1且FDR<0.05。利用基因集富集分析（GSEA）^［25］对KEGG通路进行系统评估。

1.5 候选基因表达分析

利用RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441，天根生化科技有限公司，北京）提取1.1节中8个采样时期的牡丹花瓣总RNA后，用NovoScript^® One-Step RT-PCR Kit（苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，江苏苏州）进行cDNA合成。用NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus（苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，江苏苏州）试剂盒对候选基因进行表达分析。以PsActin为内参基因，采用2^-ΔΔCt 法计算候选基因相对表达量。每样品进行3次生物学重复，每重复包含3个操作重复。所用引物信息如表2所示。

2 结果与分析

2.1 牡丹花蕾、花瓣发育过程中的形态变化

2.1.1 花蕾形态变化

春季解除休眠后，牡丹花蕾横径和纵径逐渐增大（图2-A），其生长率变化曲线均呈双峰特征（图2-B、C）。其中，花蕾纵、横径的首个生长率曲线峰值分别见于S3和S2期，且前者峰值高于后者；花蕾横径和纵径生长率曲线次峰均出现在S6期，此时横径生长率远超纵径；且二者均在S3期后发育减缓，于S5期后发育增速（图2-B）；在花蕾形态发育初期，纵径大于横径，花蕾高宽比大于1；而随开花进程启动，花瓣展开，花蕾横径大于纵径，花蕾高宽比降至1以下（图2-C）。

2.1.2 花瓣形态变化

整个春季开花过程中，花瓣面积与远轴面细胞面积均随发育持续增加，并均在花朵完全开放（S10期）时达到最大值（图3）。自S2（可统计最小花瓣）至S10期间，花瓣面积由 （0.59±0.12） cm²增至（28.90±3.94） cm²，扩大约49倍；同时远轴面最大平均细胞面积从（382.31±54.74） μm²增至（2 252.79±431.70） μm²，增长约5.9倍。二者增长率均在早期（S1-S2）最高，S3期后增速显著放缓，至S5期再度加快（图4-B、C）。值得注意的是，S3期花瓣面积为（2.92±0.31） cm²，约占最终面积的10%，与细胞增殖向扩张转换的关键节点相吻合。

花瓣长度与宽度的增长均呈现双峰模式，先在S3期出现首峰，并达到最大增长率（长度和宽度分别为107.22%和131.58%），S4期显著下降至谷值（长度和宽增长率度分别为1.10%和0.53%），S5期出现次峰（长度和宽度增长率分别为64.42%和69.69%）（图4-D）。尽管二者增长趋势相似，但早期以宽度扩展为主，后期则长度增速加快，整体长宽比维持在约1.1，表明花瓣近圆形轮廓相对稳定（图4-F）。

远轴面表皮细胞长度增长与花瓣整体伸长趋势基本同步，在S3和S6期出现2个增长峰（增长率分别为36.38%和36.37%）（图4-E），但其增幅显著低于同期花瓣长度增长率，提示S2-S3期的花瓣纵向延伸主要由细胞增殖驱动，而非细胞伸长。远轴面表皮细胞宽度增长则呈现3个增长峰，除S3期外，各时期增长率均低于细胞长度，最终细胞长度累计增幅（319.92%）显著高于宽度增幅（121.30%）。细胞长宽比从发育初期的2.27升至S10期的3.55（图4-F），表明细胞伸长在扩张期起主导作用，而细胞增殖可能更倾向于促进横向扩展。

通过花瓣平均面积与细胞平均面积之比估算单个花瓣的表皮细胞数量，结果显示，细胞数量在整个发育过程中持续增加，且在早期（S3前）增长最为迅速。S3期单花瓣细胞数（（3.41±0.33）×10⁵）较S2 期（（7.04±0.33）×10⁴）增长约384%（图4-G）。结合以上细胞尺寸变化动态分析，表明S3期前花瓣面积的快速扩展主要由细胞增殖驱动。

聚类分析显示，S2-S5聚为一支（其中S3-S4形成次亚支），而S6-S10聚为另一分支（图4-A）。S5样本在聚类中与S3-S4相近，但其实际发育状态更接近扩张期。综上，可将牡丹花瓣发育划分为3个阶段：S1-S2为细胞增殖期，S5-S10为细胞扩张期，S3-S4为增殖向扩张过渡的转换期。

2.2 牡丹花瓣RNA-seq差异表达分析及功能注释

为揭示调控牡丹花瓣发育的关键基因，基于细胞学表型分析，选择代表细胞增殖期（S2）和细胞扩张期（S6）的样本进行了转录组测序。结果共鉴定到13 240个差异表达基因（different expression genes，DEGs），其中表达上调基因5 622个，表达下调基因7 618个（图5-A）。层次聚类热图显示，生物学重复间高度一致，但组间表达模式差异显著，表明数据可靠（图5-B）。通过K-means聚类将DEGs表达模式分为9个亚类，亚类Ⅶ（3 842个基因）和亚类Ⅷ（2 655个基因）包含差异表达基因数最多。亚类Ⅶ在S2期高表达、S6期显著下调，富集于细胞周期相关通路，而亚类Ⅷ基因在S6期表达上升、S2期低表达（图5-C）。二者呈现互补表达模式，说明其所包含的基因在花瓣发育阶段转换中可能发挥关键调控作用。

对差异表达基因的KEGG富集分析结果显示，植物激素信号转导、色氨酸代谢、玉米素生物合成及淀粉与蔗糖代谢等通路显著富集（图6），说明这些生物学过程在细胞增殖期（S2）与扩张期（S6）之间存在明显的转录调控差异。

为克服传统上基于显著差异基因的富集分析可能遗漏功能相关但表达变化幅度较小的基因，进一步采用基因集富集分析（GSEA，gene set enrichment analysis）对KEGG通路进行系统评估（图7）。结果表明，“植物激素信号转导”通路被显著富集，包含591个转录本，富集得分较高（ES=0.30），标准化富集得分NES=1.87（Nominal P<0.001），且多数相关基因在增殖期高水平表达，而在扩张期低水平表达。说明植物激素信号通路不仅在转录水平上发生显著调控，且整体呈协调性激活趋势，可能是调控牡丹花瓣从细胞增殖向扩张转换的关键分子途径，暗示植物激素在该发育进程中发挥系统性调控作用。

2.3 牡丹花瓣发育中植物激素代谢组分析

2.3.1 花瓣植物激素含量分析

基于转录组分析，为进一步解析植物激素在牡丹花瓣发育中的作用，进行了植物激素代谢组分析。共鉴定到7大类73种差异表达激素代谢物（图8）。其中，生长素（auxin）总量呈“升-降-升”三段变化模式：先在S4达峰值，后骤降至S6期谷值，花朵完全开放时（S10）再次累积至最高水平（图8-A），说明生长素不仅参与细胞增殖调控，亦在细胞扩张后期发挥作用，且在增殖阶段可能更具有主导的功能。细胞分裂素（CKs）总量在S1期最高，随后锐减并维持低水平（图8-B），与细胞增殖高峰时间吻合，表明其可能在细胞分裂过程中发挥关键作用。赤霉素（GAs）总量自S1期起持续下降，至S8和S10期降至最低（图8-C），呈现与花蕾、花瓣发育相反的趋势。脱落酸（ABA）总量呈三峰模式：S2期出现首峰，S4期出现主峰（最高值），S6期（初花期）出现三峰（图8-D），分别对应细胞增殖活跃期、增殖向扩张转换期末段及花朵初开期，表明ABA不仅参与发育时序调控，可能促进增殖向扩张的转换，亦在开花启动与后续衰老过程中发挥双重调控作用。

茉莉酸（JA）与水杨酸（SA）总量呈拮抗积累模式：JA在S1期含量最高，之后迅速下降并维持低水平（图8-E），推测其与花瓣发育早期的防御响应或细胞周期启动相关；SA则在S8期前保持低丰度，此后显著上升（图8-F），可能参与开花后期的抗逆调控与衰老进程。乙烯（ETH）直接前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）浓度随花瓣发育持续上升，尤其在S8期后显著增加（图8-G），表明乙烯合成活性在开花后显著增强，可能促进花瓣展开及衰老进程。

2.3.2 花瓣表型与植物激素含量关联分析

利用2.1节中花瓣发育表型指标数据与其7类植物激素总量做关联分析，结果（图9）发现生长素、细胞分裂素、乙烯及水杨酸含量与花瓣发育呈正相关，而脱落酸、赤霉素和茉莉酸含量与花瓣发育则呈负相关；其中细胞分裂素和赤霉素与花瓣表型指标的相关性最为显著（|P|值最大），说明二者可能在花瓣发育过程中发挥着关键作用。

2.4 牡丹花瓣转录组‑植物激素靶向代谢组联合分析

上述分析发现，生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸可能在牡丹花瓣发育中发挥关键调控作用，为进一步筛选发挥主要作用的激素种类和基因，进行了转录组-植物激素靶向代谢组联合分析。结果表明，在生长素合成通路中，催化色氨酸（tryptophan，Trp）向吲哚-3-乙酸（IAA）转化的关键酶编码基因YUCCA（YUC）在细胞扩张期（S6）显著上调表达，而参与中间产物色胺（tryptamine）合成的TDC基因则在细胞增殖期（S2）高表达（图10-B）。该结果与花瓣2个发育时期生长素含量变化规律一致：由于细胞增殖期色胺及色氨酸的积累，使得生长素总量高于细胞扩张期（图10-C）。在生长素信号转导层面，AUX1、TIR1、AUX/IAA及SAUR家族多数基因转录本在扩张期上调表达（图10-A），表明生长素虽在细胞增殖期有积累，但其信号响应主要在扩张期激活，其功能具有时序依赖性。

细胞分裂素合成基因（IPT、ZOG、UGT）及信号通路基因（AHP、ARR）多数转录本在细胞增殖期（S2）高表达（图10-A、B），但其总量在细胞增殖期低于细胞扩张期（图10-C）。表明细胞增殖期高水平的转录活性可能驱动了细胞分裂素的快速消耗，从而导致细胞分裂素总量维持在较低水平，其可能在早期细胞增殖中活跃地发挥功能。

脱落酸（ABA）合成基因（ZEP、NCED）和核心信号基因（PP2C、ABF）多数转录本在细胞扩张期（S6）上调表达（图10-A、B），但ABA含量在细胞增殖期更高（图10-C）。表明ABA在细胞扩张期可能通过增强信号敏感性而非增加合成量来发挥调控作用，存在“低丰度、高活性”的调控特征。

赤霉素（GA）合成基因（KO、KAO、GA20ox）虽然在细胞增殖期（S2）高表达，且多数种类GA（除GA₂₀外）含量在早期更高（图10-C），然而，在信号转导层面，受体基因GID1表达在细胞增殖期受到抑制，而负调控因子DELLA家族成员（3个中的2个）的表达量增加，GID2的2个转录本表达趋势则表现相反。

综合以上分析结果可知，在牡丹花瓣发育进程中，不同激素不仅通过浓度变化调控发育，更依赖于时空特异的信号通路激活，共同协调花瓣从增殖向扩张的转变。

2.5 候选基因在牡丹花瓣发育过程中的表达模式分析

为进一步解析牡丹花瓣发育的分子调控网络，在植物激素相关基因基础上，结合侧生器官发育的调控机制，利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了多个差异表达基因，筛选出12个在发育时序上呈现特异性表达模式、具有作为发育阶段标志基因潜力的候选基因（表3，图11）。

细胞增殖期（S1-S2）：细胞周期调控基因 CYCD3；1和CYCD6；1及生长调控因子互作蛋白编码基因GIF1（GRF-interacting factor 1）在细胞增殖期（S1-S2）表达量最高，并在转换期（S3-S4）显著下调，而在扩张期（S5-S10）几乎不表达。该表达模式与其在调控细胞周期进程中的功能^［26-27］一致，表明这些基因可能通过促进细胞分裂，参与‘户川寒’花瓣的细胞增殖活动。

细胞增殖向扩张转换期（S3-S4）：TCP3、生长素合成相关基因ARF2（ADP-ribosylation factor 2）、细胞分裂素氧化酶/脱氢酶编码基因CKX3、AP2家族成员AIL5（aintegumenta-like 5）、E3泛素连接酶编码基因BB（big brother）以及DELLA家族成员GAI在转换期的表达量均高于增殖期和扩张期。基于TCP3、ARF2和CKX3在促进细胞分化^{［12； 28-29］}，以及AIL5和BB在维持细胞增殖^［30-31］中的已知功能，推测这些基因可能通过协同或拮抗作用，共同调控细胞从增殖向扩张的转变。其中，GAI的相似表达模式说明赤霉素信号通路可能参与了此过程。

细胞扩张期（S5-S10）：细胞壁松弛相关基因EXPA11、脱落酸合成关键酶基因PsNCED及细胞分裂素氧化酶基因CKX6表达水平显著升高，其中 CKX6仅在S6期特异性高表达。EXPA11可能通过调控细胞壁可塑性促进细胞伸长；NCED上调或增强ABA介导的发育进程协调；CKX6的特异表达暗示其具有在细胞扩张初期精准调控细胞分裂素稳态的作用。这些基因的表达模式支持其在花瓣细胞扩张阶段发挥关键调控功能。

综上所述，RT-qPCR验证揭示了多个功能基因在牡丹花瓣发育各时期的动态表达特征，不仅为花瓣细胞增殖（S1-S2）、转换（S3-S4）和扩张（S5-S10）的发育阶段划分提供了可靠的分子标记，也为构建“激素-基因”协同调控网络提供了关键候选因子。

3 讨论

侧生器官发育一般分为3个过程：细胞增殖期、细胞扩张期及二者间的转换期，细胞增殖和细胞扩张的协同调控是侧生器官形态建成的重要保障^［21］。该研究结合细胞学动态、转录组与激素代谢组多维度数据，系统解析了‘户川寒’牡丹花瓣发育的阶段性特征及其分子调控机制，以期进一步丰富对木本花卉花瓣形态发育调控模型的理解。

3.1 牡丹花瓣发育的阶段性特征

在表型层面，该研究发现牡丹花瓣发育早期（S2-S3）以细胞数量的快速增加为主导，至S3期花瓣面积约为最终大小的10%，此时远轴表皮细胞数量较S2期增长约384%，与拟南芥叶片发育中“细胞停止增殖于最终大小约10%时”的模型高度吻合^［32］。该节点标志着细胞增殖活动达到高峰，随后进入增殖-扩张转换期（S3-S4）。该研究进一步发现，虽然牡丹花瓣在扩张阶段与非洲菊舌状花类似，以细胞的伸长生长为主导^［19］，但其早期的细胞增殖活动显著促进了花瓣的横向扩展。这种“横向增殖”与“纵向扩张”在时空上协同的模式，可能是牡丹形成其阔卵形花瓣的重要细胞学基础。

3.2 植物激素在牡丹花瓣发育阶段转换中的协同调控作用

作为关键信号分子，植物激素在调控细胞命运转变中发挥着核心作用。本研究通过多组学整合分析，揭示了生长素、细胞分裂素、赤霉素与脱落酸在牡丹花瓣发育中的时序特异性功能。

作为调控植物生长发育的关键激素，生长素通过调节早期信号响应基因（如Aux/IAA、TIR1、SAUR）的表达发挥作用^［33］。生长素响应因子（ARF）转录因子家族能特异性结合这些基因的启动子区域介导生长素响应^［34］。前人研究发现，ARF2功能缺失导致花器官与叶片增大，ARF2突变体细胞数量与大小均增加，说明ARF2通过抑制细胞增殖与伸长调控器官生长^［35-36］。该研究发现，PsARF2基因表达量在花瓣发育转换期最高，且增殖期表达量高于扩张期，其表达模式与生长素早期响应基因相反，推测PsARF2可能在转换期作为负调控基因通过抑制早期生长素响应基因的活性，协调细胞从增殖阶段向扩张阶段的有序过渡，维持细胞数量与大小的动态平衡。

细胞分裂素是促进细胞分裂的关键激素。其降解酶基因CKX3/CKX5突变导致拟南芥花器官细胞数量增加，从而促使花器官增大^［37］，而矮牵牛中细胞分裂素合成基因过表达可显著增大花器官^［38］，表明其通过调控细胞增殖影响器官大小。该研究RT-qPCR结果显示，牡丹花瓣细胞分裂素氧化酶基因PsCKX3在转换期（S4）高表达，而基因PsCKX6则在扩张初期（S6）高表达。与之类似，月季中CKX6被证实通过快速清除细胞分裂素，促进细胞增殖向扩张转变，进而调控花瓣大小^［12］。因此，笔者推测PsCKX3可能在转换期启动细胞分裂素降解，触发增殖终止；而PsCKX6的延迟表达可能进一步维持低水平细胞分裂素环境，确保扩张进程的稳态推进。

脱落酸对花瓣和叶柄细胞伸长与扩张具有抑制作用^{［13，19］}。该研究中，ABA含量在牡丹花瓣发育的S2、S4和S6时期呈现三峰波动，其合成基因 PsNCED 和信号基因 PP2C、ABF 在扩张期上调表达。这与杨树中ABA积累可促使发育阶段转换^［39］的发现相似，说明ABA可能作为发育阶段转换的信号之一参与调控。

赤霉素在该研究中表现出独特的调控模式。与前人研究发现其促进细胞扩张^{［10，13］}的作用有所不同，该研究中牡丹花瓣赤霉素含量呈现与花瓣发育指标负相关的趋势，表明其可能在花瓣发育起始阶段扮演重要角色；在转录组-激素代谢组联合分析中发现，尽管其合成基因在增殖期活跃表达、赤霉素含量也更高，但其信号通路的核心受体GID1表达却受到抑制，同时关键负调控因子DELLA（GAI）的表达量增加。这一系列证据表明，牡丹花瓣细胞在增殖期通过主动降低对赤霉素信号的敏感性，处于“高合成、低响应”的状态。进一步的表达模式分析发现，GAI表达量在从花瓣细胞增殖期向扩张期过渡的转换期达到峰值，表明DELLA蛋白的适时积累可能是促使细胞退出分裂周期、启动发育阶段转换的关键。

综上所述，牡丹花瓣的形态建成并非受单一激素的线性调控，而是受生长素、细胞分裂素、脱落酸与赤霉素等共同构成的复杂网络的综合调控。

4 结论

该研究通过整合细胞形态学、转录组与激素代谢组数据，揭示牡丹花瓣发育呈现明确的阶段性特征：S1-S2为细胞增殖主导期，S3-S4为增殖向扩张转换期，S5-S10为细胞扩张主导期。当花瓣发育至终态尺寸约10%时（S3期），细胞增殖活动达到高峰，随后进入以细胞伸长为主的扩张阶段。生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸通过其动态变化与信号通路的协同作用，精准调控牡丹花瓣发育。其中，增殖期由PsCYCD3；1、PsCYCD6；1与PsGIF1等基因驱动细胞分裂；转换期可能由PsARF2、PsCKX3和PsGAI等基因介导增殖向扩张转换；扩张期则由PsEXPA11、PsNCED及PsCKX6等基因促进细胞壁松弛与细胞扩张。这些基因的时空特异性表达模式，使其具备作为牡丹花瓣发育阶段划分的分子标记潜力。该研究构建了牡丹花瓣发育的“激素-基因-细胞”协同调控框架，为深入解析木本植物花器官形态建成的分子机制提供了理论基础与候选靶点。未来将在此基础上，对上述关键调控因子进行功能验证，并深入揭示其互作网络，从而获得对花瓣形态建成更全面、更深入的认识。

参考文献

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基金资助

国家林业和草原局行业标准项目(牡丹综合体（2018-LY-054）┣2019XKJS0324)

河北省省级科技计划项目(254X9918D)