TGF‑β1在小尾寒羊卵巢颗粒细胞黄体化进程中的生物学功能研究

Biological function of transforming growth factor‑β1 during luteinization of ovarian granulosa cells in Small‑Tailed Han sheep

摘要

目的 探究转化生长因子-β1（TGF-β1）在小尾寒羊卵巢颗粒细胞黄体化过程中的作用，为解析TGF-β1调控小尾寒羊卵巢颗粒细胞黄体化的机制提供理论依据。 方法 对小尾寒羊母羊进行同期发情处理，采用HE染色、RT-qPCR、Western blot和免疫荧光等方法分析TGF-β1在成熟卵泡、红体及黄体中的表达水平。体外培养小尾寒羊卵巢颗粒细胞，在培养基中分别添加5和10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素（hCG）及1和2 μg/mL胰岛素，筛选颗粒细胞体外黄体化的适宜培养基。在适宜培养基的基础上添加10 ng/mL TGF-β1重组蛋白，研究其对小尾寒羊卵巢颗粒细胞黄体化进程的影响。 结果 TGF-β1在小尾寒羊卵巢黄体组织，特别是颗粒黄体细胞中高表达（P<0.01）。2 μg/mL胰岛素为诱导颗粒细胞黄体化的适宜条件，能引起颗粒细胞超微结构的变化，促进黄体化相关基因（StAR、HSD3B1）、类固醇激素（E₂和P₄）及其合成限制酶（3β‑HSD、17β‑HSD、P450scc）的表达（P<0.05），显著促进细胞活力、增殖，抑制细胞凋亡。TGF-β1能显著上调黄体化相关基因StAR和HSD3B1的表达，并促进类固醇激素（E₂和P₄）的合成（P<0.05）。 结论 TGF-β1可促进小尾寒羊卵巢颗粒细胞黄体化。

Abstract

Objective This study aims to investigate the role of TGF-β1 during luteinization of ovarian granulosa cells in Small-Tailed Han sheep，providing a theoretical reference for elucidating the regulatory mechanism of TGF-β1 in the process. Method This study performed estrus synchronization treatment on Small-Tailed Han sheep ewes，and employed methods including HE staining，RT-qPCR，Western blot，and immunofluorescence to analyze the expression levels of TGF-β1 in mature follicles，corpora lutea，and corpora rubra. Ovarian granulosa cells were cultured in vitro and treated with 5 and 10 IU/mL hCG and 1 and 2 μg/mL insulin to screen the optimal medium for in vitro luteinization.Then，10 ng/mL TGF-β1 recombinant protein was added to the optimal medium to determine its effects on granulosa cell luteinization. Result The results showed that TGF-β1 was highly expressed in the ovarian luteal tissue of Small-Tailed Han sheep，particularly in granulosa lutein cells （P<0.01）.2 μg/mL insulin was identified as an optimal condition for inducing granulosa cell luteinization，which induced ultrastructural changes，promoted the expression of luteinization-related genes （StAR，HSD3B1），steroid hormones （E₂ and P₄），and their rate-limiting enzymes （3β-HSD，17β-HSD，P450scc） （P<0.05），and significantly enhanced cell viability and proliferation while inhibiting apoptosis.TGF-β1 significantly upregulated the expression of luteinization-related genes StAR and HSD3B1，and promoted the synthesis of steroid hormones （E₂ and P₄） （P<0.05）. Conclusion TGF-β1 can promote luteinization of ova-rian granulosa cells in Small-Tailed Han sheep.

Graphical abstract

关键词

转化生长因子-β1 / 小尾寒羊 / 颗粒细胞黄体化 / 胰岛素 / 人绒毛膜促性腺激素

Key words

transforming growth factor-β1 / Small-Tailed Han sheep / granular cell luteinization / insulin / human chorionic gonadotropin

卵泡作为卵巢的基本单位，具有调节卵子发生、促进卵母细胞生长发育和成熟、分泌甾体激素、为卵母细胞发育提供特异性微环境及参与卵巢周期调控等功能^［1］。颗粒细胞（granulosa cells，GCs）是卵泡内的一个关键细胞群，其增殖、凋亡、分化在卵泡发育等生物学过程中发挥着重要作用。雌性动物排卵后，卵泡中残余的颗粒细胞在黄体生成素（luteinizing hormone，LH）的作用下，不断增生聚集并分化为富含类脂质颗粒的颗粒黄体细胞，与膜黄体细胞共同组成黄体^［2］。这一过程中颗粒细胞发生形态学改变，如体积增大、细胞质中脂滴和线粒体增多、滑面内质网显著扩张、高尔基体体积增大等^［3］；同时颗粒细胞类固醇激素合成分泌发生变化，由以合成分泌雌激素为主转变为以合成分泌孕激素为主^［2］；分子水平上则表现为基因表达重编程，伴随着黄体化相关基因表达被激活，如类固醇合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）、细胞色素P450家族11亚家族A 1（cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1，CYP11A1）、3β-羟基类固醇脱氢酶1（3beta-hydroxysteroid dehydrogenase l，HSD3B1）^［4］。研究颗粒细胞黄体化进程不仅有助于阐明黄体形成机制，也可为黄体功能不足等疾病的诊疗提供理论依据。

目前，前人已在不同物种颗粒细胞的体外黄体化诱导方面展开了一系列探索研究，但诱导条件存在明显差异。用含体积分数10%牛血清蛋白（bovine serum albumin，FBS）的DMEM培养基培养牛颗粒细胞48 h，可诱导细胞体外黄体化^［5］；用2 μg/mL胰岛素处理牛颗粒细胞24 h，可显著提高细胞孕酮分泌量及黄体化相关基因（如StAR等）的表达量，诱导其黄体化并促进细胞增殖^［6］。用含体积分数10% FBS的DMEM培养基培养山羊颗粒细胞48 h，也可诱导细胞体外黄体化^［7］。用1 IU/mL人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）处理小鼠颗粒细胞24 h，能够提高细胞孕酮分泌量及孕酮合成限制酶（3β-羟基甾脱氢酶（3beta-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD）、17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-hydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD）和胆固醇侧链裂解酶（side-chain cleavage enzyme，P450scc））的表达量，并促进细胞黄体化^［8］。用5 IU/mL hCG或2 μg/mL胰岛素连续处理猪卵巢颗粒细胞3 d，均可显著提高细胞孕酮分泌量及黄体化相关基因（StAR、CYP11A1、HSD3B1）的表达量，从而诱导细胞黄体化^［9］。以上研究结果表明，FBS、激素等均可成为诱导颗粒细胞黄体化的主要因素。

转化生长因子-β1（transformation growth factor β1，TGF-β1）作为一种多功能生长因子，在卵巢多种类型细胞（上皮细胞、颗粒细胞、卵母细胞）中高表达^［10］，以细胞依赖性方式参与卵巢发育和周期性活动的多个生物学过程，如卵母细胞生长、卵泡发育成熟^［11］、卵丘扩展、排卵^［12］、蜕膜形成、滋养细胞入侵、新血管形成和免疫调控^［13］等。10 ng/mL的TGF-β1能够显著提高猪^［14］和小尾寒羊^［15］卵巢颗粒细胞的活力和增殖率，抑制其凋亡。TGF-β1能够通过调控颗粒细胞中孕酮合成相关基因（StAR、CYP11A1、HSD3B1）来影响牛颗粒细胞黄体化和孕酮分泌^［16］。同时，TGF-β1可通过调控颗粒细胞中黄体化相关基因基质金属蛋白酶1（MMP1）、人类Ⅰ型胶原蛋白的沉积来介导黄体化过程^［17］；还可通过改变人颗粒细胞中VCAM1和ICAM1的表达来调节血管形成^［18］，从而影响黄体发育。值得一提的是，用10 ng/mL TGF-β1培养体外受精和胚胎移植患者卵泡液中分离出的人黄体化颗粒细胞24 h，能使凋亡小体发生率显著降低，从而抑制人黄体化颗粒细胞凋亡^［19］。以上研究结果表明，TGF-β1作为细胞内重要的调节因子，其作用贯穿黄体形成、孕激素合成及黄体化颗粒细胞增殖、凋亡等多个环节。

小尾寒羊是我国著名的多胎绵羊品种，其因性成熟早、繁殖力高、遗传性能稳定等优良特性，被视为探究绵羊繁殖机理的理想试验对象^［20］。目前，有关TGF-β1在小尾寒羊卵巢颗粒细胞黄体化和黄体形成过程中的生物学功能尚不明确。为此，本研究以小尾寒羊为研究对象，分析TGF-β1在卵巢成熟卵泡、红体和黄体中的表达模式，筛选颗粒细胞黄体化适宜条件，并探究TGF-β1对其类固醇激素合成及相关基因表达的影响，为揭示黄体形成分子机制及绵羊繁殖机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材　料

在甘肃省临夏县华兴牧业养殖场挑选12只生长状况良好、健康无病且体况相近的2~3岁小尾寒羊母羊，利用孕激素阴道栓（CIDR栓，含黄体酮300 mg/枚，新西兰Bioniche Animal Health Pty公司生产）对羊只实施同期发情预处理。在CIDR栓撤除后42，72和216 h各屠宰4只羊，采集卵巢组织，分离成熟卵泡、红体、黄体，用生理盐水洗净后，右侧组织置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，左侧组织置于液氮中冻存。卵巢颗粒细胞，由本课题组分离培养和鉴定保存^［18］。

主要试剂：胎牛血清、DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素双抗溶液（Gibco，货号分别为A5256901、A4192001、15140122），5% BSA封闭液（上海源叶生物科技有限公司，货号为V87714），CCK-8试剂盒、PBS和胰岛素（Solarbio，货号分别为CA1210、P1020、I8040），无血清型细胞冻存液（上海雅酶生物医药科技有限公司，货号为BY002），BeyoClick^TMEdU-555细胞增殖检测试剂盒（Beyotime，货号C0075S），重组人TGF-β1蛋白（Bioss，货号为bs-41200P），hCG（Pasitong，货号为C11840）。

1.2 卵巢组织学检查

将固定于40 g/L多聚甲醛溶液中的成熟卵泡、红体、黄体组织通过洗涤、脱水、包埋、切片、贴片、烤片、脱蜡、苏木精-伊红染色、封片处理后，进行镜检分析。

1.3 TGF-β1在卵巢组织中的表达量检测

1.3.1 蛋白免疫荧光检测

将40 g/L多聚甲醛溶液固定的卵巢组织（成熟卵泡、红体、黄体）放入包埋盒中，流水冲洗，乙醇梯度脱水（体积分数75%，80%乙醇各脱水1次，95%和100%乙醇各脱水2次）、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、摊片、蘸片、烤片、脱蜡、水洗、PBS清洗；柠檬酸盐缓冲液孵育15 min，PBS清洗；体积分数5%山羊血清封闭15 min；加兔源TGF-β1（稀释倍数为1∶500），4 ℃孵育过夜；避光滴加山羊抗兔IgG（稀释倍数为1∶500），室温孵育30 min；PBS清洗，加入DAPI（稀释倍数为1∶800），孵育10 min；PBS清洗，封片，荧光显微镜下拍照采集图像。

1.3.2 基因实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测

以GAPDH作为内参基因，采用RT-qPCR检测成熟卵泡、黄体、红体中TGF-β1 mRNA表达水平。根据GenBank数据库中绵羊TGF-β1（登录号为NM_001135599.4）和GAPDH基因序列（登录号为NM_001190390.1），利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列（表1）。引物由杨凌天润奥科生物科技有限公司合成。

取处理好的卵巢成熟卵泡、黄体、红体各500 mg，在液氮中充分研磨后，用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent试剂盒提取总RNA，并检测其质量与浓度。随后按照HiScript^®ⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA。

利用ABI QuantStudio^TM6 Flex qPCR仪检测TGF-β1的表达水平，反应体系为20 μL，其中含cDNA 2.0 μL（约50 ng/μL），2×SYBR^® Green PremiｘPro Taq HS qPCR Kit 10 μL，0.25 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，ddH₂O 7.2 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。熔解反应：95 ℃变性15 s，60 ℃采集荧光信号60 s。用2^-△△Ct 法进行相对定量分析。

1.3.3 蛋白Western blot检测

取小尾寒羊的成熟卵泡、红体、黄体组织，加液氮充分研磨后，分别取20 mg样品于离心管中，加20 μL蛋白裂解液，4 ℃冰浴孵育30 min，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上清液，用BCA法测定蛋白浓度。将30 μL 5×上样缓冲液与120 μL蛋白样本混合于200 μL的离心管中，98 ℃水浴变性10 min，-20 ℃保存，用于后续试验。

对变性蛋白进行10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），上样量8 μL/孔。将目标蛋白转印至PVDF膜，洗去残留转膜液，用脱脂奶粉处理2 h；加兔源TGF-β1（abmat）和兔源GAPDH一抗（稀释倍数1∶5 000），4 ℃孵育过夜，PBST清洗3次，每次10 min；加山羊抗兔二抗（稀释倍数1∶6 000），37 ℃恒温摇床孵育1 h，PBS洗3次，每次10 min；滴加化学发光液避光孵育3~5 min，扫描成像仪扫描，用Image J软件以灰度值计算TGF-β1蛋白的相对表达量（TGF-β1蛋白灰度值/内参GAPDH蛋白灰度值）。

1.4 颗粒细胞黄体化适宜培养基筛选

1.4.1 试验设计

培养卵巢颗粒细胞，待细胞贴壁后随机分为5组，分别用DMEM（含体积分数10% FBS）及含5和10 IU/mL hCG、含1和2 μg/mL胰岛素（insulin，INS）的DMEM培养液（含体积分数10% FBS）连续培养3 d（分别记为CK、hCG5、hCG10、INS1、INS2组），进行后续试验。

1.4.2 不同条件培养的颗粒细胞透射电镜观察

不同条件培养的颗粒细胞经胰酶消化后收集于离心管中，经体积分数3%戊二醛预固定、脱水、包埋后，用超薄切片机制备90 nm厚切片，室温下用醋酸铀染色15 min，柠檬酸铅染色2 min，镜检。

1.4.3 不同条件培养的颗粒细胞类固醇激素及其合成限速酶基因表达水平检测

采用ELISA法检测不同条件培养的颗粒细胞雌二醇（E₂）、孕酮（P₄）分泌量。向96孔板加待测液或标准品50 μL/孔，空白孔加稀释液50 μL/孔，加50 μL HRP-conjugate及抗体充分混匀，37 ℃孵育60 min；弃废液后加200 μL Wash Buffer，PBS反复清洗并倒置沥干；每孔加50 μL Substrate A和Substrate B混匀，37 ℃孵育15 min，加50 μL终止液混匀，10 min内使用酶标仪于450 nm处检测吸光度（OD₄₅₀）。

以GAPDH为内参基因，用RT-qPCR法检测不同条件培养的颗粒细胞类固醇激素合成限制酶基因（17β-HSD、3β-HSD、P450scc）mRNA的表达水平，试验所用引物序列见表2。用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent试剂盒提取不同条件培养颗粒细胞总RNA，检测其质量与浓度后用HiScript^®ⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒反转录合成cDNA。利用ABI QuantStudio^TM6 Flex qPCR仪检测目的基因的表达水平，反应体系、反应条件、熔解反应同1.3.2节。采用2^-△△Ct 法进行相对定量分析。

1.4.4 不同条件培养的颗粒细胞活力和增殖能力检测

使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和BeyoClick^TM EdU-555细胞增殖检测试剂盒分别检测不同条件培养颗粒细胞的活力和增殖情况。

1.4.5 不同条件培养的颗粒细胞凋亡率及凋亡相关基因表达水平检测

不同条件培养的颗粒细胞经胰酶消化后，1 200 r/min室温离心3 min，弃上清液，1×PBS洗涤。每组收集大约1×10⁶个细胞，加500 μL binding buffer吹打混匀，分别添加5 μL PI和AnnexinⅤ-FITC，避光静置5 min后用流式细胞仪检测凋亡率。

以GAPDH为内参基因，用RT-qPCR法检测不同条件培养的颗粒细胞凋亡相关基因（PCNA、BCL-2、BAX、BAK）mRNA的表达水平，试验所用引物序列见表3。试验方法同1.3.2节。

1.4.6 不同条件培养的颗粒细胞黄体化相关基因和蛋白表达水平检测

以GAPDH为内参基因，用RT-qPCR法检测不同条件培养的颗粒细胞黄体化相关基因（CYP11A1、StAR、HSD3B1）mRNA的表达水平，试验所用引物序列见表3。试验方法同1.3.2节。

用Western blot方法检测黄体化相关蛋白（CYP11A1、StAR、HSD3B1）的相对表达量。

1.5 TGF-β1对颗粒细胞黄体化的影响

用添加10 ng/mL TGF-β1重组蛋白的最适培养基培养颗粒细胞48 h后，用ELISA法检测细胞E₂、P₄分泌量，并采用RT-qPCR和Western blot技术分别检测黄体化相关基因（CYP11A1、StAR及HSD3B1）和蛋白的表达水平。

1.6 数据统计与分析

试验结果以“平均值±标准差”表示。用SPSS 27.0软件对试验数据进行组间差异显著性分析，其中两组比较采用独立样本t检验，三组及三组以上比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 小尾寒羊卵巢成熟卵泡、红体和黄体的组织形态学观察

小尾寒羊卵巢成熟卵泡体积较大，腔内充满卵泡液，可清晰观察到立方状颗粒细胞和梭形卵泡膜细胞（图1-A）。红体间质结缔组织呈淡粉色，有大量红细胞填充于卵泡腔内（图1-B）。黄体组织颗粒黄体细胞体积较大，呈不规则圆形或多角形，多位于黄体组织中央；膜黄体细胞体积较小，呈梭形或纺锤形，多位于黄体组织外围（图1-C）。

2.2 TGF-β1在小尾寒羊卵巢组织成熟卵泡、红体和黄体中的表达模式

免疫荧光检测结果（图2-A）显示，TGF-β1蛋白在成熟卵泡（壁层颗粒细胞、卵泡膜细胞）、红体和黄体（颗粒黄体细胞、膜黄体细胞）中均有表达，其中在颗粒黄体细胞中的表达水平高于膜黄体细胞。RT-qPCR结果（图2-B）显示，黄体中TGF-β1基因mRNA相对表达量最高，红体次之，成熟卵泡中最低，且相互间呈极显著差异（P<0.01）。Wes-tern blot检测结果（图2-B）显示，黄体中TGF-β1蛋白相对表达量最高，成熟卵泡次之，红体中最低，且相互间呈极显著差异（P<0.01）。

2.3 小尾寒羊卵巢颗粒细胞黄体化适宜培养基的筛选

2.3.1 不同条件培养的颗粒细胞超微结构观察

自然培养条件（图3-A、B）下，颗粒细胞胞浆中线粒体形态近椭圆形，嵴清晰平直，基质电子密度均匀，呈灰色；粗面内质网呈扁平囊状，具有双层膜，表面附有核糖体；胞质中可见少量自噬溶酶体。添加hCG后的颗粒细胞形态结构出现变化（图3-C、D），胞浆中大量线粒体固缩，体积变小，呈杆状或球状，嵴减少或断裂，基质电子密度升高；粗面内质网轻度扩张，呈囊状，双层膜间隙增宽，表面核糖体有脱粒现象；胞质中可见较多自噬溶酶体。添加胰岛素后的颗粒细胞形态结构出现明显变化（图3-E、F），粗面内质网扩张呈囊状，双层膜间隙增宽，表面核糖体有脱粒；胞质中可见大量自噬溶酶体。在1 μg/mL胰岛素条件下，胞浆中大量线粒体固缩，体积变小，呈杆状或球状，嵴减少或断裂，嵴间腔增宽，基质电子密度升高；在2 μg/mL胰岛素条件下，胞浆中大量线粒体表现为肿胀，呈椭圆形或圆形，嵴减少、断裂或消失，基质部分溶解呈絮状，电子密度降低。

2.3.2 不同条件培养的颗粒细胞类固醇激素浓度及其合成限制酶基因表达水平

在培养液中添加hCG和胰岛素后，颗粒细胞E₂和P₄表达水平大多高于CK组，且E₂水平呈剂量依赖性变化；INS2组颗粒细胞E₂和P₄表达水平最高（图4-A）。不同浓度hCG和胰岛素处理后，17β-HSD基因表达量均呈现先下降后上升的变化趋势（图4-B）。添加hCG后3β-HSD基因表达量下降，其中10 IU/mL hCG处理差异达显著水平；添加胰岛素后3β-HSD表达量上升（P<0.05），其中2 μg/mL INS处理差异达显著水平（图4-B）。P450scc基因mRNA表达量随着培养基中hCG水平的增高表现出先上升后下降的趋势，但在胰岛素处理的情况下则表现出先下降后上升的趋势（图4-B）。

2.3.3 不同条件培养的颗粒细胞活力和增殖能力

CCK-8结果（图5）显示，在培养液中添加不同浓度的hCG和胰岛素后颗粒细胞活力显著增强（P<0.05），并呈现剂量依赖性变化，细胞在含2 μg/mL胰岛素的培养液中活力最高。EdU结果（图5、图6）显示，添加不同浓度hCG和胰岛素后增殖细胞的数量及EdU阳性率显著提高（P<0.05），其中以添加2 μg/mL胰岛素处理增殖细胞的数量和EdU阳性率最高。

2.3.4 不同条件培养颗粒细胞的凋亡率及其凋亡相关基因表达水平检测

流式细胞仪检测结果（图7-A）显示，在颗粒细胞中添加hCG和胰岛素能够显著降低细胞凋亡的数量（P<0.05），并呈剂量依赖性变化。

凋亡基因检测结果（图7-B、C）显示，hCG浓度达到10 IU/mL时，BAX和BAK基因mRNA相对表达量显著低于CK组（P<0.05），而PCNA、BCL-2 基因mRNA相对表达量与CK组无显著差异（P>0.05）。经胰岛素处理的颗粒细胞，BAX和BAK基因mRNA相对表达量显著低于CK组（P<0.05），PCNA、BCL-2基因mRNA相对表达量升高，尤其在2 μg/mL INS的培养条件下PCNA基因mRNA相对表达量显著提高（P<0.05）。

2.3.5 不同条件培养的颗粒细胞黄体化相关基因表达水平检测

如图8所示，与CK组相比，添加hCG和胰岛素后CYP11A1、StAR和HSD3B1基因mRNA及蛋白相对表达量大多发生显著性变化（P<0.05）。CYP11A1相对表达量在添加hCG和胰岛素后下降，呈剂量依赖性变化。StAR相对表达量随着hCG浓度的增高呈先上升后下降趋势，相反在胰岛素处理的情况下则呈先下降后上升的趋势。HSD3B1相对表达量随着hCG浓度的增高呈下降的趋势，但随着胰岛素浓度的增高呈上升趋势。

2.4 TGF-β1对颗粒细胞黄体化的影响

TGF-β1对小尾寒羊卵巢颗粒细胞P₄和E₂表达水平的影响如图9所示。由图9可知，在2 μg/mL胰岛素培养条件下添加10 ng/mL TGF-β1重组蛋白后，颗粒细胞P₄和E₂表达水平显著升高（P<0.05）。

TGF-β1对卵巢颗粒细胞CYP11A1、StAR、HSD3B1基因及其蛋白表达量的影响如图10所示。由图10可知，在2 μg/mL胰岛素培养条件下添加10 ng/mL TGF-β1重组蛋白后，颗粒细胞CYP11A1基因mRNA和蛋白相对表达量显著下降（P<0.05），而StAR、HSD3B1基因mRNA和蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）。

3 讨 论

黄体化颗粒细胞通过合成和分泌孕酮，维持子宫内膜蜕膜化，支持胚胎着床及妊娠维持等生理功能^［21］。已有研究发现，TGF-β1作为多功能细胞因子，不仅参与卵泡发育调控，还在黄体生成、颗粒细胞黄体化以及类固醇激素分泌等生殖过程中具有重要调节作用^［22］。据此推测，TGF-β1可能参与小尾寒羊卵巢颗粒细胞黄体化进程，进而影响黄体形成。

本研究首先分析TGF-β1在成熟卵泡、红体及黄体组织中的表达模式。结果显示，TGF-β1在黄体中高表达，提示其可能参与小尾寒羊黄体形成及维持。前人研究也印证了这一发现，如Wang等^［23］研究表明，TGF-β1可通过上调人颗粒黄体细胞中透明质酸合成酶2的表达来促进透明质酸的合成，从而促进颗粒黄体细胞外基质的合成；TGF-β1也可通过ALK5介导的p38信号通路促进人颗粒黄体细胞中Ⅰ型胶原蛋白α1链（COL1A1）的表达，促进人颗粒黄体细胞中Ⅰ型胶原蛋白的沉积，从而促进颗粒黄体细胞外基质的合成^［24］；TGF-β1可刺激永生化人颗粒黄体细胞和原代人颗粒黄体细胞中血管内皮生长因子（VEGF）的表达和分泌，从而促进颗粒黄体细胞血管的发育^［25］。免疫荧光结果进一步显示，TGF-β1在卵泡颗粒细胞中的表达量高于卵泡膜细胞，同时在颗粒黄体细胞中的表达量较膜黄体细胞高，推测TGF-β1主要作用于颗粒细胞，进而促进黄体化进程，但这一推测还需要进一步验证。

在此基础上，本研究在小尾寒羊颗粒细胞体外培养体系中添加不同浓度的hCG和胰岛素，观察细胞变化。透射电镜结果显示，经过hCG和胰岛素处理后颗粒细胞形态发生变化，线粒体数量增多，内质网扩张，胞浆中产生较多自噬溶酶体，这与陈琼等^［26］和Tang 等^［27］在小鼠卵巢颗粒细胞黄体化进程中观察到的形态变化基本一致，表明本研究中的颗粒细胞正处于黄体化阶段。CCK-8、EdU、流式试验结果显示，2 μg/mL胰岛素组颗粒细胞活力和增殖率最佳，凋亡率最低；黄体化相关基因的表达量变化及孕酮分泌变化试验进一步印证了这一结果，即2 μg/mL胰岛素为颗粒细胞黄体化最佳培养条件。Mcrae等^［28］率先提出颗粒细胞分泌孕激素能力的增强可被视为细胞黄体化的标志，并将StAR、CYP11A1和3β-HSD视为黄体化的标志基因。Sugino等^［29］进一步研究发现，颗粒细胞中StAR表达量显著上升也可作为细胞黄体化的标志之一。Hryciukc等^［30］研究表明，用胰岛素处理猫科动物颗粒细胞，可使细胞孕酮分泌量及StAR和HSD3B1基因的表达量增加，推断细胞发生了黄体化；Wu等^［31］研究显示，用hCG处理小鼠颗粒细胞，细胞的孕酮分泌量和StAR基因表达量上升，推断颗粒细胞发生了黄体化。除了CYP11A1基因外，本研究选用的StAR和HSD3B1基因，均能证实胰岛素处理的羊颗粒细胞处于黄体化阶段。

有大量研究简单认为，体外培养颗粒细胞会自发黄体化^［32］。而在本研究中，自然培养48 h后颗粒细胞的形态变化未能表现出大范围的线粒体肿胀、内质网扩张及大量自噬溶酶体形成。黄体化相关基因（StAR和HSD3B1）表达量低，表明自然培养法能够支持颗粒细胞自发黄体化，但黄体化程度相对有限。因此，本研究结果提示，单纯依赖自然培养条件不足以完全模拟体内黄体化进程，而2 μg/mL胰岛素处理颗粒细胞黄体化程度较CK处理高，可为体外精准模拟体内黄体化进程及后续机制研究提供更优的试验策略。

在2 μg/mL胰岛素培养条件下添加10 ng/mL TGF-β1重组蛋白，探讨TGF-β1对颗粒细胞黄体化进程的影响，结果发现TGF-β1能够促进黄体化相关基因表达，进而促进孕酮生成。其中StAR和HSD3B1均为孕酮合成通路中的关键调控基因，已有研究证实StAR通过介导胆固醇向线粒体转运，为孕酮合成提供底物^［33］；而HSD3B1则催化孕烯醇酮向孕酮转化，二者协同作用促进孕酮的合成^［34］。因此可推测，TGF-β1可能通过上调StAR和HSD3B1基因的表达量而显著提高颗粒细胞黄体化进程中孕酮的合成能力。

4 结 论

hCG和胰岛素均能够促进小尾寒羊卵巢颗粒细胞孕酮分泌量和黄体化相关基因（StAR和HSD3B1）的表达，引起细胞超微结构变化，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，其中2 μg/mL胰岛素为适宜诱导条件。TGF-β1 在黄体，特别是黄体化分化过程中的颗粒细胞中高表达，添加胰岛素的同时添加TGF-β1能够促进孕酮合成与分泌及黄体化相关基因（StAR和HSD3B1）的表达，表明TGF-β1参与了颗粒细胞黄体化进程。

参考文献

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基金资助

甘肃省高校教师创新基金项目(2025A-083)

甘肃农业大学科技创新基金-青年导师扶持基金项目(GAU-QDFC-2024-04)

甘肃省畜牧技术推广总站委托项目(GSAU-JSKF-2025-18)

浙江大学动物分子营养学教育部重点实验室开放基金项目(KLMAN202502)