侵染猕猴桃的CLBV‐Ac病毒基因组特征及侵染性克隆构建

Genome characteristics and infectious clone construction of a novel CLBV‐Ac virus infecting kiwifruit

摘要

目的 明确一种侵染猕猴桃的新病毒基因组特征，构建其侵染性cDNA克隆，并分析其致病性。 方法 以采集的感染新病毒的猕猴桃叶片为材料，通过长链RT-PCR和RACE技术获得新病毒全基因组序列，暂命名为柑橘叶斑驳病毒Ac（citrus leaf blotch virus Ac，CLBV-Ac），与乙型线形病毒科（Betaflexiviridae）其他成员共同构建进化树，分析基因编码氨基酸序列和基因组核苷酸序列的一致性，并检测潜在的基因重组事件，明确CLBV-Ac的分类地位。利用同源重组方法构建CLBV-Ac侵染性cDNA克隆，通过农杆菌浸润法将其接种至健康心叶烟和本氏烟中，测定其致病性。 结果 CLBV-Ac属于乙型线形病毒科柑橘病毒属（Citrivirus）成员，其基因组全长8 678 nt，不包含Poly A，基因组为正义单链RNA（+ssRNA），包含3个开放阅读框（open reading frame，ORF），分别编码病毒的复制酶蛋白（replicase polyprotein，RP）、运动蛋白（movement protein，MP）和外壳蛋白（coat protein，CP）。运动蛋白和外壳蛋白与柑橘病毒属其他成员的氨基酸序列一致性高于90%，相比之下，复制酶蛋白的氨基酸序列相似性仅有67.03%。基因重组分析发现，CLBV-Ac是柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）不同寄主分离物的重组体。成功构建了CLBV-Ac侵染性克隆载体pCB301-CLBV-Ac，接种烟草14 d后，叶片出现严重扭曲，并伴随轻微的褪绿症状。RT-PCR和斑点ELISA（Dot-ELISA）试验证实，构建的侵染性克隆pCB301-CLBV-Ac具有生物活性。 结论 CLBV-Ac是柑橘病毒属新成员，为侵染猕猴桃的新病毒，成功构建了CLBV-Ac侵染性克隆，为后续深入研究其致病机制提供了基础工具。

Abstract

Objective The study aims to clarify the genomic characteristics of a novel virus infecting kiwifruit，construct an infectious cDNA clone，and further analyze its pathogenicity. Method Using collected kiwifruit leaves infected with the novel virus as materials，the complete genome sequence of the novel virus tentatively named citrus leaf blotch virus Ac （CLBV-Ac） was obtained through long-chain RT-PCR and RACE techniques.To clarify the taxonomic position of CLBV-Ac，a phylogenetic tree was constructed with other members of the family Betaflexiviridae to analyze the consistency of the encoded amino acid sequences and genomic nucleotide sequences，and to detect potential gene recombination events.An infectious cDNA clone of CLBV-Ac was constructed using homologous recombination，and then inoculated into healthy Nicotiana benthamiana and N.glutinosa using the Agrobacterium-mediated infiltration method to determine its pathogenicity. Result CLBV-Ac is a member of the genus Citrivirus in the family Betaflexiviridae.Its genome is a positive-sense single-stranded RNA （+ssRNA） of 8 678 nt in length，excluding a Poly A tail，and contains three open reading frames （ORFs） that encode the viral replicase polyprotein （RP），movement protein （MP） and coat protein （CP）.The sequences of the MP and CP share over 90% similarity with other members of the Citrivirus genus， while replicase protein shows only 67.03% amino acid sequence similarity.Recombination analysis revealed that CLBV-Ac is a recombinant of CLBV isolates derived from different hosts.Furthermore，an infectious clone vector pCB301-CLBV-Ac was successfully constructed. Tobacco plants inoculated with this clone exhibited severe leaf distortion accompanied by mild chlorosis at 14 days after inoculation.RT-PCR and Dot-ELISA tests confirmed the biological activity of the infectious clone pCB301-CLBV-Ac. Conclusion CLBV-Ac is a new member of the genus Citrivirus and a novel virus that infects kiwifruit.The infectious clone of CLBV-Ac was successfully constructed，providing a basic tool for further in-depth research on its pathogenic mechanism.

Graphical abstract

关键词

猕猴桃 / 柑橘叶斑驳病毒Ac / 基因组特征 / 侵染性克隆

Key words

kiwifruit / citrus leaf blotch virus Ac / genome characteristic / infectious clone

猕猴桃（Actinidia spp.）是全球重要的经济水果作物，中国拥有全球最丰富的猕猴桃野生种质资源，包含54个种75个分类单元^［1］。美味猕猴桃（A.deliciosa）和中华猕猴桃（A.chinensis）是栽培最广泛的品种^［2］。陕西省依托秦岭北麓优生区的适宜气候条件，建成全球规模最大的猕猴桃连片种植带，2024年种植面积约为67万hm²，年产量达140万t，约占世界总产量的1/5，中国的1/3。然而，随着猕猴桃种植面积不断增加，病毒病的发生日趋严重，受病毒侵染的猕猴桃植株叶片可能表现出花叶、黄化、畸形、环斑等症状，对猕猴桃产量和品质造成严重影响^［3-4］。

乙型线形病毒科（Betaflexiviridae）成员能够侵染多种草本和木本植物，病毒粒子呈丝状颗粒，基因组为正义单链RNA（+ssRNA），大小为6.5~9.5 kb，所有成员均具有一个短的5'非翻译区（5'UTR），其后是一个开放阅读框（open reading frames，ORF），编码一个大小为185~250 ku的大型复制酶蛋白（replicase polyprotein，RP），该蛋白具有保守的甲基转移酶（methyltransferase，MTR）、解旋酶（helicase，HEL）和依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）结构域^［5］。柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）^［6］、猕猴桃种传潜隐病毒（actinidia seed-borne latent virus，ASbLV）^［7］、猕猴桃病毒A（actinidia virus A，AcVA）^［8］、猕猴桃病毒B（actinidia virus B，AcVB）^［9］、猕猴桃病毒C（actinidia virus C，AcVC）^［10］和柑橘碎叶病毒（citrus tatter leaf virus，CTLV）^［11］均是乙型线形病毒科成员，且在猕猴桃中呈现较高的带毒率^［2］。

前期在陕西关中地区的15个‘徐香’猕猴桃园收集了来自不同植株361份叶片样品，分离得到1个与CLBV的运动蛋白（movement protein，MP）和外壳蛋白（coat protein，CP）基因相似的毒株，但MP基因在进化树中却与CLBV日本地黄分离物（LC371929）聚集在一组。Liu等^［6］研究表明，CLBV MP基因存在寄主特异性。进一步比对发现，该病毒RP基因核苷酸与CLBV RP蛋白氨基酸序列一致性为52%，远低于乙型线形病毒科病毒新种划分标准（RP或CP核苷酸序列一致性低于72%，或氨基酸序列一致性低于80%）^［12］，暂命名为柑橘叶斑驳病毒Ac（citrus leaf blotch virus Ac，CLBV-Ac）。本研究通过长链RT-PCR和RACE技术扩增CLBV-Ac的全基因组序列，对其基因组特征进行解析，并构建了该病毒侵染性cDNA克隆，以期为后续CLBV-Ac致病机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 猕猴桃叶片保存与试验试剂

采集的361份‘徐香’猕猴桃叶片样本，保存于-80 ℃冰箱，部分发病样本叶片表现为花叶，边缘轻微黄化症状。pCB301双元表达载体，由南京农业大学陶小荣教授惠赠；CLBV侵染性克隆载体pCB301-CLBV、CLBV CP多克隆抗体，均保存于安康学院现代农业与生物科技学院分子植物病理学实验室。

ClonExpress^® Entry One Step Cloning Kit，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；2×Taq MasterMix、OmniPlant RNA Kit（DNase I）、Gel Extraction Micro Kit，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；pBM16A Toposmart Cloning Kit，购自北京博迈德基因技术有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、Phusion™ Plus DNA Polymerase，均购自Thermo Fisher Scientific；SeqAmp DNA Polymerase、SMARTer RACE 5'/3' Kit，均购自宝生物工程（大连）有限公司；化学发光液NBT和BCIP，均购自Promega公司；Anti-Rabbit IgG-AP二抗，购自亚科因生物技术有限公司。

1.2 猕猴桃叶片总RNA提取与反转录

称取100 mg猕猴桃叶片，在液氮中迅速研磨成粉状，采用多糖多酚RNA提取试剂盒OmniPlant RNA Kit（DNase Ⅰ）按照说明书步骤获得猕猴桃叶片总RNA。取2 μL RNA溶液，以Oligo （dT）₁₈为引物，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit按照说明书步骤合成第一链cDNA备用。

1.3 病毒RACE ready cDNA制备

以猕猴桃叶片总RNA为模板，使用SMARTer RACE 5'/3' Kit按照说明书依次合成病毒3' RACE ready cDNA和5' RACE ready cDNA，分别用于扩增病毒3'末端、5'末端和RP基因序列。

1.4 CLBV-Ac基因组扩增引物设计

根据病毒CP基因序列，设计用于扩增CLBV-Ac全基因组的特异性引物，引物信息如表1所示。所用引物均由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。

1.5 CLBV-Ac基因组扩增与分析

以CP基因为参考序列，病毒基因组分两段扩增，以5' RACE ready cDNA为模板扩增病毒基因组第一区段，50 μL高保真RT-PCR体系包含4 μL 5' RACE ready cDNA溶液，25 μL 2×SeqAmp PCR Buffer，2 μL UPM-5F（10 μmol/L），2 μL CL-BV-Ac-R（10 μmol/L），17 μL ddH₂O。反应程序：94 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，退火温度（表1）下退火15 s，68 ℃延伸5 min，循环40次。以3' RACE ready cDNA为模板扩增病毒基因组第二区段，50 μL高保真RT-PCR体系包含4 μL 3' RACE ready cDNA溶液，25 μL 2×SeqAmp PCR Buffer，1 μL SeqAmp DNA Polymerase，2 μL UPM-3R（10 μmol/L），2 μL CLBV-Ac-F（10 μmol/L），16 μL ddH₂O。反应程序：94 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火15 s，68 ℃延伸1 min，循环35次。获得的PCR产物经回收纯化后，使用ClonExpress^® Entry One Step Cloning Kit将目的片段连接至CE Entry Vector，转化DH5α后，每个基因选择3个阳性克隆送西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序。

使用Vector NTI中的ContigExpress程序去除冗余序列，拼接后获得CLBV-Ac完整基因组序列。使用SDT v1.3和DNAMAN软件，计算全基因组及各蛋白序列的一致性。从NCBI下载柑橘病毒属病毒基因组序列，使用MEGA 7.0中的Clustal W对齐病毒基因组序列，自展值设为1 000，采用邻接法（neighbor joining，NJ）构建系统发育树。使用RDP5软件检测病毒群体中的重组事件。RDP5中有7种重组检测方法，分别是RDP，GENECONV，Chimaera，MaxChi，BootScan，SiScan和3Seq，有效重组事件应至少被其中的5种算法同时预测到^［13］。

1.6 CLBV-Ac侵染性cDNA克隆载体的构建

pCB301载体双酶切：取pCB301载体1 μg，使用限制性内切酶Stu Ⅰ和Sma Ⅰ进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化线性化载体条带，获得线性化载体。

CLBV-Ac全基因组扩增：设计CLBV-Ac全基因组一步扩增引物pCB301-CLBV-Ac-F（5'-GT-TCATTTCATTTGGAGAGGGGAAAACGAA-ACCGAAACCAACTCAACCTC-3'）和pCB301-CLBV-Ac-R（5'-TGGAGATGCCATGCCGACC-CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAAAAGTTCTTAAAC-3'）（其中下划线部分为pCB301载体的同源臂序列）。50 μL RT-PCR扩增体系包含4 μL cDNA溶液，25 μL 2×SeqAmp PCR Buffer，1 μL SeqAmp DNA Polymerase，2 μL pCB301-CLBV-Ac-F（10 μmol/L），2 μL pCB301-CLBV-Ac-R（10 μmol/L），16 μL ddH₂O。反应程序：94 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火15 s，68 ℃延伸5 min，循环35次。PCR产物经回收纯化后，使用ClonExpress^® Entry One Step Cloning Kit，将CLBV-Ac基因组与pCB301线性化载体进行连接，转化Stable感受态细胞，获得侵染性克隆载体pCB301-CLBV-Ac，选择3个阳性克隆，送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序验证。

1.7 CLBV-Ac侵染性分析

采用液氮冻融法^［14］，分别将pCB301、pCB301-CLBV和pCB301-CLBV-Ac转入农杆菌GV3101，48 h后挑取阳性克隆，接种至含有50 μg/mL Kan和25 μg/mL Rif的LB液体培养基中，28 ℃振荡培养24 h，5 000 r/min离心1 min，弃上清液，收集菌体，用接种缓冲液（10 mmol/L MgCl₂、10 mmol/L MES和100 μmol/L As）调OD₆₀₀为0.6~0.8，室温黑暗环境诱导5 h以上，作为接种液备用。

选择6叶期本氏烟（Nicotiana benthamiana）和心叶烟（N.glutinosa），暗处理5 h后，采用农杆菌浸润接种，每棵植株接种3片叶子，同一植株每种载体接种9株，接种后将植株置于光照培养室中，设置温度22 ℃，光周期L/D为10 h/14 h，相对湿度60%，14 d后观察记录症状并进行病毒核酸和蛋白检测。

接种植株的RT-PCR和Dot-ELISA检测，基于病毒CP基因设计CLBV和CLBV-Ac通用检测引物CLBV-F（5'-TTGGTTAGCCATAGTTGAR-CCATT-3'）和CLBV-R（5'-TATATGTCAGCR-TAYCTCATAGC-3'）。RT-PCR检测流程：取新生叶片100 mg，提取总RNA后，反转录合成cDNA。50 μL RT-PCR扩增体系包含4 μL cDNA溶液，25 μL 2×Taq MasterMix，2 μL CLBV-F（10 μmol/L），2 μL CLBV-R（10 μmol/L），17 μL ddH₂O。反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火温度（表1）下退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；72 ℃终延伸5 min。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。Dot-ELISA参照刘欢等^［15］的方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 CLBV-Ac全基因组扩增与测序

以发病的猕猴桃叶片cDNA为模板，使用CP-F/R引物扩增到单一条带，大小与预期一致，经克隆测序后获得CLBV-Ac完整的CP基因序列。使用UPM-5F/CLBV-Ac-R引物从5' RACE ready cDNA中扩增得到约8 000 bp的单一条带，使用CLBV-Ac-F/UPM-3R引物从3' RACE ready cDNA中扩增得到约1 300 bp的单一条带（图1）。测序拼接后获得CLBV-Ac完整基因组序列，上传GenBank获得ID为MK135436。

2.2 CLBV-Ac基因组特征与一致性分析

CLBV-Ac基因组全长为8 678 nt，不包含Poly A，基因组为正义单链RNA（+ssRNA）。包含3个开放阅读框（open reading frame，ORF）（图2），其中ORF1全长5 844 nt，编码病毒的复制酶蛋白；ORF2全长1 089 nt，编码病毒的运动蛋白；ORF3全长1 092 nt，编码病毒的外壳蛋白。基因组结构、MP和CP基因大小与柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）和柑橘叶斑驳病毒2（citrus leaf blotch virus 2，CLBV-2）一致，但RP基因大小则不同，CLBV-2 RP基因为5 856 nt，CLBV不同寄主分离物RP基因为5 889~5 964 nt。

DNAMAN序列一致性分析结果（表2）表明，CLBV-Ac与乙型线形病毒科其他成员RP氨基酸序列一致性为23.64%~67.03%，而CP和MP氨基酸序列与CLBV和CLBV-2一致性较高，CLBV-Ac基因组序列与CLBV-2相似性最高，核苷酸序列一致性为70.13%（表2）。在乙型线形病毒科中，预期不同物种在CP或RP基因中具有<72%的核苷酸序列一致性或<80%的氨基酸序列一致性。来自不同属的病毒通常在CP或RP基因中具有<45%的核苷酸序列一致性，CLBV-Ac应属于柑橘病毒（Citrivirus）属新成员。

2.3 CLBV-Ac基因组系统发育分析

已有研究表明，CLBV在系统进化树中具有明显的寄主特异性。基于24个CLBV全基因组序列构建系统发育树，结果（图3）显示，CLBV-Ac形成独立的进化分支，不包含在现有的CLBV猕猴桃分离物分组中，虽然其MP和CP与CLBV存在较高的相似率，但在全基因组水平，CLBV-Ac与CLBV的遗传关系仍然较远。

与乙型线形病毒科的成员相比，RP蛋白差异最大，故利用CLBV-Ac编码的RP氨基酸序列构建系统发育树。结果（图4）显示，CLBV-Ac RP与柑橘病毒属成员CLBV和CLBV2聚集在一起，进一步表明CLBV-Ac为柑橘病毒属成员。

2.4 CLBV-Ac与柑橘病毒属成员的基因重组事件分析

在乙型线形病毒科中，基因重组在病毒进化中发挥着非常重要的作用^［16］，利用CLBV不同寄主分离物、CLBV-2和CLBV-Ac进行基因重组分析。结果（表3）表明，共检测到36个潜在的重组事件，其中有效重组事件19个，CLBV-Ac参与4个有效重组事件。其中3个重组事件是CLBV-Ac作为重组分离物，其主要亲本和次要亲本均来自CLBV的不同寄主分离物，包括南天竹（Nandina domestica）、柑橘（Citrus reticulata）和猕猴桃。此外，CLBV-Ac作为次要亲本参与1个重组事件，其主要亲本为CLBV猕猴桃分离物，重组体为CLBV金钟花（Forsythia viridissima）分离物。

2.5 CLBV-Ac侵染性分析

为进一步研究CLBV-Ac的致病性，采用同源重组技术成功构建了CLBV-Ac侵染性cDNA克隆载体pCB301-CLBV-Ac，与pCB301-CLBV同时接种本氏烟和心叶烟。14 d后，接种pCB301-CLBV-Ac的心叶烟新生叶片出现扭曲症状，本氏烟新生叶片出现卷曲和褪绿症状，发病率为100%；相比之下，所有接种pCB301-CLBV的心叶烟新生叶片出现明显的花叶症状，而叶片未出现扭曲症状，本氏烟新生叶片出现明显褪绿症状（图5）。由于CLBV-Ac的CP蛋白与CLBV高度相似（一致性高达93.94%），利用前期已经制备的CLBV CP多克隆抗体对新生叶片进行血清学检测，发现接种pCB301-CLBV-Ac和pCB301-CLBV的植株均为阳性，证实两者的CP蛋白存在血清学关系。同时结合RT-PCR检测也进一步证实，pCB301-CLBV-Ac侵染性克隆具有生物活性（图6），接种的本氏烟和心叶烟病毒检出率均为100%。而接种pCB301的植株均无任何症状，Dot-ELISA和RT-PCR检测结果均为阴性。

3 讨论

猕猴桃病毒病种类多，为害严重且防治困难。随着高通量测序技术的不断发展，近年来不断有报道发现侵染猕猴桃的新病毒^［17］。迄今为止，已在猕猴桃中鉴定出25种病毒^［18］，这些病毒可引起花叶、黄化、卷叶、畸形、环斑、叶脉黄化、黄环斑、坏死斑等多种症状^［19］。本研究将侵染猕猴桃的乙型线形病毒科病毒种类增至7种，分别是AcVA、AcVB、ASbLV、CTLV、CLBV、AcVC和CLBV-Ac。柑橘病毒属仅有CLBV，CLBV-2和CLBV-Ac共3个成员。其CP和MP氨基酸序列一致性大于90%，但RP氨基酸序列一致性仅有52.37%~67.03%，植物病毒的检测多依靠RT-PCR，且多数病毒检测引物均由CP基因设计^［20］。这意味着现有的RT-PCR可能已无法区分柑橘病毒属的具体成员，基于各自RP基因保守区设计检测引物可能会更准确。

基因重组是植物RNA病毒进化的常见策略，重组频率在一些+ssRNA病毒进化中非常重要^［21］，尽管不同病毒的重组频率可能存在显著差异^［22］。已有研究表明，乙型线形病毒科、甲型线形病毒科（Alphaflexiviridae）和芜菁黄花叶病毒科（Tymoviridae）有一个共同的祖先，随后发生的重组和基因丢失事件产生了各种植物病毒^［23］。基因重组也是乙型线形病毒科病毒进化的主要驱动力^［24-25］，重组在病毒获得对新寄主的适应性方面发挥着重要作用^［26］。本研究对CLBV、CLBV-2和CLBV-Ac基因重组事件进行了分析，推测CLBV-Ac似乎是通过CLBV不同寄主分离物之间的RNA重组产生的，导致其MP和CP基因与CLBV具有明显的同源性。该研究结果进一步支持重组可能在乙型线形病毒科病毒的进化中发挥着重要作用。值得关注的是，CLBV在自然界中呈现较高检出率，且寄主范围较广，主要由嫁接传播，虽然在草本寄主中已证实病毒可通过机械摩擦传播，但对木本植物而言，仍然没有证据表明机械摩擦可以有效传播病毒。这意味着柑橘病毒属病毒可能在自然界存在某种昆虫介体，推动病毒在不同寄主间高效传播。进一步通过不同株系基因重组产生新的基因型或新种，去适应新的环境和寄主。如果虫传介体被证实，将有效推动柑橘病毒属病毒病的防治工作。

侵染性cDNA克隆是研究植物RNA病毒的重要工具，而病毒全基因组的准确获得是保证侵染性克隆具有生物活性的必要条件。由于同一种病毒可能有多个不同基因型共同侵染同一作物，RT-PCR分段扩增和多次基因拼接可能会引起病毒基因组序列错误，最终导致侵染性克隆无活性。比如AcVA、AcVB、CTLV和CLBV，笔者对陕南猕猴桃进行宏病毒组测序，发现同一植株中常伴有多个病毒的基因型（数据尚未发表）。因此，病毒基因组一步扩增可有效避免此类问题，从而提高侵染性克隆的成功率。

在模式寄主中，CLBV-Ac主要引起叶片畸形，同时伴有轻度褪绿症状；而CLBV主要引起花叶或黄化症状，未见明显的叶片畸形。笔者在前期研究中，利用CLBV强毒株系和弱毒株系通过基因片段交换构建了一系列突变体，结果证实CLBV的RP基因是寄主症状的决定因子，本研究结果进一步表明，RP基因在柑橘病毒属病毒致病机制中发挥着重要作用。后续将利用CLBV-Ac与CLBV的RP基因重要位点进行比对，构建CLBV-Ac RP基因突变体，进一步揭示Citrivirus属病毒的致病机制。

4 结论

本研究明确了CLBV-Ac的基因组结构，解析了其分类地位，首次明确CLBV-Ac是侵染猕猴桃的柑橘病毒属新病毒，并成功构建了其侵染性cDNA克隆pCB301-CLBV-Ac，为后续研究柑橘病毒属病毒致病机理提供了重要工具。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32000123)

陕西省创新人才推进计划项目(2021KJXX-54)

陕西省教育厅一般项目(24JK0286)

国家级大学生创新训练项目(202411397014)