国槐凋落叶浸提液调控知母甾体皂苷合成的转录组分析

Transcriptome analysis on the regulation of steroidal saponin synthesis in Anemarrhena asphodeloides by fallen leafextract of Styphnolobium japonicum

摘要

目的 探究国槐凋落叶浸提液对知母甾体皂苷活性成分积累的影响，通过转录组测序揭示知母根部甾体皂苷合成的分子机制。 方法 选取经7.5 g/L国槐凋落叶浸提液处理与蒸馏水处理的知母根部样本，提取总RNA构建cDNA文库，利用Illumina进行转录组测序获得高质量数据，经Trinity拼接组装后得到Unigene；筛选出差异表达基因（DGEs）后进行GO和KEGG富集分析，挖掘知母中与甾体皂苷相关的合成通路及关键酶；选取10个DEGs，采用RT-qPCR技术进行验证分析。 结果 转录组测序共得到37.25 Gb的高质量数据，拼接组装后获得93 227个单基因族。从7.5 g/L国槐凋落叶浸提液处理组和对照组筛选出4 982个DEGs，其中3 322个DEGs注释到GO数据库的3大分类，1 371个DEGs注释到KEGG数据库的133条代谢通路。与对照组相比，分别有17，3和17个DEGs参与萜类骨架生物合成、半萜和三萜类化合物生物合成、类固醇生物合成。在萜类骨架生物合成途径中，MVK、ISPS、IDI、HMGCS、HMGCR、FDPS、ACAT均呈现上调表达；在半萜和三萜类化合物生物合成途径中，FDFT1、SQLE均上调表达；在类固醇生物合成途径中，SMO2、SMO1、3BETAHSDD、CYP710A、CYP51、CP11、CAS1、FDFT1、EBP、SC5DL、TM7SF2、DHCR7均上调表达。RT-qPCR验证结果显示，随机选取的10个DEGs与测序数据趋势一致，进一步证实了转录组结果的可靠性。 结论 国槐凋落叶浸提液处理显著影响知母根部基因表达，并特异性上调了甾体皂苷生物合成途径中的多个关键酶基因。

Abstract

Objective This study aims to explore the effects of fallen leaf extract from Styphnolobium japonicum （L.） Schott on the accumulation of active steroidal saponin components in Anemarrhena asphodeloides Bunge，thereby revealing the molecular mechanism of steroidal saponin synthesis in A.asphodeloides roots through transcriptomic sequencing. Method Root samples of A.asphodeloides treated with 7.5 g/L fallen leaf extract of S.japonicum and distilled water were collected.Total RNA was extracted for cDNA library construction，and high-quality transcriptomic data were generated via Illumina sequencing.Clean reads were assembled into Unigenes using Trinity.After screening for DGEs，GO and KEGG enrichment analyses were performed to identify synthesis pathways and key enzymes related to steroidal saponins in A.asphodeloides.Ten DEGs were further selected and validated by RT-qPCR. Result A total of 37.25 Gb of high-quality data was obtained from transcriptome sequencing，yielding 93 227 Unigenes after assembly.4 982 DEGs were identified from the 7.5 g/L treatment and control groups.Among them，3 322 DEGs were annotated to three major categories in the GO database，and 1 371 DEGs were annotated to 133 metabolic pathways in the KEGG database.Compared with the control group，17，3，and 17 DEGs were involved in the biosynthesis of terpene backbone，sesquiterpenoids and triterpenoids，and steroids，respectively.In the terpenoid backbone biosynthesis pathway，MVK，ISPS，IDI，HMGCS，HMGCR，FDPS，and ACAT were all upregulated.In the sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis pathways，FDFT1 and SQLE were both upregulated.In the steroid biosynthesis pathway，SMO2， SMO1，3BETAHSDD，CYP710A，CYP51，CP11，CAS1，FDFT1，EBP，SC5DL，TM7SF2，and DHCR7 were all upregulated.RT-qPCR results confirmed that 10 randomly selected DEGs exhibited trends consistent with sequencing data，further supporting reliability of transcriptome analysis. Conclusion Treatment with S.japonica fallen leaf extract significantly influenced gene expression in A.asphodeloides roots，specifically upregulating multiple key enzyme genes in the steroidal saponin biosynthesis pathway.

Graphical abstract

关键词

知母 / 国槐凋落叶浸提液 / 差异表达基因（DEG） / 次生代谢产物 / 合成调控 / 甾体皂苷合成

Key words

Anemarrhena asphodeloides / fallen leaf extract of Styphnolobium japonicum / differentially expressed genes （DEGs） / secondary metabolites / synthetic regulation / steroidal saponin biosynthesis

中药材知母是天门冬科（Asparagaceae）植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bunge）的干燥根茎，在中国主要分布在河北、山西、山东、陕西、甘肃等地。《神农本草经》中首次记载知母：“主消渴热中，除邪气肢体浮肿，下水，补不足，益气。”知母具有清热泻火、滋阴润燥的作用，常用于治疗肺热燥咳、高热烦渴及外感热病^［1］。随着我国中医药产业的快速发展，药用植物知母的供需矛盾日益突出，市场需求的持续增长导致部分地区出现无序采挖现象，不仅造成野生知母种群数量急剧下降，更使自然资源面临枯竭风险，为此规模化人工种植技术应运而生并逐步实现产业化应用^［2-3］。在北京市“百万亩造林”生态工程实施过程中，国槐（Styphnolobium japonicum （L.） Schott）作为北京市的市树，人工造林面积持续稳步上升。为充分利用林地资源及其生态系统优势，林下经济模式逐渐兴起，在林间空地开展药用植物栽培，既实现了土地资源的集约化利用，又对维护区域生态多样性具有积极作用^［4-6］。知母具有一定的耐阴性，能在适度遮阴条件下正常生长，因此成为林药复合种植模式下的备选药材。前期试验数据显示，国槐凋落叶浸提液对知母幼苗生长具有显著抑制作用，具体表现为根系伸长受到明显抑制^［7］。这一现象是植物化感作用的典型特征之一^［8-9］。此外国槐作为豆科植物，其凋落物已被报道含有酚酸、类黄酮等潜在的化感物质^［10］。因此推测这种抑制作用很可能通过化感作用实现，这种化感抑制作用可能触发了知母的胁迫响应机制，促使植物将更多资源从初级生长转向次生代谢产物的合成，以应对环境压力。然而关于国槐凋落叶化感物质如何通过调控次生代谢产物（尤其是其主要活性成分甾体皂苷）合成的分子机理来影响知母的生理响应，仍需开展深入探究。

知母中主要含有甾体皂苷、黄酮类、多糖类和生物碱等化学成分^［11］，甾体皂苷类是其中的主要活性成分^［12］。研究发现知母皂苷具有抗肿瘤^［13］、降低血糖^［14］、治疗阿尔兹海默症^［15］和减轻心肌细胞损伤^［16］的作用。转录组测序技术作为一种重要的分子生物学方法，已经在基因组信息匮乏的药用植物研究中得到广泛应用^［17］。李瑞阳等^［18］基于天冬（Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.）不同膨大阶段的样本，经转录组测序定位木葡聚糖内转葡糖基酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase， XTH）可能是影响天冬块根膨大发育过程的最主要酶类，为根系发育研究提供了基因组学理论参照。喻志标等^［19］通过转录组测序分析枳实不同发育期转录水平差异，发现在花期后60 d类黄酮合成通路基因高表达，确定此时为枳实最佳采收期。聂祝欣等^［20］通过转录组测序发现了花色苷合成途径的结构基因，对深入理解黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）花色苷合成调控网络具有重要意义。目前对于知母的研究主要聚焦于药理和临床病理学，然而在次生代谢产物合成通路方面，尤其是其特征活性成分知母皂苷的生物合成通路及其分子调控机制的研究尚存在空白。基于此，本研究选取了经国槐凋落叶浸提液处理及对照组的知母根部样本，运用高通量测序技术对知母根部进行转录组测序分析，旨在系统识别并筛选知母响应此处理所产生的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），进一步探讨这些基因在知母生物活性成分合成通路的调控作用机制，以期从分子层面全面阐释国槐凋落叶对知母皂苷类活性物质合成的影响，同时为后续相关领域的深入探索提供可靠的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材　料

本研究所用国槐凋落叶于2024年11月收集于北京市京城槐园和北京林业大学校园内，经漂洗、消毒处理后自然风干，并裁剪成约0.5 cm²的小片备用。知母种子购自河北安国万草同源苗木花卉有限公司，经消毒、催芽后播种于灭菌营养土中，在温室（光照/暗周期14 h/10 h，温度（25±2） ℃）中培养至60 d，选取长势一致的幼苗用于试验。

国槐凋落叶浸提液制备：精确称取60 g国槐凋落叶小片，与1 L蒸馏水混合后置于摇床上，以恒定速率振荡24 h。用2层纱布对混合物进行过滤，去除固体残渣，再将滤液以3 000 r/min离心10 min取上清液，即为60 g/L国槐凋落叶浸提液原液。将该原液经蒸馏水按比例稀释，依次获得30，15和7.5 g/L的浸提液。根据前期预试验结果，7.5 g/L浸提液在处理60 d后对知母幼苗根长抑制率较强，且差异基因也最多，故本研究选取7.5 g/L浸提液作为转录组分析的最终处理质量浓度。

植株处理与取样：将长势一致的知母幼苗分为2组：试验组（ZL）用上述7.5 g/L国槐凋落叶浸提液处理（每2 d浇灌20 mL浸提液）；对照组（ZO）用蒸馏水同步处理。处理60 d后（此时处理组表现出稳定的表型差异），分别从2组中各采集3份根部样本（相应编号为ZL1-ZL3和ZO1-ZO3），共获取6份样本。样本经蒸馏水冲洗干净后分装于冻存管中，并迅速置于液氮中进行冷冻固定。后续高通量测序工作由北京百迈客生物医学科技有限公司承担完成。

1.2 总RNA提取、文库构建和测序及转录本组装

本研究采用Trizol Reagent （Invitrogen）试剂盒，从知母根部样本中分离总RNA；随后，借助NanoDrop 2000分光光度计及Agilent 2100/LabChip GX系统，对所得RNA样本的纯度、浓度及完整性进行全面评估。以所有RNA样本rin值都在6以上符合要求，使用NEBNext Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina （NEB）试剂盒构建知母根部转录组测序文库，经验证合格后，在Illumina Nova-Seq系统上进行高通量测序反应，以获取与知母根部基因表达相关的数据。运用Trimomatic软件^［21］对这些原始数据进行预处理过滤操作，即去除含有测序接头以及质量不佳的序列片段，获得高质量序列（clean reads）。采用Trinity软件^［22］对高质量数据进行拼接处理，构建完整的转录本（transcripts）。在拼接过程中，主要设定了以下参数：最小连续序列长度200，配对距离阈值 500，其余参数则采用软件默认设置。进一步通过同源比对与整合，最终获得了知母的单基因簇（Unigene）。

1.3 差异基因的分析

以差异表达倍数（fold change，FC）的对数（以2为底）的绝对值|lb FC|≥2且显著性P<0.05为筛选标准，采用DESeq2^［23］进行基因差异表达分析，筛选出DEGs，然后对DEGs进行差异基因统计、GO功能富集分析及KEGG代谢通路富集分析。

1.4 实时荧光定量PCR验证

从上述3个通路中选取10个具有代表性的DEGs，通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）对其表达水平进行验证，以评估转录组测序结果的可靠性。以18S rRNA作为内参基因，其正向引物序列（5´→3´）为CCGACCATAAACGATGCCGACC，反向引物序列（5´→3´）为TTTCAGCTTTGCAACCATACTCC。其余各基因所用RT-qPCR引物详见表1，基因相对表达量采用2^-∆∆Ct 法进行计算。

2 结果与分析

2.1 转录组测序数据及其可靠性分析

如表2所示，转录组测序共得到37.25 Gb的高质量数据，各样品Q₃₀值均≥96.76%，GC含量在45.74%~46.90%。

使用Trinity软件对经过质控的高质量测序数据进行组装，共获得186 390个转录本，其总长度为187 089 660 bp，平均长度为1 003.75 bp，N50的碱基对长度为1 622 bp。经进一步去冗余处理后获得93 227个单基因簇，总长度为68 898 784 bp，平均长度为739.04 bp，N50的长度为1 365 bp。组装的完整性及N50长度均处于较高水平，表明转录组数据组装质量良好，足以支持后续精准的基因表达功能注释分析。单基因簇在［200~300） bp的数目最多，有36 561条，占比为39.22%%；单基因簇≥2 000 bp的数目最少，有8 145条，占比为8.74%（表3）。说明整体数据可靠，为后续分析奠定了基础。

2.2 知母根部甾体皂苷合成差异表达基因分析

为探究国槐凋落叶浸提液处理对知母根部甾体皂苷合成相关基因的影响，以|lb FC|≥2且显著性P<0.05为阈值，筛选2个样本之间的DEGs，结果见图1。图1结果表明，与对照组相比，处理组DEGs数目为4 982个，其中有2 700个上调基因，2 282个下调基因。表明国槐凋落叶浸提液处理引发了知母根部在转录组层面的广泛响应，为后续深入解析其特异性调控通路奠定了基础。

2.3 差异表达基因GO功能注释和KEGG通路分析

为解析上述4 982个DEGs的潜在生物学功能及其参与的代谢过程，对其进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。GO功能注释结果（图2）显示，共有3 322个DEGs被显著注释到GO 3大本体类别，即生物学过程、细胞组分和分子功能，并可归属至其下的37个功能组别，其中生物学过程涵盖21个，细胞组分为3个，分子功能为13个。在生物学过程类别中，DEGs主要富集于细胞过程（45.73%）和代谢过程（42.47%）等功能组别。在细胞组分类别中，DEGs富集最显著的是细胞结构体相关条目（59.75%）。在分子功能类别中，则以结合功能（49.79%）和催化活性（46.24%）为主要富集条目。

进一步进行KEGG通路分析，结果显示，共有1 371个DEGs被成功注释至133条代谢通路。图3列出了富集程度排名前50的主要通路。这些通路可归类于以下5大类别：细胞过程（3条）、环境信息过程（4条）、遗传信息过程（10条）、新陈代谢（31条）及生物系统（2条）。在细胞过程中，DEGs主要分布在内吞作用（1.90%）和吞噬体（1.90%）；在环境信息过程中，DEGs主要分布在植物激素信号转导（6.42%）等条目；在遗传信息过程中，DEGs主要分布在内质网中的蛋白质加工（4.23%）等条目；在新陈代谢中，DEGs主要分布在苯丙酮的生物合成（5.40%）及淀粉和蔗糖代谢（5.11%）等条目；在生物系统中，DEGs主要分布在植物病原体互作（9.19%）等条目。值得注意的是，萜类骨架生物合成和类固醇生物合成等与目标产物甾体皂苷合成密切相关的通路也位列其中，因此成为本研究下一阶段分析的焦点。

2.4 知母根系与甾体皂苷合成途径相关酶的鉴定

基于KEGG富集分析提示，国槐凋落叶浸提液处理显著影响了萜类骨架生物合成及类固醇代谢相关通路。鉴于甾体皂苷是知母的主要药用活性成分，且其生物合成始于萜类骨架并经由类固醇途径修饰完成，本研究将对萜类骨架生物合成、半萜和三萜类化合物生物合成及类固醇生物合成这3个关键通路进行了聚焦分析，旨在鉴定其中受调控的关键酶基因。

2.4.1 与萜类骨架生物合成有关的DEGs

在转录组分析中，共筛选出17个与萜类骨架生物合成过程密切相关的DEGs。与对照组相比，有15个上调，2个下调。如表4所示，这些DEGs对应9种结构基因，其中位于MVA途径核心的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR）以及负责合成甾体与三萜类化合物共同前体法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）的法尼酰二磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，FDPS）等的多个基因均呈现上调表达。图4以热图形式展示了萜类骨架生物合成通路中关键差异表达基因的表达模式及其在通路中的定位。如图4所示，该通路中绝大多数基因在处理组中呈现上调表达，尤其是位于MVA通路核心位置的HMGCS、HMGCR及FDPS基因。这种整体上调的表达模式表明，国槐凋落叶浸提液处理可能系统性地激活了知母根系的MVA通路，从而为甾体皂苷的合成提供了更为充足的萜类前体。

2.4.2 与半萜和三萜类化合物及类固醇生物合成有关的DEGs

经国槐凋落叶浸提液处理后，知母根部共鉴定出3个DEGs参与半萜和三萜类化合物的生物合成，且与对照组相比均为上调表达。这3个DEG归属于2种结构基因（表5），即二磷酸法尼基转移酶（farnesyl-diphosphate farnesyltransferase，FDFT1）基因2个，角鲨烯单氧化酶（squalene monooxygenase，SQLE）基因1个。

经国槐凋落叶浸提液处理后，知母根部共鉴定出17个DEGs参与类固醇生物合成过程。与对照组相比，有14个基因上调表达，3个基因下调表达。这些DEGs归属于15种结构基因（表6），涵盖了从角鲨烯向下游甾醇转化的关键催化步骤，包括环阿屯醇合酶（cycloartenol synthase，CAS1）、甾醇去甲基化酶（sterol 14α-demethylase，CYP51）及多个修饰酶基因。图5展示了类固醇生物合成通路中差异表达基因的表达热图。如图5所示，从角鲨烯到下游各类固醇产物的多条分支路径上，均有关键基因（如CAS1，CYP51，CYP710A等）的表达上调。这清晰地表明，国槐凋落叶浸提液处理不仅影响了甾体骨架的合成，也调控了其后续的羟基化、去甲基化等修饰过程。

2.5 差异表达基因的RT-qPCR验证

为确保转录组分析所得结果的精确性与可信度，本研究精心挑选了10个差异表达基因DEGs作为目标对象，运用RT-qPCR展开深入分析，结果见图6。从图6可以看出，10个差异表达基因均上调表达，与转录组测序数据所呈现的整体变化态势高度一致。这充分证明了本研究获得的转录组数据是准确可靠的。尽管未能直接测定药用活性成分含量，但这些关键合成基因的显著上调，从分子水平上明确了国槐凋落叶浸提液处理对知母甾体皂苷等成分生物合成的定向调控作用，为国槐凋落叶影响知母药用活性成分积累这一研究目的提供了关键证据。

3 讨 论

3.1 综合讨论与展望

本研究通过转录组分析发现，国槐凋落叶浸提液处理显著上调了知母根部甾体皂苷合成通路中多个关键酶基因（如HMGCR等）的表达。次生代谢通路中关键基因的上调通常与其终端产物的积累存在正相关关系^［24-25］。说明国槐凋落叶浸提液处理可能激活了知母体内甾体皂苷的生物合成潜力。

然而必须指出本研究存在以下局限，这也构成了未来研究的方向：首先，水浸提液是包含潜在化感物质及其他成分的复杂混合物，观察到的转录响应是综合效应的结果。为明确其化感作用的物质基础，后续需采用色谱-质谱联用技术分离鉴定其中的关键活性成分，并通过单一化合物处理试验验证其特异性效应。其次，基因表达的上调仅为合成潜力的提升提供了线索，要最终证实国槐凋落叶处理对知母药用品质（即甾体皂苷含量）的实际影响，必须借助代谢组学技术（如HPLC、LC-MS）对知母皂苷A-Ⅲ、B-Ⅱ等主要活性成分进行直接、定量的测定。

综上所述，本研究从转录组层面揭示了国槐凋落叶影响知母次生代谢的初步分子图谱。未来的研究应围绕“特定化感物质鉴定→关键基因功能验证→终端产物代谢组学定量”这一完整科学链条展开，以期全面阐明国槐‑知母林下互作中的化学生态学机制，并为通过栽培措施定向改良药用植物品质奠定了重要的理论基础与候选基因资源。

3.2 萜类骨架生物合成通路中关键酶的调控作用

本研究发现，国槐凋落叶浸提液处理显著上调了知母根系MVA通路中多个关键酶基因的表达，包括限速酶HMGCR和FDPS等。这一现象表明，国槐凋落叶浸提液可能通过增强MVA途径的代谢通量，为下游甾体皂苷合成提供更充分的前提物质^［26］。FDPS催化异戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯酸合成香叶基二磷酸，进一步生成法尼基二磷酸，是甾体皂苷和三萜类化合物合成的关键分支点^［27］。FDPS上调可能意味着代谢流向被特异地导向了以FPP为起点的C30及以上骨架的合成方向。这与在人参^［28］等药用植物中皂苷积累往往伴随MVA通路上调的现象相一致，说明这可能是药用植物响应特定胁迫、增强次生代谢的一种保守策略。本研究结果不仅明确了国槐凋落叶浸提液处理下知母皂苷合成的潜在上游增强节点，也为通过遗传或栽培手段定向调控该通路以提升皂苷产量提供了明确的靶点。

3.3 半萜和三萜类化合物合成通路的响应机制

在半萜和三萜类化合物合成通路中，FDFT1和SQLE基因的表达显著上调。FDFT1催化2分子FPP缩合形成角鲨烯，而SQLE则将角鲨烯转化为2，3-氧化角鲨烯，这两步反应是甾体皂苷合成的关键节点。Li等^［29］通过转录组和代谢组联合分析发现，SQLE是蒙古黄芪（Astragalus membranaceus var.mongholicus （Bunge） P.K.Hsiao）中三萜皂苷物质积累的主要原因。在本研究中，上调的FDFT1和SQLE基因可能通过增加角鲨烯及其氧化产物的供应，直接促进甾体皂苷合成。此外，角鲨烯还是植物甾醇和三萜类化合物的共同前体^［30］，其代谢流向调控可能影响知母中多种活性成分的平衡。

3.4 类固醇生物合成通路中关键酶的协同作用

类固醇生物合成通路中大量基因的上调，尤其是CAS1、CYP51、CYP710A等涉及骨架环化与羟基化修饰的基因，表明国槐凋落叶浸提液处理不仅促进了甾体骨架的形成，也可能影响其后续修饰。CAS1催化2，3-氧化角鲨烯环化为环阿屯醇，是植物甾醇合成的起始步骤，其基因上调表达可能增强了甾体骨架的形成^［31］。而CYP家族基因（CYP51和CYP710A）的上调则可能意味着甾体骨架的羟基化、去甲基化等氧化修饰过程被激活，这可能直接影响最终生成知母皂苷的结构多样性与药理活性。皇秋秋等^［32］在芦笋中的研究曾综述了CYP在皂苷结构多样化中的关键作用。本研究在知母中同样观测到类似模式，提示在化感胁迫下植物可能通过激活一套从骨架构建到精细修饰的完整酶系，来合成结构更为特异或活性更强的防御性化合物。

4 结 论

本研究对国槐凋落叶浸提液处理及其相应对照组的知母根部样本，开展了转录组层面的深度分析，最终成功获取了93 227个单基因族，筛选出4 982个DEGs，进一步对DEGs展开分析，有3 322个DEGs可划分至GO数据库中的37个功能亚类，1 371个DEGs显著富集于KEGG的133条代谢通路。在萜类骨架生物合成、半萜和三萜类化合物生物合成及类固醇生物合成通路中，分别检测到17，3和17个DEGs，其中萜类骨架生物合成途径中的MVK、ISPS、IDI、HMGCS、HMGCR、FDPS、ACAT均呈现上调表达，半萜和三萜类化合物生物合成途径中FDFT1、SQLE均上调表达，类固醇生物合成途径中SMO2、SMO1、3BETAHSDD、CYP710A、CYP51、CP11、CAS1、FDFT1、EBP、SC5DL、TM7SF2、DHCR7均上调表达。本研究系统揭示了知母根部的转录组特征，并基于所识别DEGs初步推断其萜类骨架及类固醇生物合成过程的潜在调控路径。

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基金资助

国家林业和草原局项目(DNA-2021)

北京市园林绿化局项目(2021-STBHXFC-04-11)

榆林市榆阳区林业局项目(2024X-HFW049)

榆林市榆阳区林业局项目(2024XHFW059)