连作早期土壤酸化-养分活化对缬草根际微生物群落的影响

Effects of soil acidification‐nutrient activation on rhizosphere microbial community during early stage of continuous cropping of Valeriana officinalis L.

摘要

目的 阐明连作早期缬草根际微生态失衡机制，为缬草连作障碍的早期防控提供理论依据。 方法 以贵州省铜仁市江口县黄柏山村中药材种植基地缬草连作土壤为研究对象，采用Illumina MiSeq高通量测序技术分析了连作早期（1~2年）缬草根际土壤微生物群落多样性、群落结构及其与理化性质的互作关系。 结果 缬草短期连作诱发了“土壤酸化-养分活化”耦合效应：连作土壤pH值较未连作土壤显著降低0.8~0.9个单位，碱解氮、有效磷和速效钾含量分别较未连作土壤显著增加16.24%~30.78%，122.10%~197.84%和20.87%~207.42%。土壤微生物群落发生明显重构，细菌群落中的芽单胞菌属（Gemmatimonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Candidatus_Solibacter等耐酸及特化类群明显富集，而Vicinamibacteraceae、Ellin6067和罗库菌属（Rokubacteriales）等基础生态功能类群则受到抑制；真菌群落中的镰刀菌属（Fusarium）、炭疽菌属（Colletotrichum）、拟壳多孢属（Stagonosporopsis）等病原菌相对丰度上升，青霉菌属（Penicillium）与圆孢霉属（Staphylotrichum）等有益菌相对丰度则显著下降。分子生态网络分析表明，连作使缬草根际土壤细菌网络结构复杂化，而使真菌网络简单化，降低了微生态系统的稳定性。冗余分析表明，土壤碱解氮（解释率94.52%）和有效磷（77.03%）含量是驱动细菌群落结构变化的关键因子，而真菌群落则受pH（87.39%）、速效钾（96.17%）、有效磷（90.42%）、全钾（90.07%）和碱解氮（86.26%）含量等多因子协同调控。 结论 “土壤酸化-养分活化”耦合效应驱动的根际微生态失衡是缬草早期连作障碍形成的主要原因。

Abstract

Objective The sustainable cultivation of Valeriana officinalis L. is limited by the severe cha-llenges associated with continuous cropping.Therefore，understanding the early-stage rhizosphere microecological dysbiosis is critical for developing effective control strategies. Method This study investigated the early-stage （1-2 years） effects of continuous cropping of V.officinalis L.in a medicinal herb planting base in Tong-ren City，Guizhou Province.Using Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology，the diversity and structure of the rhizosphere soil microbial community，as well as their interactions with soil physicochemical properties were analyzed. Result Short-term continuous cropping of V.officinalis L.induced a coupled effect of “soil acidification-nutrient activation”.The soil pH significantly decreased by 0.8-0.9 units compared to that of non-continuously cropped soil，while the contents of alkali-hydrolyzable nitrogen，available phosphorus，and available potassium increased significantly by 16.24%-30.78%，122.10%-197.84%，and 20.87%- 207.42%，respectively.In bacterial communities，acid-tolerant and specialized taxa including Gemmatimonas，Sphingomonas，and Candidatus_Solibacter were significantly enriched.In contrast，key functional groups，inclu-ding Vicinamibacteraceae，Ellin6067，and Rokubacteriales were suppressed.Within the fungal community，a marked increase in the relative abundance of pathogenic genera，including Fusarium，Colletotrichum，and Stagonosporopsis，and a significant decline in beneficial fungi including Penicillium and Staphylotrichum were abserved.Molecular ecological network analysis revealed that continuous cropping complicated bacterial network structures while simplifying fungal network，thereby reducing the stability of the microbial ecosystem.Redundancy analysis revealed that soil alkali-hydrolyzable nitrogen （explaining 94.52% of the variance） and available phosphorus （77.03%） were the primary determinants of bacterial community structure.By contrast，the fungal community was co-regulated by several factors，including pH （87.39%），available potassium （96.17%），avai-lable phosphorus （90.42%），total potassium （90.07%） and alkali-hydrolyzable nitrogen （86.26%）. Conclusion The primary mechanism underlying obstacles in the early stage of continuous cropping of V.officinalis L.is the rhizospheric micro-ecological dysbiosis driven by the coupled effect of “soil acidification-nutrient activation” .

Graphical abstract

关键词

缬草 / 连作障碍 / 根际土壤 / 根际微生物 / 土壤酸化 / 养分活化

Key words

Valeriana officinalis L. / continuous cropping obstacle / rhizosphere soil / rhizosphere microorganisms / soil acidification / nutrient activation

缬草（Valeriana officinalis L.）是中国传统珍稀药用植物，因其具有显著的镇静安神活性而备受关注，是现代天然药物开发的重要资源^［1］。贵州省依托优越的自然地理条件，已成为中国缬草的核心产区，其规模化种植对推动区域特色农业发展与乡村振兴具有重要战略意义^［2］。然而，与多数根茎类药用植物类似，缬草产业可持续发展面临连作障碍的严峻挑战。本课题组前期实地调研发现，缬草连作障碍具有“发生早、危害重”的典型特征，连续种植2年会大量减产，其根系产量较首茬下降70%~80%，且药用活性成分含量与商品品质显著劣化。为维持产出，产区普遍采取增施化肥或更换土地的策略，然而前者易加剧土壤生态退化，后者则受限于耕地资源而难以常态化实施。因此，连作障碍已成为制约该产业高质量发展的关键瓶颈，亟需从机理层面系统解析其形成机制。

连作障碍本质上是土壤生态系统在单一作物持续选择压力下的综合性功能衰退^［3］，而土壤微生物作为系统功能的核心执行者，其群落结构失衡是驱动这一衰退过程的关键^［4］。近年来，高通量测序技术的发展为从微生态角度解析连作障碍机制提供了有力支撑^［5］。有研究表明，连作会显著改变根际微生物群落结构与功能^［6-7］。如：西洋参连作（2，4和6年）会通过改变土壤pH值、养分含量及盐分含量来影响土壤细菌和真菌多样性，最终导致微生物群落功能失调^［8］；党参连作（1~4年）会通过增加罗兹菌门（Rozellomycota）潜在致病菌的相对丰度来促进寄主-病原菌互作，进而诱发连作障碍^［9］；西瓜连作（2和6年）病害的发生则与有益菌（如芽孢杆菌属Bacillus、剑菌属Ensifer和鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas）丰度的减少及病原菌（如镰刀菌属Fusarium）丰度的增加密切相关^［10］。以上研究结果虽然揭示了连作障碍发生的部分微生物学机制，但由于植物-土壤互作系统具有显著的物种特异性，导致不同作物系统中连作障碍的微生态机制存在明显差异^［11］。同时，现有研究多聚焦于中长期连作系统（2~6年），但对障碍发生初期的微生态响应机制认知严重不足。而缬草短期连作（1~2年）内即出现植株长势衰退、产量与品质急剧下降的独特现象，这为解析连作障碍的“早期预警信号”与“初始形成机制”提供了理想研究系统，且目前关于缬草连作障碍微生态机制的研究鲜见报道，尤其缺乏对障碍发生初期微生物群落动态演替过程的系统解析。

基于此，本研究聚焦于缬草连作障碍发生的关键初期阶段（1~2年），通过对不同连作年限缬草根际土壤的系统性分析，阐明短期连作对土壤理化性质及微生物群落结构与多样性的影响，将从微生态视角揭示缬草连作障碍的早期形成机制，以期为该障碍的早期诊断、生态预警及绿色防控提供理论基础和实践依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区域位于贵州省铜仁市江口县黄柏山村中药材种植基地（108°50′ E， 27°41′ N），该地区以山地丘陵为主，年平均气温18.2 ℃，年均日照时数为1 350 h，年均降水量1 369.6 mm，海拔700~1 000 m，无霜期为295 d，属于亚热带湿润季风气候地区。由于毗邻梵净山，当地形成了独特的微气候环境，适宜缬草种植。当地缬草种植遵循一年一收的农作模式，一般于每年5月上旬采种，下旬育苗，当年12月至次年1月进行缬草移栽，在移栽前施用复合肥700 kg/hm²（由贵州西洋实业有限公司提供，其中N∶P₂O₅∶K₂O=15∶15∶15，总养分≥45%）。当缬草进入萌芽期时，使用上述品种复合肥进行追肥（施用量为600 kg/hm²），其他管理措施按照常规进行。供试缬草品种为宽叶缬草（Valeriana officinalis L.var.latifolia Miq.）。

1.2 土壤样品采集

于缬草采收期，采集研究区连作1年和2年地块的缬草根际土壤样品，同时以研究区未种植过缬草的地块土壤为对照（CK）。在每块样地中随机设置3个采样点，相邻样点间距为10 m，每个采样点设置3 m×3 m的样方，每个样方内随机选取5株长势一致的植株，小心挖掘根系，采用抖根法^［12］分别收集5样株紧贴根表（<2 mm）的根际土壤；随后，将同一样方内的5份根际土壤混合均匀，构成1个代表该样方的根际土壤样品，每块样地共获得3个根际土壤样品，研究区共收集9个根际土壤样品；将土壤样品装入密封袋，一部分保存于-80 ℃冰箱中用于土壤微生物分析，一份自然风干，用于土壤理化性质测定。

1.3 土壤理化指标测定

土壤pH及有机质（SOM）、全氮（TN）、全磷（TP）、全钾（TK）、碱解氮（AN）、有效磷（AP）和速效钾（AK）含量参照鲍士旦^［13］的方法进行测定。

1.4 土壤微生物多样性测定

准确称取0.2 g根际土壤样品，加入到盛有提取裂解液的离心管中进行研磨处理。研磨完成的土样采用FastDNASpinKit（MP Biomedicals，CA，USA）试剂盒提取土壤样品中的总DNA。使用细菌特异性引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGC-AGCA-3'）、806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌的16S rRNA基因V3-V4区域进行PCR扩增^［14］。使用真菌特异性引物ITS5（5'- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS2 （5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）对真菌ITS1区进行扩增^［15］。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测和Quant-It PicoGreen dsDNA Assay KitPCR对扩增产物最终片段进行纯化和定量，而后进行高通量测序。采用DADA2对高通量测序获得的原始数据进行质控、过滤、拼接和去除嵌合体等步骤，然后采用100%相似度聚类^［16］，并基于Silva138和Unite9数据库分别对细菌和真菌进行物种注释。以上过程委托上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

1.5 数据处理

利用Excel 2019和SPSS 27.0对数据进行统计分析， 采用单因素方差分析和多重比较进行差异显著性分析。基于非度量多维标度（NMDS）和PERMANOVA分析评估不同连作年限土壤微生物群落结构组成差异；采用LEFSe分析识别不同连作年限土壤微生物的富集物种（LDA得分>4.0，P<0.05）；采用Gephi10.1绘制可视化土壤微生物生态网络图，并计算相关拓扑指数^［5］；基于vegan、psych和ggplot2包进行相关性分析和冗余分析（RDA），探讨土壤微生物群落结构和理化性质间的互作关系。

2 结果与分析

2.1 连作对缬草根际土壤理化性质的影响

由表1可知，与CK相比，缬草连作使土壤酸化，降低了土壤pH值，提高了养分含量，但对有机质含量影响不明显。同时，随着连作年限从1年增加至2年，缬草根际土壤中全磷、全钾、有效磷和速效钾含量显著提高，增幅分别为35.41%，20.21%，34.10%和154.34%；而同时其pH值、有机质和碱解氮含量则呈现下降趋势，降幅分别为2.15%，2.82%和11.11%，但均未达到显著水平。

2.2 连作对缬草根际土壤微生物多样性的影响

由图1可知，缬草根际土壤细菌和真菌Chao1指数、Observed_species指数和Shannon指数均随连作年限增加而降低，且均表现为CK>CC1>CC2，其中CC2处理与CK之间均存在显著差异；根际土壤真菌Simpson指数从高到低依次为CK>CC2>CC1，且2个连作处理均与CK存在显著差异，而土壤细菌Simpson指数则无明显变化。

图2-A显示，不同连作年限缬草根际土壤间共有细菌扩增序列变体（amplicon sequence variants，ASVs）379个，占ASVs总数的2.08%；CK、CC1和CC2处理各自独有的ASVs分别为6 669，5 253和4 583个，占比分别为36.59%，28.82%和25.14%。由图2-B可知，不同连作年限缬草根际土壤间共有真菌ASVs 43个，占ASVs总数的2.02%；CK、CC1、CC2处理各自独有的ASVs分别为785，669和497个，占比分别为36.80%，31.36%和23.30%。说明连作会减少独有的扩增序列变体数目。

由图3可知，细菌和真菌的应力值（Stress）分别为0.012 9和0.053 1，二者均小于0.2，表明分析结果可以准确反映样本间的差异程度。同一连作年限样方间表现出明显的聚集特征，不同连作年限间能明显地相互分离，说明连作年限会显著影响土壤细菌和真菌群落组成。PERMANOVA分析也发现，缬草根际土壤细菌和真菌群落组成在不同连作年限间均存在显著差异（F_细=3.079 747，P_细=0.007；F_真=6.927 777，P_真=0.003），这进一步验证了NMDS分析结果。

2.3 连作对缬草根际土壤微生物群落结构的影响

2.3.1 门水平微生物群落结构特征

由图4-A可知，缬草根际土壤细菌相对丰度居前10的门分别为变形菌门（Proteobacteria，27.74%~29.70%）、放线菌门（Actinobacteriota，13.40%~17.53%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota，9.57%~23.16%）、酸杆菌门（Acidobacteriota，9.94%~19.43%）、绿弯菌门（Chloroflexi，5.99%~9.73%）、拟杆菌门（Bacteroidota，2.52%~4.65%）、粘菌门（Myxococcota，2.77%~3.26%）、甲基肌酐菌门（Methylomirabilota，1.39%~3.46）、疣微菌门（Verrucomicrobiota，1.49%~1.87%）和髌骨菌门（Patescibacteria，0.65%~1.18%）。其中，CC2处理缬草根际土壤中变形菌门、放线菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、粘菌门和髌骨菌门的相对丰度高于CC1处理，而其酸杆菌门、绿弯菌门、甲基肌酐菌门和疣微菌门的相对丰度则低于CC1处理。与CK相比，连作会明显降低缬草根际土壤中酸杆菌门、拟杆菌门、甲基肌酐菌门和疣微菌门细菌的相对丰度，增加放线菌门、芽单胞菌门和髌骨菌门细菌的相对丰度，但对变形菌门、绿弯菌门和粘菌门细菌相对丰度的影响规律不明显。

由图4-B可知，缬草根际土壤真菌相对丰度居前10的门分别为子囊菌门（Ascomycota，59.26%~81.75%）、担子菌门（Basidiomycota，1.12%~28.83%）、被孢霉门（Mortierellomycota，1.98%~7.85%）、油壶菌门（Olpidiomycota，0.11%~8.77%）、壶菌门（Chytridiomycota，0.21%~0.25%）、Aphelidiomycota（0.02%~0.34%）、捕虫霉门（Zoopagomycota，0~0.27%）、球囊菌门（Glomeromycota，0.02%~0.17%）、罗兹菌门（0.03%~0.09%）和梳霉门（Kickxellomycota，0~0.02%）。其中，CC2处理缬草根际土壤中子囊菌门、油壶菌门、壶菌门、Aphelidiomycota和罗兹菌门的相对丰度高于CC1处理，而其担子菌门、被孢霉门、捕虫霉门、球囊菌门和梳霉门的相对丰度则低于CC1处理。与CK相比，连作会明显降低缬草根际土壤中壶菌门真菌的相对丰度，增加油壶菌门真菌的相对丰度，但对子囊菌门、担子菌门、被孢霉门、Aphelidiomycota、捕虫霉门、球囊菌门、罗兹菌门和梳霉门真菌相对丰度的影响规律不明显。

2.3.2 属水平微生物群落结构特征

由图5-A可知，缬草根际土壤细菌相对丰度居前10的属分别为芽单胞菌属（Gemmatimonas，2.63%~17.45%）、鞘氨醇单胞菌属（3.43%~7.05%）、Vicinamibacteraceae（1.02%~6.42%）、SC-I-84（1.75%~2.67%）、罗库菌属（Rokubacteriales，1.36%~3.31%）、Ellin6067（1.18%~3.11%）、KD4-96（1.10%~2.36%）、RB41（0.75%~2.46%）、Candidatus_Solibacter（0.25~2.65%）和JG30-KF-AS9（0.02%~2.70%）。其中，CC2处理缬草根际土壤中芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、Vicinamibacteraceae、Ellin6067和RB41的相对丰度高于CC1处理，而其SC-I-84、罗库菌属、KD4-96、Candidatus_Solibacter和JG30-KF-AS9的相对丰度则低于CC1处理；与CK相比，连作会明显降低缬草根际土壤中Vicinamibacteraceae、SC-I-84、 Ellin6067、罗库菌属、KD4-96和RB41细菌的相对丰度，增加芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、Candidatus_Solibacter和JG30-KF-AS9细菌的相对丰度。

图5-B显示，缬草根际土壤真菌相对丰度居前10的属分别为青霉菌属（Penicillium，6.48%~15.70%）、Saitozyma（0.52%~23.05%）、镰刀菌属（3.25%~7.49%）、Lectera（0.03%~13.91%）、拟壳多孢属（Stagonosporopsis，0.00%~12.65%）、圆孢霉属（Staphylotrichum，0.11%~9.46%）、炭疽菌属（Colletotrichum，0.01%~11.70%）、小不整球壳属（Plectosphaerella，0.08%~6.26%）、油壶菌属（Olpidium，0.01%~8.77%）和尾孢属（Cercospora，0.01%~5.15%）。其中，CC2处理缬草根际土壤中青霉菌属、镰刀菌属、拟壳多孢属、炭疽菌属和油壶菌属的相对丰度高于CC1处理，而其Saitozyma、Lectera、圆孢霉属、小不整球壳属和尾孢属的相对丰度低于CC1处理；与CK相比，连作会明显降低缬草根际土壤中青霉菌属、圆孢霉属和尾孢属真菌的相对丰度，增加Saitozyma、镰刀菌属、Lectera、拟壳多孢属、炭疽菌属、小不整球壳属和油壶菌属真菌的相对丰度。

在相对丰度前10的基础上采用LEfSe分析进一步识别不同连作年限下缬草根际土壤微生物的富集物种（即关键菌属），结果共识别出24个细菌富集物种和34个真菌富集物种（图6）。其中，CK、CC1和CC2处理缬草根际土壤中分别识别出1，15和8个细菌富集物种；在属水平上，除未辨别出的物种外，突柄微菌属（Prosthecomicrobium）在CK处理中显著富集，Candidatus_Solibacter和JG30_KF_AS9在CC1处理土壤中显著富集，芽单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属在CC2处理土壤中显著富集（图6-A）。同时，CK、CC1和CC2处理缬草根际土壤中分别识别出14，9和11个真菌富集物种；在属水平上，青霉菌属和圆孢霉属在CK处理中显著富集，Lectera和Saitozyma在CC1处理土壤中显著富集，拟壳多孢属、炭疽菌属和油壶菌属在CC2处理土壤中显著富集（图6-B）。说明不同连作年限缬草根际土壤中富集的微生物物种存在一定差异。

2.4 不同连作年限缬草根际土壤微生物生态网络分析

不同连作年限缬草根际土壤细菌和真菌的生态网络结构特征如图7与表2所示。其中，就细菌而言，CC1和CC2处理缬草根际土壤的细菌节点数、边数、平均度、网络直径、平均路径长度和正相关系数较CK均有不同程度升高，而模块化指数和负相关系数则有不同程度降低，且CC1处理相关拓扑参数的增幅（正相关系数除外）均大于CC2处理，而其正相关系数的增幅以及负相关系数的降幅则小于CC2处理。说明连作使缬草根际土壤细菌生态网络变得复杂。针对真菌而言，CC1和CC2处理缬草根际土壤的真菌节点数、网络直径、平均路径长度和负相关系数较CK均有不同程度降低，而正相关系数则有不同程度升高。说明连作使土壤真菌生态网络变得简单。与CC1处理相比，CC2处理缬草根际土壤的真菌节点数、边数、平均度和正相关系数均有不同程度降低，而其网络直径、模块化指数、平均路径长度和负相关系数则有不同程度升高，说明连作2年缬草根际土壤真菌网络结构较连作1年更脆弱。此外，结合细菌和真菌的拓扑参数发现，缬草根际土壤真菌对连作胁迫的响应比细菌更敏感。

2.5 缬草根际土壤微生物群落结构与理化性质间的关系

由表3可知，缬草根际土壤细菌Chao1、Observed_species和Shannon指数与其pH呈显著正相关，与其全磷和有效磷含量呈显著或极显著负相关；Chao1和Observed_species指数与碱解氮含量，以及Simpson指数与全钾含量均呈显著负相关。缬草根际土壤真菌Chao1、Observed_species、Shannon和Simpson指数与其pH呈极显著正相关，与有效磷含量呈显著或极显著负相关；Chao1和Observed_species指数与全磷、全钾和速效钾含量呈极显著负相关；Shannon指数与全磷和碱解氮含量呈显著或极显著负相关；Simpson指数与碱解氮含量呈极显著负相关。综合分析发现，相较于细菌多样性，连作缬草根际土壤理化性质的改变对真菌多样性的影响更为显著。

将相对丰度居前10的菌属和不同连作年限下的土壤微生物显著富集物种（属水平）作为关键菌属，采用相关性网络分析土壤微生物关键菌属与理化性质间的互作关系。由图8-A可知，就细菌而言，芽单胞菌属与全磷和有效磷含量，鞘氨醇单胞菌属与全钾、速效钾、有效磷含量，Ellin6067与pH，JG30-KF-AS9与碱解氮含量呈显著正相关（P<0.05）；芽单胞菌属与全钾和速效钾含量，Vicinamibacteraceae与pH呈极显著正相关（P<0.01）；Vicinamibacteraceae与全磷含量，SC-I-84与全磷和有效磷含量，罗库菌属与碱解氮和有效磷含量，Ellin6067与全氮和碱解氮含量，KD4-96、突柄微菌属与全磷和碱解氮含量，RB41与碱解氮含量呈显著负相关；Vicinamibacteraceae与碱解氮和有效磷含量，KD4-96、突柄微菌属与有效磷含量，Candidatus_Solibacter与碱解氮含量，突柄微菌属与pH均呈极显著负相关。

由图8-B可知，Saitozyma与碱解氮含量，拟壳多孢属与全钾和速效钾含量，炭疽菌属、小不整球壳属、油壶菌属与有效磷含量呈显著正相关；青霉菌属、圆孢霉属、尾孢属与pH，镰刀菌属与全磷、有效磷、全钾和速效钾含量，Lectera、小不整球壳属与碱解氮含量，炭疽菌属、油壶菌属与全磷、全钾、速效钾含量，尾孢属与pH均呈极显著正相关；小不整球壳属与pH，尾孢属与全磷和碱解氮含量均呈显著负相关；青霉菌属与碱解氮含量，镰刀菌属与pH，圆孢霉属与全磷、全钾、有效磷、速效钾含量，尾孢属与有效磷含量均呈极显著负相关。

基于RDA分析进一步探究不同连作年限缬草根际土壤微生物群落结构与土壤理化性质之间的关系。由图9可知，CK、CC1和CC2处理间根际土壤细菌和真菌群落形成明显的分离，表明连作对根际土壤细菌和真菌群落影响显著。其中，RDA1和RDA2分别解释了64.03%和14.48%的细菌群落变化，累计解释率为78.51%；影响土壤细菌群落分布的主要因子是碱解氮和有效磷含量，分别解释了细菌群落94.52%（P=0.001）和77.03%（P=0.016）的变化（图9-A）。RDA1和RDA2分别解释了55.48%和39.70%的真菌群落变化，累计解释率为95.18%；影响土壤真菌群落分布的主要因子是pH以及速效钾、有效磷、全钾、碱解氮含量，分别解释了真菌群落结构87.39%（P=0.018），96.17%（P=0.001），90.42%（P=0.002），90.07%（P=0.012）和86.26%（P=0.021）的变化（图9-B）。

3 讨论

3.1 缬草连作对土壤理化性质的影响

缬草连作对土壤理化性质的影响呈现出独特的“酸化-养分活化”耦合特征。该研究结果显示，短期连作（1~2年）导致土壤pH值显著降低0.8~0.9个单位，同时伴随碱解氮、有效磷和速效钾含量的显著积累，而SOM含量未发生明显变化。这一现象的形成机制可能是一个相互促进的耦合循环，而非简单的单向因果。一方面，土壤酸化（如根系分泌物、微生物产酸、生理酸性肥料等驱动）会加速土壤矿物中磷、钾等元素的释放，并影响氮的转化与固定，从而‘活化’养分^［17］；另一方面，为应对连作带来的产量压力而惯常采用的施肥管理（特别是磷钾肥），其盐分离子（如K⁺、NH₄⁺）的交换与硝化过程又会加剧土壤酸化^［13］。二者在缬草连作系统中相互交织，彼此强化，共同构成了根际微环境恶化的化学基础。值得关注的是，与其他药用植物连作系统相比，缬草连作表现出明显的特异性。其中，相较于枸杞^［6］和半夏^［18］连作系统，缬草连作导致的土壤酸化程度更为显著；而与党参^［9］连作系统相比，其“酸化-养分活化”的耦合特征更为突出。这些差异主要源于不同药用植物在根系构型、分泌物组成及根际微环境调控机制方面的特异性^［5］。综上，在缬草种植系统中，“酸化-养分活化”耦合模式可能通过双重途径影响植株生长，即一方面直接抑制根系发育，另一方面通过改变土壤养分有效性干扰其次生代谢平衡，二者的协同作用最终导致连作障碍的形成。

3.2 缬草连作对土壤微生物多样性和群落结构的影响

3.2.1 土壤微生物多样性

微生物多样性是评价土壤质量的重要生物指标，其多样性越高表明生态系统的环境越适宜微生物生长和繁殖^［19］。一般认为，连作会显著改变土壤微生物多样性，但不同作物对土壤微生物多样性的影响存在差异^［3］。何梦园等^［6］研究发现，随着枸杞连作年限的延长，土壤细菌丰富度和多样性，以及真菌丰富度均呈先增加后降低的趋势。Wang等^［20］研究表明，麻黄连作会降低土壤细菌多样性和丰富度，增加真菌多样性和丰富度。该研究发现，土壤细菌丰富度以及真菌多样性和丰富度均随着缬草连作年限的延长而降低，这主要与土壤理化性质的变化有关。相关性分析结果表明，Chao1、Observed_species和Shannon指数的变化主要与土壤pH值和养分含量的变化有关。pH值作为关键理化因子，通过影响微生物细胞膜透性与酶系统稳定性，直接调控其生理代谢活性。当土壤pH偏离微生物适宜生态位时，会通过干扰质子梯度维持和蛋白质构象等分子机制，对微生物群落产生生理胁迫，进而降低微生物群落多样性和丰富度^［21］。氮、磷、钾是土壤微生物生长繁殖所需的重要营养物质，一般来说，氮、磷、钾养分含量的提高会增加土壤微生物的多样性和丰富度^［5］，然而该研究却观察到二者呈负相关关系。这一反常现象可能源于高养分环境引发显著的生态选择效应，促使具有快速生长策略的r-对策菌群（如部分变形菌门）在资源竞争中占据优势，而生长缓慢的k-对策菌群（如部分酸杆菌门）则受到抑制，进而导致物种丰富度下降^［22］。同时，过量养分输入打破了微生物群体的代谢稳态，抑制了特定功能菌群的活性，并改变了胞外酶的分泌模式^［23］。这种养分富集效应与土壤酸化过程相互耦合，通过改变养分形态和生物有效性产生复合胁迫，进而降低了土壤真菌多样性。

3.2.2 土壤微生物群落结构

土壤微生物群落结构对生态系统的平衡起着重要作用^［24］。该研究发现，连作会显著影响土壤微生物群落结构。在门水平上，丰富度居前10的物种结合LEfSe分析结果显示，不同连作年限缬草根际土壤细菌的显著差异物种主要属于变形菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、甲基肌酐菌门，真菌的显著差异物种主要属于子囊菌门、油壶菌门和担子菌门，因此判定以上8种菌群是所采集样本的关键门类物种。与CK相比，缬草连作会明显降低酸杆菌门和甲基肌酐菌门的相对丰度，增加芽单胞菌门和油壶菌门的相对丰度。鉴于油壶菌门属于植物病原菌，可引起褐斑病^［25］、枯萎病^［26］和根肿病^［27］等多种病害，而酸杆菌门是多数植物根际的优势门，并在碳、氮、硫循环中均发挥着关键作用^［28］，甲基肌酐菌门和芽单胞菌门则具有促进植物生长、提高抗逆性及参与土壤养分循环的功能^［29-30］，因此可推测土壤有益菌相对丰度的降低及病原菌相对丰度的增加是引起缬草连作障碍的主要原因之一。值得注意的是，由于芽单胞菌门对酸性环境具有较强的抵抗能力^［31］，导致其虽属有益菌，但却在缬草连作土壤中具有较高的丰度。

在属水平上，与CK相比，具有特定环境适应策略的细菌菌属的相对丰度明显上升，如通过耐酸特性适应酸化胁迫的芽单胞菌属^［31］、凭借鞘脂代谢和固氮能力响应养分波动的鞘氨醇单胞菌属^［32］，以及能够降解复杂有机物的Candidatus_Solibacter^［33］；而承担基础生态功能的细菌菌属（如Vicinamibacteraceae^［34］、Ellin6067^［34］、罗库菌属^［35］和RB41^［36］）的丰度则明显下降。真菌群落则表现为潜在病原菌（如镰刀菌属^［5］、拟壳多孢属^［37］、炭疽菌属^［38］和小不整球壳属^［7］等）的富集和有益功能菌（如青霉菌属^［39］和圆孢霉属^［40］等）的减少。这一“功能特化类群上升、基础功能类群与有益菌下降”的变化趋势，与番茄^［41］、甘薯^［42］等多种作物连作系统中的部分报道相一致，亦与三七^［43］及丹参^［44］等药用植物连作研究结果相似，反映了连作障碍中微生物群落响应的某种共性规律；然而，该趋势亦表现出系统依赖性，如在枸杞长期连作^［6］及紫花苜蓿^［45］等其他体系中，部分上述菌属（芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属）变化方向相反，说明作物种类、连作年限及环境背景对群落重构的具体表现具有重要调节作用。从生态功能角度审视，这种群落结构的变化实质上是微生物对缬草连作所引发的“酸化-养分活化”耦合胁迫的响应与适应，即增殖的细菌类群多具备针对该胁迫环境的生理或代谢特化能力，而受抑制的类群则多关联于维持土壤基础养分循环与生态系统稳定性；真菌群落中病原菌的累积与有益菌的衰减，则直接指向土传病害风险升高和土壤自抑病能力下降。因此，缬草连作不仅改变了根际微生物的组成，更驱动了其生态功能的重构，这种结构与功能的双重失衡，很可能通过削弱土壤健康、加剧病原菌危害，共同构成了缬草连作障碍发生的关键微生态机制。

3.3 缬草连作土壤微生物群落结构的环境驱动因子

冗余分析（RDA）结果表明，缬草连作根际土壤细菌群落结构主要受碱解氮和有效磷含量驱动，而真菌群落则受pH、碱解氮、有效磷、全钾和速效钾含量等多因子协同调控。这一发现与辣椒、党参等连作系统中养分有效性主导群落变化的普遍规律相符^［5，9］，印证了氮、磷、钾等关键生命元素通过影响微生物代谢与合成驱动群落演替的核心作用^［46-47］。然而，该研究的重要进展在于发现上述因子在缬草连作早期（1~2年）即呈现出高度协同的“酸化‑养分活化”耦合特征：pH值急剧下降与速效养分含量显著上升同步发生。这种耦合环境构成了独特的生态选择压力：一方面，快速酸化直接抑制了酸敏感功能菌群（如部分酸杆菌门），并显著增强了pH对真菌群落结构的影响权重；另一方面，酸化与养分活化的同步效应，共同筛选了耐酸、嗜营养或具致病潜力的微生物类群（如芽单胞菌属、镰刀菌属）。因此，缬草连作早期根际微生物群落的重构，实质上是由 “酸化‑养分活化”耦合效应所主导的特异性环境选择所驱动。

4 结论

缬草连作早期（1~2年）通过“土壤酸化-养分活化” 的耦合效应显著改变了其根际土壤微生物群落组成。具体表现为土壤pH值显著降低0.8~0.9个单位，碱解氮、有效磷和速效钾含量则明显上升，在此环境条件下土壤细菌群落中耐酸及具特殊代谢策略的菌属（如芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属和Candidatus_Solibacter等）显著富集，而承担基础生态功能的菌属（如Vicinamibacteraceae、Ellin6067和罗库菌属等）受到抑制；真菌群落则呈现病原菌（如镰刀菌属、拟壳多孢属和炭疽菌属等）增殖与有益菌（如青霉菌属和圆孢霉属等）衰退的失衡格局。微生物分子生态网络分析进一步表明，连作使缬草根际土壤细菌网络结构复杂化，真菌网络结构简单化，显著降低了土壤生态系统的稳定性与恢复力。RDA分析证实了碱解氮和有效磷是驱动土壤细菌群落演替的关键因子，而真菌群落则受pH值及多种养分因子的综合调控。

参考文献

[1] Wang S L， Zeng Y R， Li Y N，et al.Chemical constituents from Valeriana officinalis L.var.latifolia Miq.and their chemotaxonomic significance［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2020，90：104041.

[2] 李雄.黔产宽叶缬草挥发油提取工艺及质量标准的研究 ［D］.贵阳：贵州大学，2017.

[3] Li X.Study on the extraction technology and quality standards for volatile oil from Valeriana officinalis L.var.latifolia Miq.［D］.Guiyang：Guizhou University，2017.

[4] Ma Z M， Guan Z J， Liu Q C，et al.Obstacles in continuous cro-pping：mechanisms and control measures［M］//DONALD L.Sparks.Advances in Agronomy.Amsterdam：Elsevier，2023：205-256.

[5] Haq M Z U， Yu J， Yao G L，et al.A systematic review on the continuous cropping obstacles and control strategies in medicinal plants［J］.International Journal of Molecular Sciences，2023，24（15）：12470.

[6] 陈芬，余高，王谢丰，等.土壤真菌群落结构对辣椒长期连作的响应特征［J］.环境科学，2024，45（1）：543-554.

[7] Chen F， Yu G， Wang X F，et al.Response characteristics of soil fungal community structure to long-term continuous cropping of pepper［J］.Environmental Science，2024，45（1）：543-554.

[8] 何梦园，沈聪，张俊华，等.连作对枸杞根区土壤理化性质、农药残留和微生物群落的影响［J］.环境科学，2024，45（9）：5578-5590.

[9] He M Y， Shen C， Zhang J H，et al.Effects of continuous cro-pping on the physiochemical properties，pesticide residues，and microbial community in the root zone soil of Lycium barbarum ［J］.Environmental Science，2024，45（9）：5578-5590.

[10] Yang K， Wang H L， Luo L F，et al.Effects of different soil moisture on the growth，quality，and root rot disease of organic Panax notoginseng cultivated under pine forests［J］.Journal of Environmental Management，2023，329：117069.

[11] Liu S， Wang Z Y， Niu J F，et al.Changes in physicochemical properties，enzymatic activities，and the microbial community of soil significantly influence the continuous cropping of Panax quinquefolius L.（American ginseng）［J］.Plant and Soil，2021，463（1）：427-446.

[12] Li H L， Yang Y， Lei J X，et al.Effects of continuous cropping of Codonopsis pilosula on rhizosphere soil microbial community structure and metabolomics［J］.Agronomy，2024，14（9）：2014.

[13] 郭晗玥，王东升，阮杨，等.西瓜连作根际土壤微生物群落演替特征［J］.中国农业科学，2023，56（21）：4245-4258.

[14] Guo H Y， Wang D S， Ruan Y，et al.Characteristics and succession of rhizosphere soil microbial communities in continuous cropping watermelon［J］.Scientia Agricultura Sinica，2023，56（21）：4245-4258.

[15] Zhang J F， Luo S Y， Yao Z M，et al.Effect of different types of continuous cropping on microbial communities and physicochemical properties of black soils［J］.Diversity，2022，14（11）：954.

[16] Luster J， Finlay R.Handbook of methods used in rhizosphere research［M］.Birmensdorf，Switzerland：Swiss Federal Research Institute WSL，2006：9-15.

[17] 鲍士旦.土壤农化分析［M］.3版.北京：中国农业出版社，2000.

[18] Bao S D.Soil and agricultural chemistry analysis［M］.3rd ed.Beijing：China Agriculture Press，2000.

[19] Yu Z T， García-González R， Schanbacher F L，et al.Evaluations of different hypervariable regions of archaeal 16S rRNA genes in profiling of methanogens by Archaea-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（3）：889-893.

[20] Tedersoo L， Tooming-Klunderud A， Anslan S.PacBio meta-barcoding of fungi and other eukaryotes：errors，biases and perspectives［J］.New Phytologist，2018，217（3）：1370-1385.

[21] Callahan B J， Mcmurdie P J， Rosen M J，et al.DADA2：high-resolution sample inference from Illumina amplicon data［J］.Nature Methods，2016，13（7）：581-583.

[22] Jia M， Wang X S， Zhu X Q，et al.Accumulation of coumaric acid is a key factor in tobacco continuous cropping obstacles［J］.Frontiers in Plant Science，2024，15：1477324.

[23] Zhao Y， Qin X M， Tian X P，et al.Effects of continuous cro-pping of Pinellia ternata （Thunb.）Breit.on soil physicochemical properties，enzyme activities，microbial communities and functional genes［J］.Chemical and Biological Technologies in Agriculture，2021，8（1）：43.

[24] 蒋坤莲，罗凯文，何佶弦，等.4种物料对连作烟草根际土壤细菌群落的影响［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2026，54（3）：72-80.

[25] Jiang K L， Luo K W， He J X，et al.Effects of 4 materials on bacterial communities of tobacco rhizosphere soil in continuous cropping［J］.Journal of Northwest A&F University （Natural Science Edition），2026，54（3）：72-80.

[26] Wang Y H， Hong L， Li J J，et al.Analysis of growth inhibition of continuously planted Casuarina equisetifolia in relation to characteristic soil microbial functions and nutrient cycling ［J］.Applied Soil Ecology，2024，202：105607.

[27] Zhou Z H， Wang C K， Luo Y Q.Meta-analysis of the impacts of global change factors on soil microbial diversity and functiona- lity［J］.Nature Communications，2020，11：3072.

[28] Fan Y F， Dai Z T， Xiang T，et al.Multi-trophic microbial communities drive nitrogen cycling in river ecosystems：synergistic control of hydrological regime and nutrient input［J］.Water Research，2026，289：124820.

[29] 董志颖，洪慢，胡晗静，等.过量氮输入对寡营养海水细菌群落代谢潜力的影响［J］.环境科学学报，2018，38（2）：457-466.

[30] Dong Z Y， Hong M， Hu H J，et al.Effect of excess nitrogen loading on the metabolic potential of the bacterial community in oligotrophic coastal water［J］.Acta Scientiae Circumstantiae，2018，38（2）：457-466.

[31] 杨东，陈鸿飞，游晴如，等.不同施N方式对水稻根际土壤微生物生态效应的影响［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（12）：88-94.

[32] Yang D， Chen H F， You Q R，et al.Ecological effect of diffe-rent nitrogen application modes on rhizosphere microbes in soil of rice root［J］.Journal of Northwest A&F University（Natural Science Edition），2008，36（12）：88-94.

[33] Wang Y， Li T， Li C W，et al.Differences in microbial community and metabolites in litter layer of plantation and original Korean pine forests in north temperate zone［J］.Microorganisms，2020，8（12）：2023.

[34] Schianchi N， Oufensou S， Porqueddu G，et al.First report of Olpidium virulentus，O.bornovanus，O.brassicae on cucumber in Sardinia，Italy［J］.Journal of Plant Pathology，2020，102（4）：1317.

[35] 张智浩，邓毅书，聂强，等.白菜健康株与根肿病患病株的土壤微生物群落和功能差异［J］.中国生态农业学报（中英文），2023，31（4）：530-542.

[36] Zhang Z H， Deng Y S， Nie Q，et al.Difference of soil microbial community and function between healthy and diseased cabbage plants［J］.Chinese Journal of Eco-Agriculture，2023，31（4）：530-542.

[37] 桂莎，刘芳，樊小林.碱性肥料和生防菌制剂配合施用对香蕉枯萎病的防效［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2019，47（11）：104-113.

[38] Gui S， Liu F， Fan X L.Preventing effects of combined application of alkaline fertilizer and biocontrol actinomyces agent on banana Fusarium wilt［J］.Journal of Northwest A&F University（Natural Science Edition），2019，47（11）：104-113.

[39] 樊骐瑞，郝建华，张秀娟，等.晋西北半干旱区不同灌丛土壤细菌群落特征［J］.生态学杂志，2025，44（5）：1474-1482.

[40] Fan Q R， Hao J H， Zhang X J，et al.Bacterial community cha-racteristics of different shrub soils in a semi-arid area of northwest Shanxi［J］.Chinese Journal of Ecology，2025，44（5）：1474-1482.

[41] Mujakić I， Piwosz K， Koblížek M.Phylum gemmatimonadota and its role in the environment［J］.Microorganisms，2022，10（1）：151.

[42] Li Y T， Gao Y， Chen W，et al.Shifts in bacterial diversity，interactions and microbial elemental cycling genes under cadmium contamination in paddy soil：implications for altered ecological function［J］.Journal of Hazardous Materials，2024，461：132544.

[43] 翟杰，杨树青，刘月，等.微生物菌肥施用下微咸水灌溉对盐碱土理化性质与细菌群落的影响［J/OL］.中国环境科学，2025：1-14.（2025-10-14）［2025-11-13］.

[44] Zhai J， Yang S Q， Liu Y，et al.Effects of irrigation with brackish-water on the physicochemical properties and bacterial community of saline-alkali soils under microbial fertilizer application［J/OL］.China Environmental Science，2025：1-14.（2025-10-14）［2025-11-13］.

[45] Challacombe J F， Eichorst S A， Hauser L，et al.Biological consequences of ancient gene acquisition and duplication in the large genome of Candidatus Solibacter usitatus Ellin6076［J］.PLoS One，2011，6（9）：e24882.

[46] Narayanasamydamodaran S， Kumar N， Zuo J E.Profiling and metabolic analysis of microorganisms in bioretention cells ve-getated with vetiver and cattail species treating nitrogen and phosphorous［J］.International Journal of Phytoremediation，2025，27（6）：861-873.

[47] Lan J C， Wang S S， Wang J X，et al.The shift of soil bacterial community after afforestation influence soil organic carbon and aggregate stability in Karst region［J］.Frontiers in Microbiolo-gy，2022，13：901126.

[48] Jiang Z W， Yang S H， Pang Q Q，et al.Biochar improved soil health and mitigated greenhouse gas emission from controlled irrigation paddy field： insights into microbial diversity［J］.Journal of Cleaner Production，2021，318：128595.

[49] Mahapatra S， Rao E S， Sandeepkumar G M，et al. Stagonosporopsis cucurbitacearum the causal agent of gummy stem blight of watermelon in India［J］.Australasian Plant Disease Notes，2020，15（1）：7.

[50] Zhang R， Feng Y Y， Wu C， et al. Identification and characte-rization of Colletotrichum camelliae，the causal agent of leaf spot of Polygonatum odoratum in China［J］.Crop Protection，2025，190：107098.

[51] Xiong W， Li R， Ren Y，et al.Distinct roles for soil fungal and bacterial communities associated with the suppression of Vanilla Fusarium wilt disease［J］.Soil Biology and Biochemistry，2017，107：198-207.

[52] 刘威，孔亚帅，马可，等.不同施肥处理茶园土壤微生物群落结构及功能预测分析［J］.中国土壤与肥料，2024（8）：92-101.

[53] Liu W， Kong Y S， Ma K，et al.Prediction and analysis of soil microbial community structure and function in tea garden under different fertilization treatments［J］.Soil and Fertilizer Scie-nces in China，2024（8）：92-101.

[54] Feng C， Yi Z W， Qian W，et al.Rotations improve the diversity of rhizosphere soil bacterial communities，enzyme activities and tomato yield［J］.PloS One，2023，18（1）：e0270944.

[55] Zhang L， Liu L F， Sun D L，et al.Enrichment of phytopathogen dominated by Volutella in the rhizosphere may be an important cause of continuous crop obstacles in sweet potatoes ［J］.Land Degradation & Development，2024，35（17）：5341-5356.

[56] Liu Y Y， Bao L M， Sun W W，et al.Diversity and composition of active and total bacteria in rhizospheric soil in response to continuous crop years of Panax notoginseng ［J］.Folia Microbiologica，2024，69（4）：733-745.

[57] 黄菊英.不同连作年限丹参根际微生物多样性的研究［D］.新疆伊犁：伊犁师范大学，2023.

[58] Huang J Y.Study on microbial diversity in rhizosphere of Salvia miltiorrhiza with different continuous cropping years［D］.Yili，Xinjiang：Yili Normal University，2023.

[59] Yang Z， Xu Y X， Li H，et al.Difference of bacterial community structure in the meadow，maize，and continuous cropped alfalfa in Northeast China［J］.Frontiers in Microbiology，2022，13：794848.

[60] 沈婷婷，张琇，杨国平，等.生防菌剂对西瓜根际土壤微生物群落和尖孢镰刀菌属的影响［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2023，51（7）：115-125.

[61] Shen T T， Zhang X， Yang G P，et al.Effects of biocontrol agents on watermelon rhizosphere soil microbial community and Fusarium oxysporum f. sp［J］.Journal of Northwest A&F University（Natural Science Edition），2023，51（7）：115-125.

[62] Dincă L C， Grenni P， Onet C，et al.Fertilization and soil microbial community：a review［J］.Applied Sciences，2022，12（3）：1198. （责任编辑：裴阿卫）

基金资助

贵州省基础研究计划（自然科学）面上项目（黔科合基础-MS［2025］ 097）

贵州省高层次创新型千层次人才项目（2023-（2022）-049,2023-（2022）-046）

铜仁学院2024年研究生教育创新计划项目(trxyycjs-202405)

省级大学生创新创业训练计划项目(S2025106651084)