基于转录组与代谢组的黔产红托竹荪子实体菌裙发育机制解析

Integrated transcriptomic and metabolomic analysis on the developmental mechanism for the fruiting body indusium of Dictyophora rubrovolvata from Guizhou

摘要

目的 探究红托竹荪不同生长时期的差异表达基因和差异代谢物及其生物合成途径，为红托竹荪子实体菌裙生长发育研究奠定基础。 方法 以红托竹荪尖顶期（W5_1）、破蛋期（W5_2）和平展期（W5_3）3个生长时期的菌裙为研究材料，对红托竹荪不同生长时期的菌裙进行基因组学分析，通过差异倍数（FC）和差异显著水平（P值）筛选差异表达基因（DEGs），并对差异表达基因进行GO分析和KEGG代谢通路分析；同时对其进行代谢组学分析，通过投影重要性变量（VIP）和差异倍数（FC）筛选差异代谢物，并对差异代谢物进行KEGG代谢通路分析。 结果 转录组分析显示，红托竹荪菌裙W5_2 vs W5_1、W5_3 vs W5_1和W5_3 vs W5_2分别筛选出3 545，3 664和2 024个差异表达基因；GO富集分析显示，各比较组DEGs均注释至分子功能、细胞组成和生物过程三大功能类型；KEGG富集分析显示，各比较组DEGs分别显著富集于118，118和113条KEGG代谢通路。代谢组分析显示，W5_2 vs W5_1、W5_3 vs W5_1和W5_3 vs W5_2分别检测出151，87和87个差异代谢物，KEGG富集分析显示其分别富集于75，71和71条KEGG代谢通路。对W5_2 vs W5_1、W5_3 vs W5_1和W5_3 vs W5_2差异代谢物与DEGs共同注释的KEGG通路进行联合分析，表明3个比较组分别显著富集于硫辛酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、α-亚麻酸代谢等核心通路。 结论 硫辛酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、α-亚麻酸代谢可能是红托竹荪菌裙发育的重要调控通路，初步揭示了红托竹荪菌裙生长发育的分子调控与代谢规律，为其菌裙发育机制研究及品质调控、栽培优化奠定了理论基础。

Abstract

Objective This study aims to explore the differentially expressed genes，differential metabolites， and their biosynthetic pathways of Dictyophora rubrovolvata at different growth stages，so as to lay a theoretical foundation for research on the growth and development of the fruiting body indusium in D.rubrovolvata. Method Indusium samples of D.rubrovolvata at three key growth stages，namely the apical stage （W5_1），dehiscence stage （W5_2），and flat expansion stage （W5_3），were selected as research materials.Transcriptomic analysis was performed on these samples at different developmental stages.Differentially expressed genes （DEGs） were screened based on fold change （FC） and P-value，followed by gene ontology （GO） annotation and kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of the identified DEGs.Meanwhile，metabolomics analysis was conducted.Differential metabolites were screened based on variable importance in the projection （VIP） and FC，after which KEGG pathway enrichment analysis was further performed on these metabolites. Result Transcriptomic analysis revealed that 3 545，3 664，and 2 024 DEGs were identified in the comparison groups of W5_2 vs W5_1，W5_3 vs W5_1 and W5_3 vs W5_2，respectively.GO enrichment analysis indicated that the DEGs in each comparison group were annotated into three major functional categories：molecular function，cellular component，and biological process.KEGG enrichment analysis revealed that the DEGs of the three groups were significantly enriched in 118，118，and 113 metabolic pathways，respectively.Metabolomic analysis identified 151，87 and 87 differential metabolites in the three comparison groups，which were annotated to 75，71 and 71 KEGG pathways，respectively.A combined analysis was performed on KEGG pathways co-annotated by DEGs and differential metabolites in the three groups.The results demonstrated that the three comparison groups were significantly enriched in core pathways，including lipoic acid metabolism，starch and sucrose metabolism，and α-linolenic acid metabolism. Conclusion Lipoic acid metabolism，starch and sucrose metabolism，and α-linolenic acid metabolism may serve as crucial regulatory pathways during indusium development of D.rubrovolvata.This study preliminarily reveals the molecular regulatory and metabolic patterns underlying the growth and development of D.rubrovolvata indusium，providing a theoretical basis for further research on its development mechanism，quality regulation，and cultivation optimization.

Graphical abstract

关键词

红托竹荪 / 菌裙 / 差异表达基因 / 差异代谢物 / 发育机制

Key words

Dictyophora rubrovolvata / indusium / differentially expressed genes / differential metabolites / developmental mechanism

红托竹荪（Dictyophora rubrovolvata）隶属于鬼笔科竹荪属^［1］，是贵州特有珍稀主栽食用菌。2019年，红托竹荪产业被纳入贵州十二大特色生态产业，现已成为推动林下经济转型、农户收入增加和乡村产业振兴的主要经济作物。红托竹荪子实体由菌盖、菌柄与菌裙三部分构成，其标志性的独特菌裙结构，使其被冠以“雪裙仙菇”、“菌中皇后”和“小仙姑”等美誉^［2-3］。该菌类兼具丰富的营养组分与显著的功能活性物质^［4-14］，现已成为高端餐饮市场中极具溢价潜力的核心商品。然而，红托竹荪菌裙的优质品率尚不稳定，商品分级缺乏科学依据，这已成为制约产业规模化、标准化发展的“瓶颈”。

目前对于红托竹荪的研究主要集中在栽培技术、病虫害防护和营养成分与功能活性三大领域。巩玉辉等^［15］分析了不同树种木屑营养成分对红托竹荪生长发育的影响；曹立倩等^［16］从染病红托竹荪组织中分离纯化鉴定出致病菌为半球状毛霉菌，命名为htzs-7，并发现98%苯醚甲环唑TC+99%四霉素TC按体积比1∶6组合具有增效作用，增效系数（SR）为1.83；营养活性方面，周娟娟等^［17］证实红托竹荪含多糖、黄酮等成分，具抗氧化等功能；董慧等^［18］采用营养成分精准定量方法^［19］分析了红托竹荪的34种营养成分，为营养价值评价提供了依据。目前关于其子实体发育的研究尚不多见，针对其子实体菌裙生长发育的系统性研究尚未见报道。菌裙作为红托竹荪核心商品性状，研究深度亟待提升，通过对其菌裙进行分子水平的系统性解析，明确其特异性调控路径，以及菌裙全程发育的基因调控网络与代谢物的动态变化，对完善红托竹荪研究体系、支撑产业发展意义重大。本研究以红托竹荪菌裙为对象，选取尖顶期（W5_1）、破蛋期（W5_2）和平展期（W5_3）3个生长时期的菌裙样本，采用转录组与代谢组联合测序技术，分析不同生长时期差异表达基因和差异代谢物的代谢通路，探究红托竹荪子实体菌裙生长发育过程的调控机制，以期为优化栽培条件、筛选优质菌株、建立分子辅助育种体系为助力红托竹荪产业的高质量发展提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试红托竹荪菌株来自贵州省农作物品种资源研究所。分别在红托竹荪尖顶期（W5_1）、破蛋期（W5_2）和平展期（W5_3）3个生长时期（图1）各选取5株红托竹荪，每株取3~5片菌裙样本。将样品放入液氮速冻后于-80 ℃超低温冰箱保存，送至美吉生物（上海）进行转录组和代谢组测定。

1.2 RNA提取、文库构建及测序

采用乙醇沉淀法和十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法进行红托竹荪菌裙RNA的提取，通过琼脂糖凝胶电泳、超微量紫外可见分光光度计（德国茵普恩公司）鉴定RNA样品合格性。将合格样品送至美吉生物（上海）进行cDNA文库的构建，并利用Illumina HiSeq 4000高通量测序平台（美国因美纳公司）进行测序。

1.3 转录组测序及差异表达基因分析

将3个生长时期的红托竹荪菌裙样本分别分为5个生物学重复，送往美吉生物（上海）进行转录组测序与分析。以课题组前期构建的红托竹荪菌株基因图谱作为参考基因组，加入打断试剂使RNA片段化，逆转录合成cDNA，经末端修复、加A尾和接头、扩增DNA文库及质量检测等步骤后，使用Illumina测序仪进行测序。去除原始数据（raw reads）中的不合格序列，获得高质量序列（clean reads）并将其与参考基因组进行比对，使用FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）法计算基因表达量。将样品间表达水平变化的差异倍数（fold change，FC）≥2且差异显著水平值（P值）<0.05的基因认定为差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），对其进行GO（gene ontology）功能聚类分析和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

1.4 代谢组检测与分析

将3个生长时期的红托竹荪菌裙样本分别分为5个生物学重复，送往美吉生物（上海）进行代谢组检测与分析。精确称取样品55 mg于2 mL离心管中，加入1颗直径为6 mm的研磨珠，于冷冻组织研磨仪（-10 ℃，50 Hz）中研磨6 min；加入含内标（0.02 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸）的400 μL提取液（V（甲醇）：V（水）=4∶1），低温超声（5 ℃，40 kHz）提取30 min；然后将样品于-20 ℃静置30 min后，4 ℃、13 000 g离心15 min，移取上清液至带有内插管的进样小瓶中待上机分析。取3 μL上清液经HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）分离后，再进行质谱检测。色谱检测条件：流动相A为95%水+5%乙腈（含质量分数0.1%甲酸），流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水（含质量分数0.1%甲酸）。流速为0.40 mL/min，柱温为40 ℃。质谱检测条件：质谱信号采集采用正负离子扫描模式，质量扫描范围（m/z）：70~1 050；离子喷雾时的正离子电压为3 500 V，负离子电压为-3 500 V，鞘气344.75 kPa，辅助加热气压89.64 kPa，离子源加热温度425 ℃，循环碰撞能20 V→40 V→60 V。上机完成之后，将超高效液相色谱-质谱联用仪（ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS）原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI （Waters Corporation，Milford，USA），进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵，同时将一级质谱（mass spectrometry，MS）和二级质谱（tandem mass spectrometry，MSMS）质谱信息与代谢公共数据库HMDB（http：//www.hmdb.ca/）和Metlin（https：//metlin.scripps.edu/）以及美吉自建库进行匹配，得到代谢物信息。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）揭示不同组别代谢模式的差异，以投影重要性变量（variable importance in the projection，VIP）≥1且差异倍数（fold change，FC）≥1为标准，筛选差异代谢物（differential metabolites，DMs），对DMs进行KEGG代谢通路分析。

2 结果与分析

2.1 转录组分析

2.1.1 转录组测序数据质控分析

转录组分析共15个样本，包括红托竹荪尖顶期、破蛋期和平展期3个时期各5个样本的转录组测序结果如表1所示。

由表1可知，从15个样本获得40 387 002~49 646 298条原始序列（raw reads），经过滤后得到40 085 570~49 191 150条高质量序列（clean reads）；Q20均大于等于98.89%，Q30均大于等于96.33%，GC含量为46.70%~47.02%。综上可知，所有样本数据量充足，测序质量合格，GC含量分布正常，可用于后续的生物信息学分析。

同时对红托竹荪菌裙总样本转录组进行PCA分析，结果（图2）显示3个样本有明显分离，证明试验结果稳定可靠。

2.1.2 差异表达基因筛选

以差异倍数（fold change，FC）≥2且差异显著水平（P值）<0.05为标准，分别对W5_2 vs W5_1、W5_3 vs W5_1和W5_3 vs W5_2的差异表达基因（DEGs）进行筛选，结果（图3）表明，W5_2 vs W5_1共鉴定筛选出3 545个DEGs，其中1 693个上调，1 852个下调；W5_3 vs W5_1共鉴定筛选出3 664个DEGs，其中1 656个上调，2 008个下调；W5_3 vs W5_2共鉴定筛选出2 024个DEGs，其中902个上调，1 122个下调。

2.1.3 差异表达基因的富集分析

（1）GO富集分析。为了研究红托竹荪菌裙生长相关差异基因的生物学功能，对不同比较组的差异基因进行GO富集分析，其中部分结果如表2所示。表2表明，在W5_2 vs W5_1中有2 504个DEGs被注释，这些DEGs在生物过程（biological process，BP）中注释到58个类别上，大多数富集在有机氮化合物代谢过程、生物合成过程、有机物质生物合成过程、细胞生物合成过程、小分子代谢过程和蛋白质代谢过程等；在分子功能（molecular function，MF）中被注释到28个类别上，大多数富集在催化活性、氧化还原酶活性和转运蛋白活性等；在细胞组成（cellular component，CC）中被注释到4个类别上，分别是膜、核糖体、核糖体亚基和大核糖体亚基。在W5_3 vs W5_1中有2 561个DEGs被注释，这些DEGs在生物过程中被注释到26个类别上，大多数富集在有机氮化合物代谢过程、生物合成过程、有机物质生物合成过程、细胞生物合成过程、小分子代谢过程和蛋白质代谢过程等；在分子功能中被注释到22个类别上，大多数富集在催化活性、氧化还原酶活性和转运蛋白活性等；在细胞组成中被注释到4个类别上，分别是膜、核糖体、核糖体亚基和大核糖体亚基。在W5_3 vs W5_2中有1 376个DEGs被注释，这些DEGs在生物过程中被注释到39个类别上，大多数富集在小分子代谢过程、氧化酸代谢过程、有机酸代谢过程、羧酸代谢过程和有机物质分解过程等；在分子功能中被注释到14个类别上，大多数富集在催化活性、氧化还原酶活性和血红素结合等；在细胞组成中被注释到2个类别上，分别为转录因子TFIIF复合体和细胞质大核糖体亚基。

表2　红托竹荪菌裙3个生长时期差异基因的部分GO功能注释

Table 2　Partial GO functional annotation of DEGs in the indusium of D.rubrovolvata at three growth stages

分子功能

Molecular

function

W5_2 vs W5_1

（2）KEGG富集分析。对W5_2 vs W5_1、W5_3 vs W5_1和W5_3 vs W5_2的DEGs进行KEGG功能注释和富集分析，结果如图4所示。由图4-A可知，W5_2 vs W5_1共有1 638个DEGs被注释到118个代谢途径中，其中在核糖体、精氨酸生物合成、硫辛酸代谢和类固醇生物合成通路富集程度较高，且上述通路及谷胱甘肽代谢富集显著性均较高；在基因数量上，核糖体、谷胱甘肽代谢、精氨酸生物合成通路分别富集68，23和14个差异基因。

图4-B显示，W5_3 vs W5_1共有1 654个DEGs被注释到118个代谢途径中，其中在精氨酸生物合成、硫代谢、果糖和甘露糖代谢及氨基糖和核苷酸糖代谢通路的富集程度较高；在核糖体、氨基糖和核苷酸糖代谢、果糖和甘露糖代谢、硫代谢、淀粉和蔗糖代谢及精氨酸生物合成富集显著性较高；在差异表达基因富集数量方面，核糖体通路、氨基糖和核苷酸糖代谢通路、果糖和甘露糖代谢通路分别富集了67，35和19个差异表达基因。

图4-C表明，W5_3 vs W5_2共有874个DEGs被注释到113个代谢途径中，其中不饱和脂肪酸生物合成、卟啉代谢及酪氨酸代谢通路富集程度较高，且上述通路与丙酮酸代谢通路富集显著性较高；丙酮酸代谢、过氧化物酶体及脂肪酸降解通路富集的差异基因数量位列前三，分别为19，18和16个。

综上可知，红托竹荪菌裙不同发育阶段差异表达基因的KEGG富集特征既有共性又存在特异性。各比较组差异基因均广泛参与氨基酸合成、糖代谢及次生代谢等通路，其中精氨酸生物合成在多组中显著富集，核糖体通路在早期发育对比中富集基因数量最多，是调控菌裙初始生长的关键途径，随着菌裙持续发育，差异基因富集通路逐步转向糖类代谢、脂肪酸合成与脂质代谢、丙酮酸代谢及过氧化物酶体相关途径，反映在菌裙成熟过程中碳代谢、脂类合成与物质能量代谢调控模式发生动态转变，这为红托竹荪菌裙形态建成与生理代谢分化提供了分子层面的调控依据。

2.2 代谢组分析

2.2.1 差异代谢物分析

对3个发育时期的红托竹荪菌裙代谢物进行PCA分析，结果（图5）显示，3个样本之间有明显分离，表明试验结果稳定可靠。

为探究红托竹荪菌裙的生长发育情况，利用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）法进行非靶向代谢组学分析。结果（图6）显示，共检测鉴定出1 513种代谢物，包括404种脂质和类脂质分子，374种有机酸及其衍生物，216种有机杂环化合物和177种有机氧化合物等物质。

以投影重要性变量（VIP）≥1，且差异倍数（FC）≥1为标准，对W5_2 vs W5_1、W5_3 vs W5_1和W5_3 vs W5_2的差异代谢物进行筛选，结果（图7）显示，W5_2 vs W5_1中共鉴定筛选出740个差异代谢物，其中363个上调，377个下调；对差异代谢物进行的分类结果表明，其中主要包括脂质和类脂质分子、有机酸及其衍生物、杂环有机化合物、有机氧化合物、苯衍生物、核苷和核苷酸及其类似物、苯丙素和聚酮类化合物、有机氮化合物、生物碱及其衍生物、有机磷化合物和有机硫化合物等。同样地，在W5_3 vs W5_1中共鉴定筛选出732个差异代谢物，其中535个上调，197个下调；对差异代谢物进行分类表明，其中主要包括脂质和类脂质分子、有机酸及其衍生物、有机氧化合物、有机杂环化合物、核苷和核苷酸及其类似物、苯衍生物、苯丙素和聚酮类化合物、有机氮化合物、木脂素和新木脂素及相关化合物、有机硫化合物、生物碱及其衍生物、均质非金属化合物和有机磷化合物等。在W5_3 vs W5_2中共鉴定筛选出686个差异代谢物，其中525个上调，161个下调；对差异代谢物进行分类，其中主要包括有机酸及其衍生物、脂质和类脂质分子、有机杂环化合物、有机氧化合物、苯类化合物、核苷和核苷酸及其类似物、苯丙素类和聚酮类化合物、有机氮化合物、木脂素和新木脂素及相关化合物和生物碱及其衍生物等。

2.2.2 差异代谢物KEGG分析

对红托竹荪菌裙代谢组W5_2 vs W5_1、W5_3 vs W5_1和W5_3 vs W5_2的差异代谢物进行KEGG富集分析，结果如图8所示。由图8-A可知，W5_2 vs W5_1中有151个差异代谢物被注释到75条代谢通路上，排名前20的显著富集代谢通路为精氨酸生物合成、氧化磷酸化、核苷酸代谢及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等，其富集程度较高，且在核苷酸代谢、嘌呤代谢、苯丙氨酸代谢及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢与ABC转运蛋白等通路的富集显著性较高。在差异代谢物富集数量方面，嘌呤代谢、ABC转运蛋白和核苷酸代谢通路上分别富集了17，15和14个差异代谢物。

图8-B显示，W5_3 vs W5_1中有87个差异代谢物被注释到71条代谢通路上，排名前20的显著富集代谢通路为氧化磷酸化、核苷酸代谢及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢与柠檬酸循环（TCA循环）等，其富集程度较高，且在嘌呤代谢、核苷酸代谢及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢与氧化磷酸化等通路的富集显著性较高。在差异代谢物富集数量方面，嘌呤代谢、辅助因子的生物合成和核苷酸代谢通路上分别富集了17，16和13个差异代谢物。

图8-C表明，W5_3 vs W5_2中有87个差异代谢物被注释到71条代谢通路上，排名前20的显著富集代谢通路为嘌呤代谢、核苷酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、α-亚麻酸代谢等，其富集程度较高，且在嘌呤代谢、核苷酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、α-亚麻酸代谢和戊糖磷酸途径等通路的富集显著性较高。在差异代谢物富集数量方面，嘌呤代谢、辅助因子的生物合成和核苷酸代谢通路上分别富集了14，13和9个差异代谢物。

综上，红托竹荪菌裙不同比较组的差异代谢物KEGG富集结果存在明显共性与差异。各比较组差异代谢物均主要富集于嘌呤代谢、核苷酸代谢及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等核心通路，说明菌裙发育过程中氨基酸代谢、核苷酸代谢及能量代谢途径被广泛调控；同时，不同发育阶段的特有富集通路（氧化磷酸化、TCA循环、淀粉蔗糖代谢、α-亚麻酸代谢等）存在分化，说明随着菌裙生长成熟，其能量供应、碳水化合物代谢及脂质代谢途径发生阶段性的特异性调整，并共同参与红托竹荪菌裙的生长发育调控。

2.3 转录组和代谢组联合分析

为了更好地了解红托竹荪菌裙生长发育的分子机制，对W5_2 vs W5_1、W5_3 vs W5_1和W5_3 vs W5_2的差异代谢物和差异表达基因共同注释富集的KEGG通路进行联合分析，结果如图9所示。图9-A显示，W5_2 vs W5_1的差异代谢物和差异表达基因共同注释富集的KEGG通路为硫辛酸代谢和精氨酸生物合成；图9-B显示，W5_3 vs W5_1的差异代谢物和差异表达基因共同注释富集的KEGG通路为淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢及精氨酸生物合成；图9-C显示，W5_3 vs W5_2的差异代谢物和差异表达基因共同注释富集的KEGG通路为α-亚麻酸代谢与泛酸和CoA生物合成。由此可知，上述这些信号通路可能在红托竹荪菌裙生长发育过程中发挥着重要作用。

3 讨 论

红托竹荪菌裙的形态、质地和持久性是影响其商品等级和经济价值的核心指标，目前对食用菌生长发育调控的研究多集中在金针菇和香菇等比较大众的食用菌上^［20-23］，关于红托竹荪菌裙的发育研究尚比较少见。本研究以红托竹荪菌裙尖顶期、破蛋期和平展期的菌裙样本为对象，进行了转录组和代谢组分析。转录组分析结果显示，红托竹荪菌裙3个发育阶段的测序数据质量优异（Q20≥98.89%，Q30≥96.33%），样本聚类分离显著，确保了后续分析的可靠性。红托竹荪菌裙不同发育阶段间存在大量的差异表达基因（DEGs），其中破蛋期vs尖顶期（3 545个）和平展期vs尖顶期（3 664个）的DEGs数量明显高于平展期vs破蛋期（2 024个），表明红托竹荪菌裙从尖顶期到破蛋期的转录调控更为活跃，这与破蛋期菌裙突破菌蛋束缚、启动快速伸长的生理过程高度契合。GO富集分析显示，DEGs在生物过程中主要富集于有机氮化合物代谢、生物合成、小分子代谢等通路，分子功能上集中于催化活性、氧化还原酶活性，提示菌裙发育过程中伴随着物质合成与代谢的转换。KEGG富集结果表明，核糖体通路的DEGs多上调表达且在破蛋期vs尖顶期、平展期vs尖顶期均显著富集。核糖体作为蛋白质合成的核心场所，其活跃表达可为菌裙快速生长提供充足的结构蛋白和功能酶，这与香菇（Lentinus edodes）^［24］、杏鲍菇（Pleurotus eryngii）^［25］等食用菌子实体发育过程中蛋白质合成需求激增的规律一致。精氨酸生物合成通路在两组比较中也均有显著富集，精氨酸作为重要的含氮化合物，不仅参与蛋白质合成，还可能通过调节氮代谢平衡影响菌裙的结构形成，这与双孢蘑菇（Agaricus bisporus）^［26-27］发育中氮代谢关键基因的调控作用相符。此外，硫辛酸代谢、类固醇生物合成（破蛋期vs尖顶期）及淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷糖代谢（平展期vs尖顶期）的特异性富集，暗示菌裙发育不同阶段存在差异化的转录调控策略，即破蛋期可能通过类固醇调控促进从营养生长向子实体分化转变，这与蛹虫草（Cordyceps militaris）子实体分化中类固醇代谢的调控作用^［28］相似；平展期则通过碳水化合物代谢优化细胞壁组分，支撑菌裙的平展与稳定生长。

对红托竹荪菌裙尖顶期、破蛋期和平展期3个生长发育时期菌裙进行代谢组分析，共鉴定出1 513种代谢物，涵盖脂质、有机酸、有机杂环化合物等多个类别，其中脂质和类脂质分子（404种）、有机酸及其衍生物（374种）占比较高，提示这两类代谢物可能在菌裙发育中扮演着关键角色。不同发育阶段间的差异代谢物（DAMs）数量均超过680个，且平展期vs尖顶期上调表达的DAMs（535个）显著多于下调表达（197个），表明菌裙发育过程中代谢物整体呈现累积趋势，尤其在平展期达到代谢活跃高峰，这与羊肚菌（Morchella esculenta）^［29］子实体成熟过程中代谢物的累积规律相似。KEGG富集分析显示，核苷酸代谢、嘌呤代谢、柠檬酸循环（TCA循环）在3个比较组中均显著富集，这些通路是生物能量代谢和物质合成的核心，其持续活跃为菌裙发育提供了充足的能量（ATP）和代谢前体，这与糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）子实体发育过程中能量代谢通路的显著变化，特别是三羧酸循环研究^［30］相似。在红托竹荪的破蛋期vs尖顶期和平展期vs尖顶期中，精氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、氧化磷酸化等通路的共同富集，与转录组结果形成呼应，进一步证实了这些通路在菌裙早期发育中的核心作用。例如，苯丙氨酸代谢参与酚类物质和木质素前体合成，可能通过强化细胞壁结构支撑菌裙的快速伸长与形态稳定，这与灵芝（Ganoderma lucidum）^［31］子实体发育中酚类物质的功能一致；α-亚麻酸代谢、亚油酸代谢等脂质相关通路的富集，与菌裙发育中大量脂质类代谢物的积累过程相一致。脂质作为细胞膜的主要成分，其动态变化可能调控红托竹荪菌裙细胞的分裂与伸长速率，这与金针菇（Flammulina filiformis）^［32］细胞伸长过程中脂质代谢的调控机制相符。

转录组与代谢组的联合分析是解析分子调控网络的关键。本研究发现，3个比较组中存在明确的“基因-代谢物”通路关联，为阐明红托竹荪菌裙发育机制提供了直接证据。破蛋期vs尖顶期中，硫辛酸代谢和精氨酸生物合成通路同时在转录组和代谢组中富集，硫辛酸作为重要的抗氧化剂，可能通过清除代谢过程中产生的活性氧，以保护菌裙细胞免受氧化损伤^［33］。而精氨酸生物合成的协同激活，可能通过氮代谢与抗氧化代谢的联动，保障菌裙突破菌蛋时的快速生长，这与香菇（Lentinus edodes）子实体发育中代谢通路的研究结果^［34］相似。在平展期vs尖顶期中，精氨酸的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷糖代谢的联合富集尤为关键。转录组中淀粉合酶（EC 2.4.1.21）、蔗糖酶（EC 3.2.1.26）等降解酶基因的上调，与代谢组中葡萄糖、果糖及N-乙酰葡糖胺等碳水化合物衍生物的累积形成呼应，提示该阶段可能通过降解淀粉和蔗糖产生单糖，进而通过氨基糖和核苷糖代谢合成细胞壁组分（如几丁质、葡聚糖），以支撑菌裙的平展与结构稳定，这与木耳（Auricularia auricula）^［35］、银耳（Tremella fuciformis）^［36］等胶质菌子实体发育中相关通路的调控模式一致。平展期vs破蛋期中，α-亚麻酸代谢及泛酸与辅酶A生物合成的联合富集，表明菌裙成熟阶段可能通过优化脂肪酸代谢和辅酶A合成，提升能量供应效率，同时调控脂质类信号分子的生成，为菌裙的平展和维持菌裙的形态持久性提供支撑，这与竹荪属其他物种如长裙竹荪（Dictyo-phora indusiata）^［37］的代谢调控特征相符。由此可见，这些信号通路在红托竹荪菌裙生长发育过程中扮演着至关重要的调控角色。

值得注意的是，精氨酸生物合成通路在破蛋期vs尖顶期和平展期vs尖顶期的转录组与代谢组中均有富集，提示其可能是菌裙早期发育的核心调控通路。精氨酸不仅是蛋白质的合成原料，还可转化为多胺（如腐胺、亚精胺），而多胺已被证实参与食用菌子实体的细胞分裂、伸长及形态建成^［37］。本研究中，在精氨酸生物合成关键基因（如N-乙酰谷氨酸synthase，EC 2.3.1.1）上调的同时，代谢组中的精氨酸及腐胺含量显著累积，推测在红托竹荪菌裙发育中，精氨酸生物合成可能通过多胺合成途径调控菌裙的生长与形态建成，但这一机制还有待后续功能验证。

在理论层面，本研究系统揭示了红托竹荪菌裙发育的转录组与代谢组动态特征，明确了核糖体通路、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢等核心调控通路，丰富了红托竹荪菌裙发育分子机制研究的内容，也为其他食用菌子实体发育的多组学研究提供了参考范式。在应用层面，本研究鉴定的差异基因和代谢物可作为红托竹荪菌裙优良性状的分子标记。此外，本研究揭示的代谢特征（如脂质、有机酸的累积规律），也为红托竹荪的营养开发和深加工提供了理论支撑。

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基金资助

贵州省科技计划项目（黔科合基础-ZK［2023］一般172）

黔农科院青年基金项目（〔2026〕11号）

贵州省农业微生物全省重点实验室项目(黔科合平台［2025］029)