VaMAP3K1对葡萄抗灰霉病的调控作用

Regulatory role of VaMAP3K1 in grapevine resistance to Botrytis cinerea

摘要

目的 研究山葡萄中响应灰霉病的MAPKKK家族成员VaMAP3K1基因在葡萄抗灰霉病中的功能，为葡萄抗病育种提供基因资源。 方法 以山葡萄‘双优’和欧洲葡萄‘马瑟兰’为材料，通过实时荧光定量PCR、亚细胞定位及瞬时转化等技术，解析VaMAP3K1在葡萄抗灰霉病应答中的功能。 结果 RNA-seq分析结果表明，在病原菌侵染条件下，VaMAP3K1及其相关基因的表达显著上调。进一步RT-qPCR证实，VaMAP3K1在接种灰霉菌的‘黑比诺’与‘双优’中的表达量均约为对照组的5倍，其变化趋势与RNA-seq结果高度一致。生物信息学分析结果表明，该基因定位于18号染色体，全长1 704 bp，编码567个氨基酸，预测其编码蛋白分子质量为61.873 ku，理论等电点为5.41。序列分析结果显示，该蛋白含有76个带负电荷的氨基酸残基（Asp+Glu）和60个带正电荷的氨基酸残基（Lys+Arg），并包含典型的S_TKc结构域。进化分析结果表明，VaMAP3K1与已报道的其他植物MAPKKK蛋白高度同源。亚细胞定位发现，VaMAP3K1蛋白主要分布于细胞核与细胞膜。通过葡萄叶片瞬时过表达体系进行功能验证，发现过表达VaMAP3K1可显著抑制侵染后灰霉菌病斑扩展；接种72 h后，野生型葡萄叶片的病斑面积约为过表达叶片的7倍。RT-qPCR检测结果显示，在接菌后0~72 h，过表达叶片中VaMAP3K1的转录水平始终显著高于野生型叶片。 结论 VaMAP3K1可增强转基因葡萄对灰霉病的抗性。

Abstract

Objective This study aims to identify the MAPKKK family member VaMAP3K1 responsive to Botrytis cinerea from Vitis amurensis transcriptomic data，thereby elucidating its regulatory function in grapevine resistance against B.cinerea and providing genetic resources for grape disease-resistant breeding. Method Using V.amurensis ‘Shuangyou’ and Vitis vinifera ‘Marselan’ as plant materials，quantitative real-time PCR （RT-qPCR），subcellular localization，and transient transformation assays were employed to characterize the function of VaMAP3K1 in grape resistance against B.cinerea. Result RNA-seq analysis revealed significantly upregulated expression of VaMAP3K1 and its related genes under pathogen infection.Subsequent RT-qPCR validation further confirmed that the expression level of VaMAP3K1 in both ‘Pinot Noir’ and ‘Shuangyou’ ino- culated with B.cinerea was approximately five-fold higher than that in the control groups，a trend highly consistent with the RNA-seq results.Bioinformatics analysis exhibited that the gene is located on chromosome 18，with a full length of 1 704 bp encoding 567 amino acids.The predicted relative molecular mass of the protein is 61.873 ku，with a theoretical isoelectric point of 5.41.Sequence analysis indicated that the protein contains 76 negatively charged residues （Asp+Glu） and 60 positively charged residues （Lys+Arg），and harbors a typical S_TKc domain.Evolutionary analysis revealed that VaMAP3K1 shares a high degree of homology with previously identified plant MAPKKK proteins.Subcellular localization demonstrated that VaMAP3K1 is predominantly distributed in the nucleus and plasma membrane.Functional validation via transient overexpression in grape leaves revealed that VaMAP3K1 overexpression significantly inhibited lesion expansion after B.cinerea infection.At 72 h post-inoculation，the lesion area in wild-type leaves was about seven times larger than that in overexpression leaves.RT-qPCR results showed that the transcriptional level of VaMAP3K1 in overexpression leaves remained consistently and significantly higher than that in wild-type leaves during 0-72 h post-inoculation. Conclusion VaMAP3K1 plays a critical role in enhancing resistance against B.cinerea in transgenic grapevine.

Graphical abstract

关键词

山葡萄 / VaMAP3K1基因 / 灰霉病 / 生物信息学分析 / 瞬时转化

Key words

Vitis amurensis / VaMAP3K1 / Botrytis cinerea / bioinformatics analysis / transient transformation

葡萄（Vitis vinifera L.）作为全球广泛栽培的果树作物之一，兼具极高的经济价值与生态效益，其果实可用于鲜食、酿酒、果汁加工及保健品生产等，在农业产业结构中占据着重要地位^［1-2］。然而，葡萄在生长期易受多种病原菌侵染，在全球范围内造成巨大的经济损失，其中灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）是主要病原体之一^［3］。目前，灰霉病的防治仍主要依赖化学药剂，但长期使用不仅易导致病原菌抗药性增强，还会引发农药残留和环境污染等问题^［4-5］。因此，挖掘植物内源抗病基因、阐明其作用机制，并借助分子育种手段培育抗病新品种，是实现产业绿色可持续发展的重要措施。

植物在进化过程中形成了多层免疫系统以应对病原菌入侵。其中，促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路是真核生物中广泛存在的信号转导途径，在植物应对各种生物和非生物胁迫、激素以及细胞分裂与发育过程中发挥着关键作用^［6-7］。该通路在植物中高度保守，通常由促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK/MAP3K/MEKK）、促分裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK/MAP2K/MKK）和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK/MPK）依次磷酸化传递信号^［8］。MAPKKK位于MAPK级联通路的上游，是连接胞外信号与下游大规模信号放大的关键枢纽^［9］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa L.）和梨（Pyrus spp.）等植物中，已证实多个MAP3K基因参与植物生长发育和对逆境的调控。拟南芥YDA（MAPKKK4）介导的MKK4/MKK5-MPK3/MPK6级联通路，调控胚胎发生与气孔发育等过程^［10］。水稻过表达OstMAPKKK5通过提升内源赤霉素水平，促进细胞扩张，从而正向调控水稻的株高和产量^［11-12］。Zhang等^［13］研究发现，PbrMAPKKK基因对梨抗黑斑病的生命过程呈正响应。在苹果MAPKKK基因中，MdRaf5的过表达降低了植株对干旱胁迫的敏感性^［14］。目前，葡萄中MAPK通路研究多集中于基因家族鉴定及下游效应，关于MAPKKK具体成员在抗灰霉病中的功能研究仍较为薄弱，其作用的分子机制尚不明确。

基于此，本研究聚焦于山葡萄中响应灰霉菌侵染的MAPK信号组分^［15］，以高抗灰霉病的山葡萄‘双优’（Vitis amurensis cv.Shuangyou）为材料进行转录组测序，鉴定得到响应灰霉菌诱导显著上调表达的MAP3K1基因，并从山葡萄中克隆该基因，分析其序列特征与表达模式，进一步通过瞬时转化验证其在葡萄抗灰霉病中的功能，旨在为葡萄抗病分子育种提供关键基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试葡萄材料为山葡萄‘双优’、欧洲葡萄‘马瑟兰’（V.vinifera cv.Marselan）、欧洲葡萄黑比诺（V.vinifera cv.Pinot Noir），均由宁夏大学农科实训基地提供。选取健康且生长状态一致的幼嫩葡萄叶片，用于灰霉菌接种处理。

亚细胞定位所用本氏烟草（Nicotiana benthamiana）于光照培养箱中培养，设置温度为24 ℃，光照周期为16 h光照/8 h黑暗。

本试验所用菌株包括大肠杆菌（DH5α）和农杆菌（GV3101），均由唯地生物技术公司提供；过表达载体pCAMBIA2300，由宁夏大学果树实验室保存；灰霉菌BC-NX01菌株，由宁夏大学果树实验室分离纯化。

1.2 VaMAP3K1基因克隆与过表达载体构建

以山葡萄‘双优’的幼嫩叶片为材料，提取总RNA逆转录为cDNA作为PCR模板。根据Ensembl Plants数据库中欧洲葡萄VvMAP3K1的基因序列，借助SnapGene 6.0.2软件设计克隆特异性引物（表1），并通过PCR扩增VaMAP3K1片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收纯化。利用SacⅠ和XbaⅠ对目的片段和pCAM-BIA 2300-GFP载体进行双酶切线性化后，利用同源重组酶将VaMAP3K1编码序列克隆至线性化pCAMBIA2300-GFP载体（该载体C端融合GFP标签）的多克隆位点，构建过表达载体pCAMBIA2300-VaMAP3K1-GFP。将过表达载体转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，对菌液进行PCR扩增，初步筛选阳性克隆。提取阳性克隆质粒进行测序，使用DNAMAN（v6.0）软件对测序结果和参考序列进行比对，以验证VaMAP3K1基因的正确性。

1.3 山葡萄VaMAP3K1的生物信息学分析

通过Expasy-ProtParam（https：//www.expasy.org/）在线平台对山葡萄VaMAP3K1蛋白的理化特性进行系统分析。借助Ensembl Plants数据库的基因组浏览器（http：//plants.ensembl.org/），对VaMAP3K1进行染色体定位及基因结构分析。采用Smart工具（https：//smart.embl.de/）预测VaMAP3K1蛋白的保守结构域。利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）网站预测VaMAP3K1亚细胞定位。基于NCBI数据库获得VaMAP3K1基因的同源氨基酸序列，并使用DNAMAN（v6.0）进行多重比较，利用MEGA 11软件，以邻接法（Neighbor-Joining）对获得的氨基酸序列进行聚类分析，构建系统进化树。

1.4 VaMAP3K1的亚细胞定位

通过冻融法将过表达载体pCAMBIA2300-VaMAP3K1-GFP与空载体pCAMBIA2300-GFP（对照）分别导入农杆菌菌株GV3101，抗生素筛选获得阳性菌株。挑取单菌落接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28 ℃、200 r/min振荡培养12~16 h，对菌液进行PCR鉴定。取菌液，在室温条件下5 000 r/min离心5 min收集菌体，调整菌液OD₆₀₀为0.6。将重悬菌液于室温、避光条件下静置2~3 h以活化农杆菌。活化后的菌液使用1 mL无菌注射器从本氏烟草叶片下表皮注射渗透。注射后的植株在24 ℃、弱光条件下培养2~3 d。使用激光共聚焦显微镜（Olympus，Leica）观察GFP荧光信号。

1.5 灰霉菌侵染下山葡萄VaMAP3K1基因的表达分析

将灰葡萄孢菌侵染感病葡萄‘黑比诺’（PN_B）和抗病葡萄‘双优’（SY_B）叶片，以蒸馏水处理为对照组（PN_M、SY_M），试验各组设置3个生物学重复。采集各组葡萄叶片样品后立即用液氮速冻，然后用干冰保存运送至武汉康测科技有限公司完成RNA提取、文库构建及转录组测序（RNA-seq）。利用FastQC软件对测序得到的原始读段开展质量评估，采用Cutadapt软件去除测序接头序列、低质量读段和含未知碱基读段。使用HISAT2软件将纯净读段比对至葡萄参考基因组，运用HTSeq-count软件定量基因表达水平。利用R语言绘制环形表达谱，用颜色梯度表征基因表达丰度，对比分析病原菌侵染条件下相关基因表达特征。

以葡萄叶片cDNA为模板，根据VaMAP3K1基因序列设计特异性引物VaMAP3K1-RT-qPCR-F/R（表1），以Actin作为内参基因（GenBank登录号：AF369524，引物为VvActin-RT-qPCR-F/R）。实时荧光定量PCR反应采用TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqⅡ试剂盒进行，具体操作步骤参考说明书。扩增曲线、熔解曲线、标准曲线均由定量PCR仪自带软件生成。基因相对表达水平利用2^－ΔΔCt 法计算，并使用IBM SPSS Statistics 26软件进行t检验，分析处理间的差异显著性。

1.6 葡萄叶片瞬时转化与抗病性分析

将pCAMBIA2300-VaMAP3K1-GFP重组质粒转入农杆菌菌株GV3101，培养至对数生长期后收集菌体，重悬成OD₆₀₀为0.6的菌液。利用真空渗透法将农杆菌菌液导入‘马瑟兰’葡萄叶片（OE VaMAP3K1组），置于22 ℃、弱光条件下培养24 h，再对叶片接种灰霉菌，观察发病情况并记录，试验以野生型葡萄叶片作为对照（WT组），每组处理叶片不少于6片^［16］。同时，参考1.5节方法，对瞬时转化叶片中VaMAP3K1的表达水平进行RT-qPCR检测。

2 结果与分析

2.1 山葡萄VaMAP3K1基因克隆与过表达载体构建

为探究VaMAP3K1在葡萄抗灰霉病中的分子机制，本研究成功构建了pCAMBIA2300-VaMAP3K1-GFP过表达载体。以山葡萄‘双优’的幼嫩叶片为材料，提取总RNA并逆转录获得cDNA，以此为模板设计特异性引物扩增VaMAP3K1基因，获得了清晰且符合预期大小的目的条带（图1-A）。

利用Sac I和Xba I内切酶对目的片段及pCAMBIA2300-GFP空载体进行双酶切，随后连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经菌液PCR初步筛选出阳性克隆（图1-B）。将阳性克隆送交至陕西艾优稷生物科技有限公司进行测序验证，结果显示，所克隆VaMAP3K1编码区（CDS）全长为1 704 bp，与参考序列一致。

2.2 山葡萄VaMAP3K1的生物信息学分析

运用Expasy-ProtParam在线工具对山葡萄VaMAP3K1蛋白质的理化特性进行预测，发现VaMAP3K1基因共编码567个氨基酸，分子式是C_{2 705}H_{4 244}N₇₆₂O₈₆₈S₁₇，分子质量为61.873 ku。理论等电点为5.41，其中带负电荷的氨基酸残基（天冬氨酸+谷氨酸）76个，带正电荷的氨基酸残基（赖氨酸+精氨酸）60个。此外，VaMAP3K1蛋白的不稳定指数为52.74。

通过对基因组数据库的检索分析，明确了VaMAP3K1蛋白的基本结构及其基因组定位。蛋白质结构域预测结果（图2-A）表明，VaMAP3K1基因编码蛋白包含一个典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域（Serine/Threonine protein kinase catalytic domain，S_TKc），位于第294至547位氨基酸区间，符合MAPKKK家族基因的保守特征。基因结构分析结果（图2-B）显示，VaMAP3K1定位于第18号染色体（Chr18）上的3 609 794-3 621 802区域，其编码区由9个外显子和8个内含子组成，呈现出典型真核生物基因的外显子-内含子交替排列结构。

为探究VaMAP3K1蛋白的功能及进化关系，将其氨基酸序列与部分已报道功能的其他植物MAPKKK蛋白进行比对。系统发育分析结果（图2-C）显示，山葡萄VaMAP3K1与欧洲葡萄VvMAPKKK1亲缘关系最近，表明该蛋白在葡萄属中具有较高的进化保守性；山葡萄VaMAP3K1与橡胶树（Hevea brasiliensis）HbMAPKKK1、木薯（Manihot esculenta）MeMAPKKK1、杧果（Mangifera indica L.）MiMAPKKK1、麻风树（Jatropha curcas L.）JcMAPKKK1、陆地棉（Gossypium hirsutum L.）GhMAPKKK1以及豇豆（Vigna unguiculata）VuMAPKKK1蛋白均表现出较高的同源性。进一步将VaMAP3K1蛋白序列与这些同源蛋白进行比对，结果（图2-D）发现其均属于MEKK亚族，均含有保守的S_TKc结构域，且共享保守特征基序GT（P/A）FWMAPEV。该结果与进化树相对应。

2.3 山葡萄VaMAP3K1的亚细胞定位

将验证正确的重组质粒通过冻融法导入农杆菌GV3101中，通过PCR鉴定获得阳性转化子（图3），保存阳性菌液。亚细胞定位预测结果显示，VaMAP3K1蛋白同时定位于细胞核和细胞膜。为验证该预测结果，本研究通过农杆菌介导的瞬时转化在烟草叶片表皮细胞中表达pCAMBIA2300-VaMAP3K1-GFP融合蛋白，并以空载体pCAMBIA2300-GFP作为对照进行激光共聚焦显微镜观察。结果（图4）显示，对照组的GFP荧光呈全细胞弥散分布，而试验组中VaMAP3K1-GFP融合蛋白在细胞核和细胞膜区域均可见，与生物信息学预测结果一致。

2.4 VaMAP3K1基因的表达模式

利用RNA-seq技术分析山葡萄叶片在灰葡萄孢菌侵染组（PN_B、SY_B）与对照组（PN_M、SY_M）中MAPK家族相关基因的表达变化。环形表达谱可视化结果（图5-A）显示，VaMAP3K1（VIT_18s0001g03960）及其他相关基因在侵染条件下均显著上调，表现为明显的红色高亮区域；而对照组中相应基因区域多呈蓝色或浅色，表明其表达水平较低或未发生显著变化。进一步通过RT-qPCR对VaMAP3K1进行单基因验证，结果表达趋势与RNA-seq高度一致：该基因在PN_B和SY_B组的相对表达量均约为对照组的5倍（图5-B）。

2.5 瞬时过表达VaMAP3K1对葡萄抗灰霉病的影响

为探究VaMAP3K1是否参与葡萄抗灰霉病的过程，将pCAMBIA2300-VaMAP3K1-GFP重组质粒通过农杆菌介导法瞬时转化‘马瑟兰’葡萄叶片，探究瞬时过表达VaMAP3K1对葡萄抗灰霉病的影响，结果如图6所示。由图6可知，转化过表达载体的叶片接种灰霉菌后，过表达VaMAP3K1的叶片灰霉病症状明显减轻，而野生型葡萄叶片感染严重（图6-A）。RT-qPCR分析结果（图6-B）显示，瞬时转化后叶片中VaMAP3K1的表达水平显著升高，表明该基因已成功在叶片中过量表达。在接菌的整个过程中，过表达VaMAP3K1的叶片病斑面积始终小于野生型；在接菌72 h时，野生型葡萄叶片的病斑面积约为过表达叶片病斑面积的7倍（图6-C），差异显著。

3 讨论

作为MAPK信号级联途径的上游组分，MAPKKK是该通路中规模最大且功能最为重要的一类MAPK蛋白激酶^［17］。在拟南芥基因组序列中，MAPKKK家族有80多个成员，数量显著多于MAPKK和MAPK。MAPKKK基因在蛋白质一级结构和结构功能域组成上表现出较大差异，除共有激酶结构域STKc_MAP3K-like外，还包含多种其他功能区域^［18］。根据其激酶结构域中特征性氨基酸基序的差异，可进一步将MAPKKK划分为MEKK、ZIK和Raf等3个亚族^［19］。这3个亚族具备其特征功能域，其中MEKK亚族多数成员包含G（T/S）Px（W/Y/F）MAPEV基序，Raf亚族以GTxx（W/Y）MAPE为典型基序，而ZIK亚族则具有保守的GTPEFMAPE（L/V）Y基序^［20］。本研究鉴定得到的VaMAP3K1基因，其编码蛋白包含一个特征性基序“GTPFWMAPEV”，具备完整的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，是典型的MEKK亚族。与ZIK和Raf亚族相比，MEKK亚族的蛋白质结构保守性明显较低，这种较高的序列多样性暗示其可能在植物的生长发育及逆境响应中承担了更为多样和重要的功能^［21］。

MAPK级联途径是真核生物中保守的信号模块，在植物免疫应答中扮演着“指挥中枢”的角色。大量研究表明，特定的MAPKKK成员在植物应对生物与非生物胁迫过程中具有核心功能。水稻Raf类MAPKKK激酶OsILA1通过抑制OsMAPKK4-OsMAPK6级联通路，介导对细菌性枯萎病的广谱抗性^［22］。苹果MdMAPKKK1可被MdBSK1磷酸化而激活，进而启动防御信号通路以增强对轮纹病的抗性^［23］。在非生物胁迫方面，Jia等^［24］发现通过VIGS技术沉默GhRaf19的棉花植株对干旱和盐胁迫的耐受性增强，表明该基因负调控干旱胁迫与盐响应；而Feng等^［25］则报道葡萄VaMAPKKK15的过表达会激活抗氧化防御及MAPK级联相关基因，从而降低植株的抗寒性。在灰霉病抗性调控中，已有研究揭示SlMAPKKK43通过磷酸化SlMKK2和SlMKK4参与番茄对该病原的防御^［26］。本研究通过亚细胞定位发现，VaMAP3K1蛋白主要分布在细胞核与细胞膜上，这与MAPK级联途径的信号转导模式一致，即信号从细胞膜受体感知后，经过胞质最终传递至细胞核，调控基因表达。功能分析进一步证实，转基因葡萄叶片在灰霉病菌侵染后，病斑扩展受到显著抑制，病斑面积明显减小。这些结果表明，VaMAP3K1在葡萄中作为正调控因子参与了抗灰霉病的免疫反应。根据植物中最保守的免疫相关MAPK通路模型，VaMAP3K1可能磷酸化并激活下游的MAPKK蛋白，进而传递至MAPK。在拟南芥和番茄中，MKK4/MKK5-MPK3/MPK6级联是响应损伤相关分子模式（DAMPs）和病原相关分子模式（PAMPs）的核心模块，由此推测VaMAP3K1通过激活一个类似的VaMKK4/5-VaMPK3/6级联来传递灰霉菌侵染信号^［27-28］。

综上所述，本研究鉴定了山葡萄MAP3K激酶基因VaMAP3K1，通过生物信息学与功能分析，证实VaMAP3K1作为正调控因子显著增强了葡萄对灰霉病的抗性，为葡萄抗病分子育种提供了关键基因资源。然而，病原菌入侵如何激活VaMAP3K1，并进而启动下游MAPK磷酸化信号级联，仍有待进一步探究。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32302496)

河北省自然科学基金青年项目(C2022402024)