宽缨酮对小菜蛾胚胎细胞增殖的抑制作用

Inhibitory effects of eurycomanone on the proliferation of Plutella xylostella embryonic cells

摘要

目的 探究具潜在杀虫活性的植物源化合物宽缨酮（eurycomanone，EN）对小菜蛾胚胎细胞（DBM）增殖的抑制活性及其分子机制，为植物源农药的开发利用提供参考。 方法 以小菜蛾胚胎细胞系（DBM）为试验材料，通过CCK-8法检测宽缨酮对小菜蛾胚胎细胞的毒性作用；利用流式细胞术分析EN对DBM细胞周期与凋亡情况的影响；采用共聚焦显微镜观察EN不同处理DBM细胞自噬相关结构；测定EN不同处理DBM细胞超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性，以评估氧化应激水平。构建E75基因干扰载体，并通过荧光定量PCR检测相关基因表达的变化情况。 结果 宽缨酮可诱导小菜蛾DBM细胞形态损伤，表现为凋亡小体形成、空泡化、膜破裂及脱壁崩解，且呈时间和质量浓度依赖性。宽缨酮可显著抑制小菜蛾胚胎细胞增殖，IC₅₀为4.37 μg/mL。宽缨酮能将小菜蛾胚胎细胞周期阻滞于S期，并诱导细胞凋亡，凋亡率较对照组增加23.77%，且呈时间与质量浓度依赖性；同时宽缨酮可诱导酸性自噬溶酶体聚集。EN处理导致SOD、CAT和POD活性呈现先升高后降低的趋势。E75基因沉默后，EN处理可显著下调SPO、Br‑c和Hr3基因的表达，其相对表达量分别较CK降低49.98%，9.07%和76.33%；同时上调E74、Halloween、USP、Ftz‑F1和EcR基因表达。 结论 EN通过调控E75基因干扰蜕皮激素信号通路，进而激活下游基因网络，诱导DBM细胞凋亡、自噬及氧化损伤，最终导致DBM细胞程序性死亡。

Abstract

Objective This study aims to investigate the inhibitory activity and molecular mechanism of eurycomanone （EN），a plant-derived compound with potential insecticidal activity，on the proliferation of Plutella xylostella embryonic cells （DBM），thereby providing a reference for the development and utilization of botanical pesticides. Method Taking the Plutella xylostella embryonic cell line （DBM） as experimental material，the cytotoxic effect of EN on DBM cells was detected by CCK-8 assay.Flow cytometry was employed to analyze the effects of EN on cell cycle distribution and apoptosis of DBM cells，and confocal microscopy was ado-pted to observe autophagy-related structures in DBM cells under different EN treatments.Furthermore，the activities of superoxide dismutase （SOD），catalase （CAT） and peroxidase （POD） were measured to evaluate oxidative stress levels.An E75 gene interference vector was constructed，and changes in the expression of related genes were detected by quantitative real-time PCR （RT-qPCR）. Result EN induced morphological damage in DBM cells in a time-and concentration-dependent manner，characterized by apoptotic body formation，vacuo-lization，membrane rupture，cell detachment and disintegration.EN significantly inhibited the proliferation of DBM cells，with an IC₅₀ value of 4.37 μg/mL.It arrested the cell cycle at the S phase and induced cell apoptosis，resulting in an apoptotic rate that increased by 23.77% compared with the control，also in a time-and concentration-dependent manner.Meanwhile，EN induced the accumulation of acidic autolysosomes.EN treatment caused the activities of SOD，CAT and POD to initially increase and subsequently decrease.After E75 gene silencing，EN treatment significantly downregulated the expression of SPO，Br‑c and Hr3，with their relative expression levels decreased by 49.98%，9.07% and 76.33%，respectively，compared with the control.Meanwhile，it upregulated the expression of E74，Halloween，USP，Ftz‑F1 and EcR. Conclusion EN interferes with the ecdysone signaling pathway by regulating the E75 gene，thereby activating the downstream gene network，inducing apoptosis，autophagy and oxidative damage in DBM cells，and ultimately leading to programmed cell death.

Graphical abstract

关键词

宽缨酮 / 小菜蛾 / E75基因 / 胚胎细胞 / 细胞凋亡 / 植物源农药

Key words

eurycomanone / Plutella xylostella / E75 gene / embryonic cells / apoptosis / botanical pesticides

小菜蛾（Plutella xylostella（L.））属鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），具有生命力旺盛、繁殖能力强、世代周期短、世代重叠等生物学特性^［1-2］。小菜蛾不仅通过啃食中心叶造成孔洞或缺刻影响包心，使蔬菜失去商品价值^［3］，还会侵食嫩茎、籽粒和幼荚，从而降低种子产量^［4］，是十字花科蔬菜常发性重要害虫。目前对小菜蛾的防治仍以化学防治为主^［5］，但由于长期不合理使用农药，小菜蛾对大多数杀虫剂都产生了抗药性，这对小菜蛾治理造成严重困难^［6］。2004-2009年，广东不同地区小菜蛾对杀虫单的抗药性最高达到129.1倍^［7］，对辛硫磷等（有机磷类杀虫剂）的抗药性水平达到15.2~40.5倍^［8］；粤中地区小菜蛾对氟啶脲等（苯甲酰基脲类杀虫剂）抗性水平达到157.3倍^［9］。因此，挖掘针对小菜蛾等鳞翅目害虫的天然活性化合物具有巨大现实意义。

宽缨酮（eurycomanone，EN）是一类苦木素二萜类化合物，是东革阿里（Eurycoma longifolia）根部的重要活性成分之一^［10］，具有抗炎、抑菌等活性^［11］，已成为医药和农药等领域的研究焦点。已有研究显示，宽缨酮对多种人类癌细胞均表现出良好的抗增殖活性，且对癌细胞特异性较高，对人体正常细胞无明显毒害作用^［12-14］。徐梦婷^［15］的研究揭示，宽缨酮可通过调控mTOR上游信号分子ERK和TSC2来激活mTOR通路，进而抑制细胞保护性自噬。宽缨酮在农业活性方面的研究相对有限，本团队前期研究发现，宽缨酮能引起棉铃虫幼虫拒食，并导致棉铃虫蛹和成虫形态异常^［16］；进一步研究发现，宽缨酮可对小菜蛾口器及中肠组织造成损伤，从而阻碍其生长发育^［17］。上述研究表明，宽缨酮对鳞翅目害虫具有显著的拒食与生长抑制效应，具备开发成为新型植物源杀虫剂的潜力，但其具体作用机制有待进一步研究。

离体细胞模型在农药毒理学研究中的应用日益广泛。自1962年首例昆虫细胞系建立以来，研究人员已从鳞翅目、双翅目等多个昆虫目中成功建立数千株细胞系，为农药活性筛选和机制解析提供了重要工具^［18］。与传统活体生测相比，昆虫细胞模型具有周期短、成本低、重复性好、可高通量筛选等优势，逐渐成为农药毒理学研究的重要手段^［19］。特别是在植物源农药研发领域，基于昆虫细胞系的离体模型可从细胞水平揭示农药的细胞毒性、凋亡诱导、自噬激活及信号通路干扰等分子机制，为理解其杀虫机理提供更深入的视角^［18］。研究表明，利用昆虫细胞系进行活性化合物初筛和作用机制解析，可大幅提高筛选效率，降低研发成本，并为后续活体验证提供精准靶点^［18］。此外，离体模型的应用也契合动物试验“3R”原则的发展趋势。尽管离体结果与活体效果之间仍需建立关联性验证，但随着多组学与基因编辑技术的发展，昆虫细胞模型必将在农药毒理学研究和绿色农药筛选中发挥更重要的作用。

小菜蛾胚胎细胞（DBM）作为鳞翅目害虫的典型体外模型，已广泛应用于杀虫剂靶标鉴定及代谢抗性研究。本研究以小菜蛾胚胎细胞为对象，综合运用细胞生物学（CCK-8、流式细胞术、共聚焦）与分子生物学技术（RNA干扰、qPCR），探究宽缨酮对小菜蛾胚胎细胞的直接毒性效应，以及宽缨酮是否通过调控蜕皮激素通路关键基因触发细胞程序性死亡，旨在为解析宽缨酮的杀虫机制提供新视角，也为植物源杀虫剂的分子设计奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试细胞

小菜蛾胚胎细胞系（DBM）由农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室保存于液氮中。细胞复苏流程为：将冻存管迅速置于37 ℃水浴中解冻，待完全融化后，在生物安全柜内将细胞悬液转移至含5 mL预温SIM SF培养基（USA，HyClone）的15 mL离心管中，800 r/min离心5 min（Eppendorf 5810R）。弃上清后，用含10%（体积分数）胎牛血清（FBS，Gibco）的完全培养基轻柔重悬细胞沉淀，接种至25 cm²培养瓶，补液至终体积3 mL，置于27 ℃、体积分数5% CO₂恒温培养箱（Thermo Scientific）中培养。每日观察细胞状态。当细胞融合度达80%~90%时，按1∶2~1∶3比例传代（传代间隔48 h）。

1.2 供试药剂

宽缨酮（eurycomanone，EN，CAS：84633-29-4，纯度≥98%，HPLC级），购自四川维克奇生物科技有限公司。用二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich）配制10 mg/mL母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装，-20 ℃避光保存。CCK-8试剂盒（Dojindo）、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（BD Biosciences）、RNase A（Thermo Scientific）、碘化丙啶（PI，Sigma）等均按说明书使用。

1.3 试验方法

1.3.1 EN对小菜蛾DBM细胞形态的影响

在6 cm细胞培养皿中接种3 mL处于对数生长期的DBM细胞悬液，置于27 ℃恒温培养箱内培养过夜，然后将培养液更换为含有10 μg/mL EN的新鲜培养基，分别处理0，12，24，48，72，96 h，其中以0 h为对照。在6 cm细胞培养皿中接种3 mL处于对数生长期的DBM细胞悬液，置于27 ℃恒温培养箱内培养过夜，然后将培养液更换为含有0，5，10，20 μg/mL EN的新鲜培养基后处理48 h，其中以0 μg/mL组作为对照。在倒置显微镜下观察各处理DBM细胞形态变化，并拍摄记录。

1.3.2 EN对小菜蛾DBM细胞增殖的影响

使用含3%胎牛血清的培养基将DBM细胞轻柔重悬混匀，调整细胞密度至5×10⁵ CFU/mL。取100 µL细胞悬液接种于96孔板，放置于27 ℃恒温培养箱中过夜培养。试验时移除原培养基，用无血清 SIM SF 培养基将10 mg/mL EN储存液稀释成质量浓度分别为100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5和0.781 25 µg/mL的工作液。分别取100 µL各质量浓度EN工作液加入96孔板，每个质量浓度设4个重复孔，同时以含0.1% DMSO的无血清培养基作为空白对照。将培养板置于27 ℃恒温培养箱中避光孵育24 h。随后每孔添加10 µL CCK-8试剂，继续于相同条件下避光培养2~3 h。使用酶标仪在450 nm 波长处测定各孔吸光度（OD值），所有试验均重复3次，计算细胞抑制率。

细胞抑制率=（OD_对照-OD_加药）/（OD_对照- OD_空白）×100%。

1.3.3 EN对小菜蛾DBM细胞周期的影响

轻柔吹打DBM细胞，使细胞均匀分散，调整细胞悬液密度至1×10⁵ CFU/mL。取2 mL该悬液接种于6孔板，置于27 ℃恒温培养箱中孵育过夜。随后更换为含10 μg/mL EN的新鲜培养基，分别处理0，3，6，12，48及72 h，其中以0 h组作为对照。另取对数生长期DBM细胞，以相同方式接种并培养过夜后，分别更换为含0，5，10，20 μg/mL EN的新鲜培养基培养3 h，其中以0 μg/mL组作为对照。处理结束后，轻轻吹打细胞，经800 r/min离心10 min收集沉淀。细胞用PBS洗涤2次，加入预冷固定液（体积比PBS∶无水乙醇为4∶3），置于4 ℃冰箱中固定过夜。次日以PBS洗涤2次，加入100 μL RNase A溶液，于37 ℃水浴反应30 min；随后加入400 μL PI染液，4 ℃避光孵育30 min。最后，使用流式细胞仪在激发波长488 nm、发射波长617 nm处检测PI红色荧光信号，并借助FlowJo软件统计分析各细胞周期（G0/G1、S、G2/M）的细胞占比。

1.3.4 EN对小菜蛾DBM细胞凋亡的影响

细胞处理方法同1.3.3节。将细胞悬液在4 ℃、800 r/min离心10 min，移除上清液；用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀2次，每次洗涤后均在相同条件下离心并弃去上清。随后加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，并分别加入5 μL Annexin V-FITC与5 μL PI染色液，轻柔混匀后置于室温避光环境中孵育10 min。最后使用流式细胞仪进行检测：在激发波长535 nm、发射波长615 nm处检测PI的红色荧光信号；在激发波长488 nm、发射波长525 nm处检测Annexin V-FITC的绿色荧光信号。

1.3.5 EN对小菜蛾DBM细胞自噬的影响

将1 mL DBM细胞以含3%胎牛血清的SFX培养基接种于共聚焦专用皿中，培养24 h后置换培养基：试验组为含10 μg/mL EN的培养基，对照组为含0.1% DMSO的培养基。培养期间第2天更换一次培养基，分别于处理6，12，24 h后收集细胞。细胞先用PBS清洗3次，再用3.7%甲醛固定5 min，PBS洗涤3次（10 min/次）；再用Lyso-Tracker Red与DAPI进行共染色（各1 mL，37 ℃、5 min），染色后以PBS洗涤3次（10 min/次）。最终在激光共聚焦显微镜下，分别于激发波长340和577 nm处进行检测。

1.3.6 EN对小菜蛾DBM细胞酶活力的影响

细胞处理方法同1.3.2节，分别收集10 μg/mL EN处理3，6，12，24，48，72和96 h的细胞（以0 h为对照）和质量浓度为5，10，20 μg/mL EN处理48 h的细胞（以0 μg/mL为对照），采用微量法按试剂盒说明书操作规程进行酶活性测定。

1.3.7 EN对小菜蛾DBM细胞下游基因表达的影响

（1） E75基因扩增。以DBM细胞为模板，采用Q5热启动超保真DNA聚合酶（New England Biolabs，Cat No.M0491）扩增E75-1、E75-2和E75-3基因。扩增结束后跑胶，使用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收的目的片段作为模板进行dsRNA合成。扩增引物信息详见表1。

（2） 合成E75-1、E75-2和E75-3的dsRNA模板。使用T7RNA双链合成试剂盒，设计含有T7 RNA polymerase promoter序列的引物，引物序列信息详见表2。

（3） dsRNA体外合成。根据 T7 RiboMAX™ Express RNAi System 试剂盒说明书合成dsRNA，20 μL体系中包含2×T7 buffer 10 μL，DNA template 5 μL，Enzyme Mix 2 μL，T7 Express 2 μL，Nuclease-free water 1 μL。吹打混匀后离心，37 ℃反应10 h；70 ℃保温10 min，再缓慢冷却至室温。按体积1∶200的比例用无核酶水配制RNase工作液；分别在上述反应体系中加入1 μL RNase工作液和1 μL RQ1 RNase free DNase，37 ℃保温30 min；反应结束后，加入10%体积pH为5.2的3 mol/L醋酸钠和1倍体积的异丙醇混匀，将其置于冰上5 min，4 ℃条件下13 000 r/min离心10 min，弃上清；用体积分数75%酒精洗涤dsRNA沉淀，4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min，弃上清；将回收到的dsRNA在室温下放置，待干燥后加入20 μL DEPC free water溶解dsRNA；取1 μL dsRNA利用紫外分光光度计测其OD值，并计算dsRNA浓度，-80 ℃保存。

（4） dsRNA转染验证基因表达。转染在DBM细胞处于对数生长期、12孔板细胞汇合度为80%~90%时进行。细胞经0.1 mol/L PBS清洗3次后，加入1 mL新鲜无血清培养基。配制转染干预体系：取125 μL新鲜无血清培养基，加入2 μL EC buffer，混匀后室温孵育5 min；随后加入0.5 μg过表达或干扰载体，轻柔混匀后室温孵育20 min，其间颠倒混匀3~5次。将上述体系加入细胞孔中，转染6 h后更换普通培养基培养过夜。第一个孔作为对照（control），加1 mL正常培养基处理细胞；第二个孔加过表达或干扰载体处理细胞；第三个孔加终浓度10 μg/mL EN处理细胞；第四个孔中加过表达或干扰载体与10 μg/mL EN处理细胞。继续培养24 h，试验设3个复孔。

培养24 h后的DBM细胞用M5 HiPer Universal Plus RNA Mini Kit加强型组织/细胞RNA快速提取试剂盒（北京聚合美，MF167-01）提取DBM细胞RNA，质量合格的RNA用逆转试剂盒（TaKaRa，RR036Q）合成cDNA第一链。反应体系为：RNA 2 μL、5×PrimeScript RT Master Mix（for Real Time）2 μL、RNase Free ddH₂O 6 μL。使用Primer 5.0引物设计软件分别设计差异基因的定量引物，引物序列见表3，内参基因选择Actin。使用2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq （with Tli RNaseH）（北京聚合美，MF787）检测基因表达量。采用2^－∆∆Ct 法计算相对表达量。

1.4 数据处理与分析

试验结果均为3次以上重复的平均值，使用SPSS 21.0进行单因素方差分析，采用邓肯氏多重比较进行样本间的差异显著性分析，以P<0.05表示在统计学上具有显著性差异；采用FlowJo软件分析细胞流式数据，采用Origin 2017绘图。

2 结果与分析

2.1 EN对小菜蛾DBM细胞形态的影响

在倒置显微镜下观察对照组与10 μg/mL EN处理不同时间后DBM细胞的形态变化，结果如图1所示。

由图1-A可知，对照组细胞形态饱满且膜结构完整，多呈不规则圆形或梭形，贴壁良好。10 μg/mL EN处理12 h后，凋亡小体形成，偶见轻微空泡（图1-B）；处理24 h时，细胞凋亡进一步加剧，培养皿底部出现较多凋亡小体（图1-C）；处理48 h时，多数细胞出现明显空泡，部分细胞膜完整性丧失，凋亡特征较24 h更为显著（图1-D）；处理72 h时，细胞空泡化严重，普遍肿胀破裂，胞内物质外溢，大量细胞死亡（图1-E）；处理96 h时，凋亡进程持续加重，细胞多呈圆缩脱壁状态，几乎无正常形态细胞存在（图1-F）。

通过倒置显微镜比较不同质量浓度EN处理48 h对DBM细胞形态的影响，结果如图2所示。由图2-A可知，对照组细胞形态规则，表面光滑；5 μg/mL EN处理48 h导致细胞空泡化明显，部分细胞膜破损并出现凋亡小体（图2-B）；10 μg/mL EN处理48 h，大量细胞肿胀，伴有明显细胞碎片，凋亡小体数量明显增多（图2-C）；20 μg/mL EN处理48 h则引起细胞结构严重破坏，多数细胞脱壁，几乎无完整贴壁细胞（图2-D）。

上述结果表明，在96 h内，随着EN处理时间的延长，小菜蛾DBM细胞凋亡程度逐渐加深；在处理48 h时，随着EN质量浓度的升高，小菜蛾DBM细胞凋亡现象也更为突出。这表明EN对小菜蛾DBM细胞增殖的抑制具有时间依赖性和浓度依赖性。

2.2 EN对小菜蛾DBM细胞增殖的影响

不同质量浓度EN对小菜蛾DBM细胞增殖的影响如图3所示。图3表明，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5和0.781 25 μg/mL EN作用DBM细胞24 h后，细胞抑制率分别为86.37%，85.67%，72.51%，63.7%，54.95%，45.93%，34.91%和13.71%，抑制中浓度IC₅₀为4.37 μg/mL。由图3可知，EN质量浓度小于50 μg/mL时，各质量浓度间细胞抑制率差异显著（P<0.05），但50与100 μg/mL间细胞抑制率差异不显著。说明在一定质量浓度范围内，EN对小菜蛾DBM细胞的抑制率会随质量浓度的增加而增加，但超过一定范围其抑制率不会随EN质量浓度的增加而显著增加。

2.3 EN对小菜蛾DBM细胞周期分布的影响

经10 μg/mL EN处理不同时间后，各周期DBM细胞占比如图4所示。由图4可知，与对照组（0 h）相比，10 μg/mL EN处理72 h后，处于G0/G1期的细胞占比从23.37%上升至32.11%，S期细胞占比由38.89%降至12.89%，而G2/M期细胞占比则从37.74%增加至54.99%。

经0，5，10，20 μg/mL EN处理3 h后，DBM细胞周期分布如图5所示。由图5可知，与对照组（0 μg/mL）相比，5，10，20 μg/mL EN处理下G0/G1期细胞占比依次由24.9%增至27.56%，30.93%和32.1%，S期细胞占比由37.96%分别上升至41.46%，42.69%和41.12%，G2/M期细胞占比则从37.14%分别下降至30.98%，26.38%和26.77%。

上述结果表明，EN可诱导小菜蛾DBM细胞发生S期阻滞，导致细胞DNA合成与复制过程受到抑制，进而引起细胞损伤，阻碍其完成正常细胞周期。

2.4 EN对小菜蛾DBM细胞凋亡的影响

使用5，10，20 μg/mL EN处理小菜蛾DBM细胞3 h后，通过流式细胞术对FITC与PI荧光信号进行检测，不同质量浓度EN处理下小菜蛾DBM细胞的凋亡占比如图6所示。由图6可知，与对照组（0 μg/mL）相比，20 μg/mL EN处理24 h后，正常细胞占比从82.31%下降至58.04%，早期凋亡细胞占比从1.13%上升至16.17%，晚期凋亡细胞占比由3.52%升高至12.25%。上述结果表明，EN可诱导小菜蛾DBM细胞发生凋亡，且细胞凋亡率呈质量浓度依赖性。

2.5 EN对小菜蛾DBM细胞自噬的影响

Lyso-Tracker Red是一种带有弱碱性的荧光探针，能特异性地标记酸性溶酶体，且荧光强度与酸性程度正相关，呈红色荧光，可以利用荧光显微镜对细胞中发生的自噬溶酶体进行镜检。DAPI是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，DAPI染色后在激发光的照射下呈蓝色荧光，可以利用荧光显微镜对细胞中发生的凋亡小体进行镜检。使用0，5，10，20 μg/mL EN处理24 h后，DBM细胞自噬情况见图7。由图7可知，与对照（0 μg/mL）相比，EN处理24 h后，DBM细胞内部出现了自噬溶酶体红色荧光小点，荧光小点数量与荧光强度随着EN处理浓度的升高而增加，出现了酸性自噬溶酶体囊泡过度积累的现象。通过DAPI染色发现，与对照（0 μg/mL）相比，EN处理后DBM细胞蓝色荧光强度降低、细胞空泡化严重、凋亡小体数量明显增加，且随着EN处理浓度的增加而显著变化，出现大面积自噬现象。综上可知，EN可使小菜蛾DBM细胞发生自噬作用，且呈明显的浓度依赖性。

2.6 EN对小菜蛾DBM细胞酶活力的影响

2.6.1 对SOD活性的影响

由图8可知，10 μg/mL EN处理DBM细胞0，3，6，12，24，48，72和96 h，其SOD活性整体呈现出先升后降趋势，在处理24 h时达到顶峰，然后迅速下降；处理6和12 h时SOD活性无显著差异（P>0.05），但均显著高于对照组；处理96 h后其SOD活性显著低于对照组。使用5，10，20 μg/mL EN处理DBM细胞48 h后发现，5 μg/mL处理小菜蛾DBM细胞SOD活性显著高于对照组（P<0.05），10 μg/mL处理小菜蛾DBM细胞SOD活性与对照无显著差异，20 μg/mL处理小菜蛾DBM细胞SOD活性显著低于对照组（P<0.05）。综上可知，EN使小菜蛾DBM细胞发生了明显的氧化应激反应。

2.6.2 对CAT活性的影响

过氧化氢酶（CAT）是细胞体内减少过氧化氢、阻止高毒性羟基自由基产生的一种关键酶。使用质量浓度为5，10，20 μg/mL EN处理DBM细胞48 h后发现，EN质量浓度的增加导致DBM细胞体内的CAT活性产生了剧烈变化。其中，20 μg/mL EN处理后CAT活性较对照组（5.61 μmol/（min·mg））极显著提高，为10.51 μmol/（min·mg）；CAT酶活性随着处理时间延长呈现先急剧上升再急剧下降的趋势，在处理6 h时其活性达到最高，为9.77 μmol/（min·mg），与对照组具有显著差异（P<0.05）。

2.6.3 对POD活性的影响

由图10可知，在不同质量浓度EN处理下，DBM细胞内POD活性表现出低质量浓度增强、高质量浓度抑制的变化模式。与对照组（0 μg/mL）相比，10 μg/mL EN处理极显著提升了POD活性（P<0.01），而20 μg/mL EN处理POD活性则略低于对照水平。随着处理时间的延长，POD活性总体上呈先升高后降低的动态变化趋势，在处理24 h时达到峰值（0.71 μmol/（min·mg）），且显著高于对照组（P<0.05）。上述结果表明，DBM细胞在EN胁迫初期可能激活了保护性响应，促使POD活性上升；但随着胁迫时间的延长，POD活性逐渐受到抑制，说明细胞中部分POD从初始敏感状态逐步转为后期的适应状态，体现出一定的耐受特性。

2.7 EN对小菜蛾DBM细胞下游基因表达的影响

由图11可知，与对照相比，EN处理SPO基因相对表达量上调了7.8倍，E75-RNAi处理上调了2.26倍，E75-RNAi+EN处理则下降了77.87%；E74基因相对表达量在EN处理上调了11.92倍，E75-RNAi处理下降了8.50%，E75-RNAi+EN处理上调了2.01倍；Halloween基因相对表达量在EN处理上调了5.72倍，E75-RNAi处理上调了1.03倍，E75-RNAi+EN处理上调了1.01倍；Br-c基因相对表达量在EN处理上调了4.34倍，E75-RNAi处理下降了93.28%，E75-RNAi+EN处理下降了9.07%；USP基因相对表达量在EN处理上调了3.29倍，E75-RNAi处理下降了1.07%，E75-RNAi+EN处理上调了3.08倍；Ftz-F1基因相对表达量在EN处理上调了7.58倍，E75-RNAi处理下降了84.95%，E75-RNAi+EN处理上调了9.15倍，但与EN相比下降了81.84%；Hr3基因相对表达量在EN处理上调了5.51倍，在E75-RNAi处理则下降了34.00%，E75-RNAi+EN处理下降了64.26%；EcR基因相对表达量在EN处理上调了9.58倍，在E75-RNAi处理下降了59.17%，但在E75-RNAi+EN处理却上调了4.42倍，但与EN处理相比下降了81.16%。综上可知，与对照相比，EN处理后DBM细胞蜕皮激素通路相关基因（SPO、Br-c、Hr3、E74、Halloween、USP、Ftz-F1和EcR）的表达水平均显著上调（P<0.05）；与EN处理相比，E75-RNAi处理上述基因的表达水平均显著下降（P<0.05）；而与E75-RNAi处理相比，E75-RNAi+EN处理上述基因的表达水平均有所回升，但与EN相比，上述基因的表达水平均显著下降（P<0.05）。推测EN可通过E75基因调控DBM细胞蜕皮激素通路相关基因的表达水平，进一步调控DBM细胞的凋亡。

3 讨论与结论

EN作为东革阿里根部的代表性活性成分，已被证实具有降脂、改善性功能及抗脑瘤等多种药理活性，尤其对多种肿瘤细胞表现出显著抑制效应^［20-21］。本课题组前期研究发现，EN对小菜蛾、草地贪夜蛾、棉铃虫等鳞翅目害虫具有拒食与生长发育抑制活性^［17-18］，但其对昆虫细胞的直接作用尚未见报道。本研究首次以小菜蛾胚胎细胞（DBM）为对象，系统探究了EN对小菜蛾DBM细胞的毒性及其作用机制。结果表明，EN对DBM细胞增殖具有良好的抑制作用，且呈剂量依赖性。进一步的细胞学分析显示，EN可将细胞周期阻滞于S期，干扰DNA合成与复制过程，进而触发细胞凋亡。与此同时，Lyso-Tracker Red与DAPI染色观察到EN处理后DBM细胞内酸性自噬溶酶体出现异常累积，提示EN可协同诱导细胞自噬与凋亡。二者的交互作用共同推动了DBM细胞的程序性死亡。这一多途径的细胞毒性模式，不仅揭示了EN对昆虫细胞的直接作用，也为其作为植物源杀虫剂的潜在应用提供了新的理论依据。

活性氧（ROS）是有氧代谢过程中生成的一类含氧且化学性质活泼的分子统称^［22］。当细胞受到外界刺激时，ROS水平迅速上升，其生成与清除之间的动态平衡被打破，过量的ROS会引发膜脂过氧化，产生大量具细胞毒性的代谢物，最终导致细胞死亡^［23-24］。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）是细胞内抗氧化系统的关键酶类，其活性可反映机体应答外界胁迫的强度。本研究结果显示，EN处理后，DBM细胞内SOD、CAT和POD活性均呈现先上升后下降的动态变化。这可能是由于细胞在EN胁迫初期激活了防御响应，促使酶活性升高；随着胁迫时间的延长，酶活性逐渐受到抑制。结果表明，EN干扰了DBM细胞内ROS的清除过程，导致有害代谢物积累，进而引起细胞损伤。

类固醇作为动植物体内普遍存在的信号分子，在昆虫和其他节肢动物中发挥着重要作用，其中蜕皮激素是昆虫和其他节肢动物生长发育、繁殖等生理活动的重要激素之一，而Halloween基因参与蜕皮激素的合成^［25-26］，其产物转化为活性20-羟基蜕皮激素后，与EcR/USP受体复合物结合启动下游级联反应^［27］。本研究中，与对照相比，EN处理显著上调了Halloween基因表达，暗示EN可能干扰蜕皮激素的合成与信号转导。前人研究表明，沉默Halloween家族基因可导致幼虫死亡、发育迟缓和化蛹率下降^［28-30］，这与本研究中EN处理后基因表达变化所引发的生理效应相呼应。

EcR和USP作为蜕皮激素信号通路的核心转录因子，其表达量变化直接影响着下游基因网络的调控^［31］。蜕皮激素与EcR/USP复合物结合后，启动一系列转录因子（如Hr3、Br-c、E74、Ftz-F1等）的表达，进而调控细胞程序性死亡相关基因^［32］。本研究中，干扰E75基因后，EN对下游基因（SPO、Br-c、Hr3）的调控作用显著减弱，而E74、Halloween、USP、Ftz-F1和EcR等基因的表达则显著上调。这一结果表明，E75可能是EN作用于蜕皮激素信号通路的关键节点，E75的缺失削弱了EN对DBM细胞的信号刺激，进而影响蜕皮激素通路下游基因对凋亡的诱导能力。类似地，已有研究证实，沉默EcR和USP基因可影响其他昆虫的生殖力、脂质代谢及基因表达调控^［33-35］，进一步支持了本研究关于蜕皮激素通路在EN作用机制中重要地位的推断。

综上可知，天然产物EN对小菜蛾DBM细胞具有良好的增殖抑制活性，EN可能通过E75基因抑制细胞蜕皮激素信号途径，进一步激活下游基因（SPO、Br-c、Hr3、E74、Halloween、USP、Ftz-F1和EcR）的表达，从而诱导DBM细胞自噬与凋亡，造成细胞程序性死亡。作为天然活性成分，EN具有安全、无毒易降解、成本低、易获得等优点，具备开发成为植物源农药的巨大潜力，但其具体的调控机制尚需进一步深入研究。

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基金资助

广东省基础与应用基础研究基金项目“宽缨酮激活转录因子foxo抑制斜纹夜蛾生长发育的毒理机理”(2025A1515011308)

“宽缨酮靶向InR受体蛋白毒杀斜纹夜蛾的分子机理”(2024A1515011448)