敲除AcMNPV非必需基因的杆状病毒表达载体构建

Construction of baculovirus expression vectors by knocking out non‑essential genes of AcMNPV

摘要

目的 在野生型AcMNPV基因组上对Ac29~Ac33基因进行分段敲除，包括单基因敲除和多基因组合敲除，探究其对杆状病毒表达载体外源蛋白表达能力的影响。 方法 采用Red/ET同源重组技术，对Ac29~Ac33基因簇进行单基因敲除及组合敲除，获得目的基因片段缺失的杆粒，并构建对应基因敲除型重组杆状病毒。通过SDS-PAGE、流式细胞术和qPCR等多种技术手段，系统检测目的基因敲除对外源蛋白表达的影响。 结果 Ac29~Ac33基因簇的各种组合敲除均不影响杆状病毒的复制。除Ac30单基因敲除导致外源蛋白表达严重下调外，其余不同组合敲除方式均对外源蛋白表达有正向调控作用，其中Ac30-31与Ac32-33两种敲除效果最显著，外源蛋白表达水平分别提高49.7%和61.8%。qPCR检测发现，Ac30-31与Ac32-33两种敲除型重组病毒的早期基因与晚期基因转录水平有所下调，而晚期到极晚期基因转录水平存在加速现象，驱动外源蛋白表达的极晚期基因p10转录水平显著强于野生型病毒，在不影响病毒复制的情况下显著提升了外源蛋白的表达效率。 结论 成功优选出vAc-ΔAc30-31与vAc-ΔAc32-33两种高产杆状病毒表达载体。

Abstract

Objective This study aims to perform segmental knockout of Ac29-Ac33 genes in the wild-type AcMNPV genome，including single-gene and multi-gene combinatorial knockout，exploring their effects on foreign protein expression in baculovirus expression vectors. Method Red/ET homologous recombination was employed to perform single-gene and combinatorial knockouts of the Ac29-Ac33 gene cluster，yielding bacmids with target gene deletions，from which the corresponding recombinant baculoviruses were constructed.The effects of target gene knockout on foreign protein expression were systematically detected using multiple techniques， including SDS-PAGE，flow cytometry and quantitative real-time polymerase chain reaction （qPCR）. Result None of the combinatorial knockouts of the Ac29-Ac33 gene cluster affected viral replication.Except for the Ac30 single-gene knockout，which significantly downregulated foreign protein expression，all other knockout combinations positively regulated foreign protein expression.Among these，the Ac30-31 and Ac32-33 knockouts showed the most pronounced effects，increasing foreign protein expression levels by 49.7% and 61.8%，respectively.qPCR results revealed that in the Ac30‑Ac31 and Ac32‑Ac33 knockout recombinant viruses，the transcription levels of early and late genes were downregulated，whereas transcription was accelerated from late to very late phases.The transcription level of the very late gene p10，which drives foreign protein expression， was significantly higher than that of the wild-type virus， leading to a notable improvement in protein expression efficiency without affecting viral replication. Conclusion Two high-yield baculovirus expression vectors，vAc-ΔAc30-31 and vAc-ΔAc32-33，were successfully selected.

Graphical abstract

关键词

杆状病毒表达系统 / AcMNPV / 非必需基因 / Ac29~Ac33基因簇

Key words

baculovirus expression system / AcMNPV / non-essential genes / Ac29-Ac33 gene cluster

杆状病毒（Baculovirus）是一种具有杆状单层衣壳和囊膜的病毒，其基因组为超螺旋环状双链DNA，大小为80~180 kb^［1］，有90~180个开放的阅读框（open reading frame，ORF）^［2］。杆状病毒的一个显著特征是能够产生出芽型杆状病毒（budded virions，BV）和包埋型杆状病毒（occlusion-derived virions，ODV）两种不同的病毒粒子，其模式种为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（autographa californica multiple nucleopolyhedro virus，AcMNPV），目前已完成全基因组测序^［3］，基因组大小为133 966 bp，包含154个开放阅读框^［4］，可以感染鳞翅目中的多种昆虫。

杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system，BEVS）是目前应用较为广泛的真核表达系统^［5］，其利用杆状病毒作为外源基因的载体，以昆虫细胞为宿主，实现病毒基因组的自我扩增和目的蛋白的表达^［6］。作为一种真核表达系统，BEVS能够进行蛋白翻译后的修饰加工，从而使表达的重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白^［7］。在AcMNPV中，基因表达分为4个阶段：立即早期、早期、晚期和极晚期。在极晚期，多角体蛋白（polyhedrin）和P10蛋白基因的表达效率较高，且均为病毒复制的非必需成分，因此这两个基因位点常用于插入外源基因^［8］。常用的宿主细胞包括草地贪夜蛾来源的Sf9和Sf21细胞，以及粉纹夜蛾来源的HighFive细胞^［9］。

目前杆状病毒表达系统的优化，主要是通过调控病毒的顺式作用元件与反式作用因子，构建抗凋亡载体以延长蛋白表达时间及敲除非必需基因缩短病毒基因组来释放细胞资源等方式来进行。有研究者用晚期启动子P6.9替代极晚期启动子，提前目的蛋白表达时段，成功提高重组蛋白的表达效率^［10］；也有研究者将SV40^［11］、CMV^［12］、CAG^［13］、HSP70^［14］、RSV^［15］等外源强启动子引入BEVS，用于替换原有启动子，均能不同程度提升外源基因转录效率。此外，启动子+启动子、启动子+增强子的组合，也被证明可以提高外源蛋白表达效率。例如：PolH启动子+vp39启动子^［16］、PolH启动子+ Hr1增强子^［17］、vp39启动子+Hr3增强子^［18］等组合均被证明可提升外源基因的表达水平。此外，Kaba等^［19］通过敲除几丁质酶基因（chiA）与组织蛋白酶基因（v-cath），显著提升了胞内及分泌型重组蛋白的完整性，有效避免了蛋白降解；Kitts等^［20］构建敲除Ac5、Ac138基因的重组表达载体，敲除后病毒基因组精简约1.2 kb，外源蛋白产量提升15%；Hitchman等^［21］研究表明，同时敲除非必需基因p10、p26、p74后，重组蛋白表达量显著高于野生型病毒。本实验室前期研究发现，AcMNPV的Ac29-Ac33基因为非必需基因，其整体敲除可显著提高外源蛋白的表达量^［22］，但具体影响外源蛋白表达的关键基因尚不明确。为此，本研究通过Red/ET同源重组技术，在野生型病毒上对Ac29~Ac33基因进行单基因敲除和不同组合分段敲除，通过流式细胞术、SDS-PAGE、qPCR等方法鉴定不同基因敲除组合对外源蛋白表达的影响，以期为优化杆状病毒表达载体、提高蛋白产量以及探索AcMNPV的基因功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 载体、菌株与细胞

质粒pTriEx-EGFP、杆粒Bacmid Ⅰ、大肠杆菌HS996克隆菌株和草地贪夜蛾Sf9细胞系，均由西北农林科技大学生命科学学院分子病毒实验室保存。

1.2 主要试剂

本研究所用的PCR引物，由北京擎科生物科技股份有限公司合成；2× PHanta Flash Master Mix、2× Rapid Taq Master Mix，均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；FuGENE HD转染试剂，购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；昆虫细胞培养基、ClonExpress^®Ⅱ One Step Cloning Kit、Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper），均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司（Vazyme）。

1.3 Ac29~Ac33单基因敲除与组合敲除

依据杆粒Bacmid Ⅰ的基因序列，以p-rpsL-Amp质粒为模板，设计并合成带有目标敲除片段同源臂（约50 bp）的上下游引物（Ac29U/Ac29D、Ac30U/Ac30D、Ac31U/Ac31D、Ac32U/Ac32D、Ac33U/Ac33D）（表1）。通过PCR扩增获得含同源臂的目的片段，包括单基因敲除片段与组合敲除片段。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的片段。基于Red/ET同源重组技术对AcMNPV的Ac29~Ac33基因进行单敲除及组合敲除，具体操作参见GENE BRIDGES公司Counter-Selection BAC Modification Kit说明书。将敲除菌涂布于含15 µg/mL卡那霉素（Kan）、3 µg/mL四环素（Tet）和50 µg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基，挑取单菌落溶于10 µL无菌水中作为模板，使用敲除片段上游扩增引物与敲除鉴定引物（Ac29UT、Ac30UT、Ac31UT、Ac32UT、Ac33UT）， 通过菌液PCR鉴定扩增产物，确认敲除正确后获得AcMNPV的Ac29~Ac33基因单敲除及组合敲除的重组菌株（BacIΔAc29、BacIΔAc30、BacIΔAc31、BacIΔAc32、BacIΔAc33、BacIΔAc29-30、BacIΔAc30-31、BacIΔAc31-32、BacIΔAc32-33、BacIΔAc29-31、BacIΔAc30-32、BacIΔAc31-33、BacIΔAc29-32、BacIΔAc30-33、BacIΔAc29-33）。

1.4 重组AcMNPV的构建

将目的基因敲除的大肠杆菌HS996接种于含15 µg/mL卡那霉素（Kan）、3 µg/mL四环素（Tet）和50 µg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基划线培养，挑取单克隆接种至相同抗性的LB液体培养基中振荡培养过夜；按1∶1 000比例转接至50 mL含15 µg/mL卡那霉素（Kan）、3 µg/mL四环素（Tet）和50 µg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基，振荡培养12~14 h。采用碱裂解法提取突变型Bacmid质粒，经限制性内切酶Bsu 36Ⅰ线性化后用于重组杆状病毒的构建。

取对数生长期的Sf9细胞铺于6孔细胞板，静置培养至细胞贴壁率达70%，每孔加入2 mL昆虫细胞培养基。准备2个1.5 mL离心管：1号管加入10 ng线性化Bacmid质粒、300 ng pTriEx-EGFP质粒及95 μL无菌水；2号管加入5 μL转染试剂（promega FuGENE HD transfection reagent）及95 μL无菌水，轻轻混匀。将2号管溶液缓慢加入1号管，轻弹离心管底部混匀，室温静置30 min。将转染混合物逐滴加入6孔细胞板的对应孔中，轻轻摇晃细胞板，使转染混合物与细胞充分接触，28 ℃培养5 d后收集上清液，即为P₀代重组杆状病毒。

1.5 重组AcMNPV介导的GFP蛋白表达与检测

将Sf9细胞均匀铺于12孔细胞板，在细胞贴壁率达70%时每孔加入2 μL P₀代重组杆状病毒，28 ℃培养4~5 d，根据细胞感染状态收集上清液，获得滴度更均一的P₁代重组杆状病毒，并通过终点稀释法测量病毒滴度。将Sf9细胞均匀铺于12孔细胞板，在细胞贴壁率达90%时，将P₁代重组杆状病毒以感染复数（MoI）=3感染Sf9细胞，培养4 d后通过倒置荧光显微镜观察极晚期启动子p10驱动下绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况。随后弃去上清液，每孔加入200 μL 1×SDS上样缓冲液裂解细胞，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心5 min去除细胞碎片，收集上清液进行SDS-PAGE电泳，分析GFP蛋白表达的差异。以相同条件将P₁代重组杆状病毒感染Sf9细胞，4 d后用滴管轻轻吹打贴壁细胞，使细胞重悬，通过流式细胞仪定量检测GFP荧光强度，验证蛋白表达水平。

1.6 重组AcMNPV的病毒复制能力和基因转录水平变化

将处于对数生长期的Sf9细胞以1×10⁵ 个/mL的密度接种于6孔细胞板，每孔加入2 mL完全培养基，置于28 ℃恒温培养箱中培养至细胞贴壁率约为80%时，以低感染复数（MOI=0.1）加入病毒液，轻轻摇晃细胞板，使病毒液均匀覆盖细胞表面，28 ℃吸附1 h后弃去含病毒的培养基，用预冷的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，以去除未吸附的游离病毒；之后每孔补加2 mL新鲜完全培养基，继续置于28 ℃培养箱中培养。分别于感染后0，24，48，72，96和120 h收集各孔病毒上清液，每个时间点设置3个技术重复。采用终点稀释法（TCID₅₀法）测定各上清液的病毒滴度，最终以感染时间为横坐标、病毒滴度的常用对数值（lg TCID₅₀）为纵坐标，绘制一步生长曲线，比较敲除型与野生型病毒的复制差异。

将对数生长期的Sf9细胞接种于6孔细胞板，培养至细胞贴壁率达90%时，以高感染复数（MOI=5）分别接种重组病毒及野生型病毒，每组设置3个生物学重复。分别于感染后12 h（早期）、24 h（晚期）、36 h（极晚期）收取细胞，吸弃培养基后用预冷PBS洗涤细胞2次，加入Trizol试剂充分裂解细胞，按照试剂盒说明书标准流程提取细胞总RNA。通过NanoDrop检测RNA纯度（OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8~2.0）和浓度，确保RNA质量符合试验要求。取1 μg总RNA作为模板，使用HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR试剂盒进行反转录合成第1链cDNA。以昆虫细胞持家基因ecd作为内参基因，用病毒早期基因（ie-0、ie-1、ie-2、lef-1、lef-3、lef-8、me53、p143）、晚期基因（vlf-1、gp41、orf-75、p6.9）以及极晚期基因（p10）的特异性引物，通过qPCR检测各时期目标基因的转录水平，采用2⁻^ΔΔCt 法计算目标基因的相对转录水平，定量分析在不同表达阶段敲除型与野生型病毒基因的转录差异。

将对数生长期的Sf9细胞接种于12孔细胞板，用vAc、vAc-ΔAc30-31和vAc-ΔAc32-33的P₁代重组杆状病毒以低感染复数（MOI=0.1）感染Sf9细胞，每个样品重复感染5个细胞孔，每隔24 h收取对应的细胞，弃去上清液，用预冷PBS洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，并通过乙醇沉淀法提取裂解液中的细胞总DNA（包含宿主细胞DNA与杆状病毒基因组DNA）。以提取的总DNA为模板，选用病毒vp39基因作为定量靶基因，每隔24 h取样，采用qPCR测定vAc、vAc-ΔAc30-31和vAc-ΔAc32-33感染Sf9细胞内AcMNPV基因组含量，并通过GraphPad软件绘制折线图，检测基因敲除对胞内病毒基因组累积的影响。

2 结果与分析

2.1 重组杆状病毒的制备

成功构建Ac29~Ac33基因单敲除及组合敲除的HS996大肠杆菌菌株。菌落PCR鉴定结果如图1所示，阳性克隆的PCR扩增产物条带大小与预期目的片段一致，表明Ac29~Ac33基因的单敲除与组合敲除均成功实现。

对鉴定正确的敲除菌株扩大培养后，通过碱裂解法提取敲除型杆粒，经Bsu 36Ⅰ限制性内切酶线性化及醇沉纯化后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果（图2）显示，成功获取野生型及15种敲除型杆粒，线性化质粒条带单一无拖尾，无基因组DNA污染，可满足后续重组病毒构建需求。

将线性化杆粒与pTriEx-EGFP质粒共转染Sf9细胞后，倒置荧光显微镜下可观察到GFP阳性细胞，表明重组杆状病毒构建成功，共获得16种不同基因敲除组合的重组杆状病毒（vAc、vAc-ΔAc29~vAc-ΔAc29-33）。该结果证实，Ac29~Ac33基因的单敲除或组合敲除均不影响杆状病毒的复制能力，证实这些基因均为非必需基因。

2.2 Ac29~Ac33基因敲除对GFP蛋白表达的影响

以MOI=3的重组病毒感染Sf9细胞4 d后，在倒置荧光显微镜下观察，结果（图3）显示，不同基因敲除组合的GFP表达存在明显差异。vAc-ΔAc30-31、vAc-ΔAc32-33的荧光强度显著强于野生型组，而vAc-ΔAc30的荧光强度则明显弱于野生型组，其余部分敲除组荧光强度略高于野生型组或无明显差异。

流式细胞术（FITC通道）定量检测结果与荧光显微镜观察结果（图4）一致，具体数据统计表明：vAc-ΔAc31、vAc-ΔAc32、vAc-ΔAc33、vAc-ΔAc29-30、vAc-ΔAc30-31、vAc-ΔAc32-33和vAc-ΔAc31-33的GFP平均荧光强度（MFI），分别较野生型组提升36.1%，10.7%，18.4%，22.2%，55.6%，42.7%和32.7%，其中vAc-ΔAc30-31提升效果最显著（55.6%），vAc-ΔAc32-33次之（47.2%）；vAc-ΔAc30的GFP平均荧光强度较野生型组显著下降35.2%；其余敲除组与野生型组相比差异无统计学意义。上述结果表明，多数Ac29~Ac33基因敲除可对极晚期蛋白的合成或稳定性发挥正向调控作用，而Ac30基因缺失则会显著下调极晚期启动子驱动的外源蛋白表达水平。

通过ImageJ软件对SDS-PAGE条带灰度值进行定量分析，结果（图5）显示，vAc-ΔAc31、vAc-ΔAc30-31、vAc-ΔAc32-33的GFP蛋白条带灰度值分别较野生型组提升32.1%，49.7%和61.8%，表达量提升明显；vAc-ΔAc30的GFP蛋白条带灰度值较野生型组下降88.3%，表达量显著下调；其余基因敲除组与野生型组的GFP蛋白条带灰度值差异不明显。该结果与流式细胞术检测结果基本一致，进一步证实了不同非必需基因敲除对极晚期蛋白表达的调控作用，排除了单一检测方法可能产生的误差。

2.3 非必需基因Ac30-31和Ac32-33敲除对病毒生长曲线的影响

将vAc-ΔAc30-31、vAc-ΔAc32-33病毒和野生型病毒（vAc）以MOI=0.1平行感染Sf9细胞，在感染0，24，48，72，96和120 h时分别收取病毒上清并测定滴度，绘制一步生长曲线。结果（图6）显示，vAc-ΔAc30-31和vAc-ΔAc32-33的复制能力略强于野生型。

在病毒感染后不同时间点的荧光观察结果（图7）显示，vAc-ΔAc30-31、vAc-ΔAc32-33的GFP阳性细胞覆盖率在感染初期水平相当，在感染后72和96 h时GFP阳性细胞覆盖率明显高于野生型。该结果表明vAc-ΔAc30-31和vAc-ΔAc32-33病毒的传播速度更快、细胞GFP表达量更高。

2.4 非必需基因Ac30-31和Ac32-33敲除对病毒基因转录水平的影响

将vAc-ΔAc30-31、vAc-ΔAc32-33病毒和野生型病毒以MOI=5感染Sf9细胞，分别于12 h（早期）、24 h（晚期）、36 h（极晚期）收取细胞并提取总RNA，以昆虫ecd基因为内参，通过qPCR技术定量分析不同表达阶段各基因的转录水平变化，结果（图8）显示，感染后12和24 h时，vAc-ΔAc30-31和vAc-ΔAc32-33重组病毒的早期基因与晚期基因转录水平均低于野生型，表明Ac30-31、Ac32-33基因敲除可能导致病毒转录活性轻微下降，但未影响病毒正常复制；感染后36 h时，极晚期p10基因转录水平与早期、晚期基因趋势相反，vAc-ΔAc30-31和vAc-ΔAc32-33重组病毒组p10转录水平较野生型略有上调，与2.2节GFP蛋白表达量提升的结果相呼应。

2.5 非必需基因Ac30-31和Ac32-33敲除对Sf9细胞内杆状病毒基因组含量的影响

图9结果显示，培养24 h时，vAc-ΔAc30-31、vAc-ΔAc32-33的胞内基因组DNA含量与野生型差异最显著，仅为野生型的1/4，随着培养时间的延长，两者差异逐渐缩小，但始终维持在野生型的1/2水平。胞内DNA含量的差异与2.4节qPCR检测所得的转录水平下调结果吻合。

2.6 非必需基因Ac30-31和Ac32-33敲除对病毒基因转录水平变化速度的影响

在转录水平下调、胞内基因组DNA含量降低的双重条件下，vAc-ΔAc30-31、vAc-ΔAc32-33病毒仍表现出一步生长曲线峰值略微上调，且极晚期启动子p10调控的外源蛋白GFP表达量显著升高的特征。为解析这一矛盾现象，本研究检测了24~36 h早期基因（me53、p143）、晚期基因（vlf-1、gp41、orf-75、p6.9）及极晚期基因（p10）。结果（图10）显示，在病毒蛋白表达进入后期阶段时，vAc-ΔAc30-31、vAc-ΔAc32-33病毒的晚期基因与极晚期基因转录水平提升速率显著快于野生型；而外源蛋白GFP由极晚期启动子p10驱动表达，相较于野生型，vAc-ΔAc30-31、vAc-ΔAc32-33病毒在晚期-极晚期转换阶段的转录加速，可更高效地将昆虫细胞的有限资源分配至目的蛋白合成过程。这一机制可能正是转录水平整体下调背景下，倒置荧光显微镜观察到的阳性细胞传播更快、流式细胞术及SDS-PAGE检测证实GFP表达量显著上调的核心原因。

3 讨 论

杆状病毒非必需基因敲除是优化杆状病毒表达载体系统的经典策略。已有研究证实，敲除组织蛋白酶基因和几丁质酶基因（v-cath、chiA）可减少外源蛋白降解^［19］，同时敲除非必需基因p10、p26、p74后重组蛋白表达量显著高于野生型病毒^［21］。本课题组前期的研究表明，整体敲除Ac29~Ac33基因簇可提高外源蛋白产量^［22］，但尚未锁定其中的关键功能基因。而非必需基因簇内部存在功能分化，因此需通过精准敲除才能实现载体的高效优化。

本研究聚焦AcMNPV的Ac29~Ac33非必需基因簇，通过同源重组的方式对5个基因分别单敲除与组合敲除，共得到15种不同的非必需基因敲除型重组杆状病毒。流式细胞术与SDS-PAGE结果表明，除Ac30单基因敲除导致外源蛋白表达严重下调外，其余敲除方式均对外源蛋白表达有正向调控作用。本研究优选出两个对蛋白表达提高最显著的敲除载体vAc-ΔAc30-31和vAc-ΔAc32-33，进一步研究病毒的一步生长曲线与GFP荧光累积效率，发现两种敲除型的病毒复制与蛋白表达能力显著优于野生型。然而转录分析表明，一些影响病毒复制与蛋白表达的关键基因，如早期基因（ie-0、ie-1、ie-2、lef-1、lef-3、lef-8、me53、p143）、晚期基因（vlf-1、gp41、orf-75、p6.9）的转录水平均有所下降，病毒基因组的复制水平也低于野生型。之前有研究表明，AcMNPV中病毒DNA的复制是导致细胞凋亡的直接诱因，而晚期基因表达对细胞凋亡无影响^［23］，Ac30-31和Ac32-33缺失后造成病毒复制相关的表达因子转录水平与病毒基因组含量下降，可能会减少病毒DNA的复制，导致细胞凋亡，使敲除型细胞在晚期的活性优于野生型。本研究检测到病毒从晚期到极晚期转录水平的改变确实存在加速现象，驱动外源蛋白表达的极晚期p10启动子在此阶段表达活性明显提高，但这仍不足以解释敲除载体外源基因蛋白水平提高显著的原因。推测可能是Ac30、Ac31、Ac32、Ac33基因功能缺失解除了其对外源基因表达的抑制。Ac32编码的成纤维细胞生长因子（vFGF）是一种化学诱导剂。Katsuma等^［24］在AcMNPV中的研究发现，vFGF可以与细胞表面受体Sfbtl结合，参与信号通路诱导未感染细胞向感染细胞迁移；Katsuma等^［25］和Detvisitsakun等^［26］研究发现，在AcMNPV中过表达Ac32基因可加速宿主死亡，然而该信号通路是否有其他诱导作用，尤其是在病毒感染晚期的作用尚不清楚。Ac30与色氨酸重复基因家族蛋白的基因具有同源性，蝗灾痘病毒中已报道存在该类同源蛋白^［27］；Ac31与超氧化物歧化酶具有同源性^［28］；Ac33与意大利蜜蜂的多核苷酸激酶-3′-磷酸酶具有显著相似性^［29］。但敲除这些基因似乎都不能支持外源蛋白翻译水平的提高或蛋白稳定性的提高，其分子机制还需要未来进行深入研究。

4 结 论

本研究对AcMNPV的Ac29~Ac33非必需基因簇进行分段敲除，证实了Ac29~Ac33基因簇内所有敲除组合均不影响病毒正常复制，并成功优选出vAc-ΔAc30-31与vAc-ΔAc32-33两种高产杆状病毒表达载体，为工业生产和科学研究提供了更好的选择。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32170164)