SlbZIP1转录因子对番茄灰霉病抗性的调控作用及其下游靶基因筛选验证

Regulation of tomato gray mold resistance by the SlbZIP1 transcription factor and screening and validation of its downstream target genes

摘要

目的 筛选和鉴定番茄bZIP家族SlbZIP1（Solyc01g008730.2.1）基因调控灰霉病抗性的下游靶基因，为进一步研究该转录因子在调控灰霉病抗性方面的功能奠定基础。 方法 通过转录激活试验，确定SlbZIP1基因的转录因子特性；采用 MEGA 7和Clustal W 软件，进行SlbZIP1基因系统发育树构建及序列比对分析。用农杆菌介导法构建过表达SlbZIP1基因的T₃代转基因番茄植株，用其叶片进行灰霉菌接种，验证SlbZIP1基因在灰霉菌侵染过程中的功能；利用DAP-seq 技术在全基因组水平上分析SlbZIP1转录因子识别并结合的DNA元件，结合前期灰霉菌侵染的转录组数据，筛选并验证其作用的下游靶基因。 结果 番茄SlbZIP1基因在酵母中具有明显的转录活性；SlbZIP1基因过表达显著增强了番茄的灰霉病抗性。SlbZIP1转录因子识别并结合的优势DNA元件为TGACGT和ACGTCA，在预测的下游靶基因中发现与病原菌侵染相关的候选靶基因Solyc03g098740.1（Kunitz型胰蛋白酶抑制剂）、Solyc06g053710.3（乙烯受体）、Solyc05g053330.3（MYB转录因子）和Solyc08g150142.1（细胞色素P450），且表达模式与SlbZIP1基因一致，证明这4个潜在靶基因可能与SlbZIP1共同参与对灰霉菌侵染的响应过程。 结论 番茄SlbZIP1转录因子具有明显的转录活性，在番茄应对灰霉菌侵染过程中起正调控作用，其下游潜在靶基因Solyc03g098740.1、Solyc06g053710.3、Solyc05g053330.3和Solyc08g150142.1可能与SlbZIP1基因共同参与对灰霉菌侵染的调控网络。

Abstract

Objective This study aims to screen and identify the downstream target genes regulated by the tomato bZIP family member SlbZIP1 （Solyc01g008730.2.1） in gray mold resistance，thereby laying the foundation for further investigation of the regulatory function of this transcription factor. Method Transcription activation assays determined the transcriptional regulatory properties of SlbZIP1，and phylogenetic tree construction and sequence alignment of SlbZIP1 were performed using MEGA 7 and Clustal W software.Leaves from T₃-generation transgenic tomato plants overexpressing SlbZIP1 via Agrobacterium-mediated transformation were inoculated with Botrytis cinerea to validate the function of this gene during this infection.Using DAP-seq，the DNA elements recognized and bound by the SlbZIP1 transcription factor were analyzed at the genome-wide level.Combined with previous transcriptomic data from B.cinerea infection，the downstream target genes of SlbZIP1 were screened and validated. Result The tomato SlbZIP1 gene exhibits significant transcriptional acti-vity in yeast，and overexpression of this gene significantly enhances resistance to gray mold in tomato.The preferred DNA motifs recognized and bound by the SlbZIP1 transcription factor are TGACGT and ACGTCA. Among the predicted downstream target genes，candidate genes associated with pathogen infection were identified，including Solyc03g098740.1 （Kunitz-type trypsin inhibitor），Solyc06g053710.3 （ethylene receptor）， Solyc05g053330.3 （MYB transcription factor），and Solyc08g150142.1 （cytochrome P450）.Their expression patterns are consistent with that of SlbZIP1，suggesting their potential collaboration with SlbZIP1 in response to B.cinerea infection. Conclusion The tomato SlbZIP1 transcription factor exhibits significant transcriptional activity and plays a positive regulatory role in response to B.cinerea infection.Its potential downstream target genes，Solyc03g098740.1，Solyc06g053710.3，Solyc05g053330.3 and Solyc08g150142.1，may function together with SlbZIP1 in the regulatory network against B.cinerea infection.

Graphical abstract

关键词

番茄 / 灰霉病 / bZIP转录因子 / DNA亲和纯化测序（DAP-Seq） / 靶基因

Key words

tomato / gray mold / bZIP transcription factor / DNA affinity purification sequencing（DAP-seq） / target genes

番茄（Solanum lycopersicum L.）是主要的园艺蔬菜作物之一，全国种植面积达111万hm²，占据全国蔬菜产量榜首^［1］。番茄灰霉病是一种由灰霉菌（Botrytis cinerea）引起的典型腐生型真菌病害^［2］。该病害具有流行性强、发生普遍、危害性大等特点^［3］。设施内高湿、密闭的环境更容易导致番茄灰霉病的发生，极大地降低了番茄的产量和品质，减少了种植农户的经济收入，制约着番茄产业的持续健康发展。深入挖掘番茄灰霉病抗性关键基因并解析其分子机制，对于创制优质抗病番茄新种质、培育新品种、促进农业高效发展具有重要意义。

bZIP（basic region/leucine zipper）转录因子家族是真核生物中最大的转录因子家族之一，其成员均包含2个特征结构域：碱性DNA结合结构域和亮氨酸拉链结构域^［4］。依据碱性DNA结合结构域序列的相似性和保守结构域特征，可以将该转录因子家族具有相似功能的成员进行归类。拟南芥中bZIP转录因子被划分为A、B、C、D、E、F、G、H、I及S等10个亚家族^［5］。不同家族成员在植物生命活动过程中发挥着不同的作用，其中D亚族bZIP转录因子不仅调节根系的生长、胁迫应答、开花调节等多种生理过程，而且在植物病原体防御反应方面有重要作用。例如：水稻中OsbZIP73（OsTFX1）基因的异位表达会提高对白叶枯病的感病性^［6］，而OsbZIP639（rTGA2.1）基因^［7］和OsbZIP1^［8］基因通过水杨酸途径分别正向调控对白叶枯病和稻瘟病的抗性；西洋参PqbZIP1基因可以介导茉莉酸、水杨酸和脱落酸信号通路调节根腐病抗性^［9］；木薯中过表达MebZIP3和MebZIP5基因能够增强植株对细菌性枯萎病的抗性^［10］；杨树PopbZIP2基因激活下游防御基因PopAPA1直接抑制胶孢炭疽菌生长^［11］；在拟南芥中，vip1基因突变体及其SRDX抑制株^［12］与tga256基因突变体^［13］均表现出对灰霉病的感病表型；草莓FabZIP46基因过表达能增强其对灰霉病的抗性^［14］；月季中的RcTGA1、RcTGA2、RcTGA5和RcTGA7基因受灰霉菌诱导表达，且用VIGS沉默RcTGA2基因可增强植株对灰霉菌的抗性^［15］；黄瓜CsbZIP120基因在拟南芥中异源过表达后能显著增强其对灰霉病的抗性^［16］；玫瑰RhbZIP17基因能增强其对灰霉病的抗性^［17］。由此可见，bZIP家族基因在灰霉菌侵染防御反应中具有重要作用^［18］。

此外，bZIP转录因子在发挥重要防御反应作用的过程中，能够识别并特异结合含有TGACG核心序列的调控元件，并结合调控靶基因的转录^［19］。Johnson等^［20］研究发现，TGA转录因子可通过两种机制调控植物免疫反应，即可直接结合PR1基因启动子区的AS-1（activation sequence 1）顺式作用元件以激活防御响应，或通过与水杨酸和茉莉酸信号通路的关键调控因子NPR1（non-expresser of pathogenesis-related gene 1）互作来调控免疫反应，从而间接启动PR基因表达，增强植物抗病性^［21-22］。

然而，目前有关番茄bZIP家族成员及其靶基因调控其灰霉病抗性的研究还鲜有报道。本研究先采用生物信息学方法对番茄bZIP家族D亚家族成员SlbZIP1基因进行系统分析，再分析SlbZIP1基因启动子元件，并通过酵母试验验证其转录活性。在此基础上，检测SlbZIP1基因过表达T₃代番茄对灰霉菌侵染的抗性，并利用DNA亲和纯化测序（DNA affinity purification sequencing，DAP-seq）结合前期灰霉菌侵染转录组数据进行联合分析，以初步明确SlbZIP1基因的转录活性、灰霉抗病性及其下游作用的候选靶基因，阐明番茄SlbZIP1基因对灰霉病抗性的调控机制，为后续具体的调控网络研究和培育抗病番茄品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试番茄品种为‘Moneymaker’（种子由宁夏大学葡萄酒与园艺学院冷凉蔬菜分子育种研究所提供），其种子经催芽后播种于含有草炭土与蛭石混合基质（体积比3∶1）的营养钵中。幼苗置于光照培养箱（陕西华屹仪器，陕西杨凌）内培养，条件设置为：昼/夜温28/22 ℃、光周期16 h光照/8 h黑暗、光照强度2000 lx、相对湿度80%~90%。于三叶一心期取叶片样品，于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 SlbZIP1基因系统进化树构建

分别从在线网站 TAIR10.0（https：//www.arabidopsis.org/）、Cucurbit Genomics Database和Sol Genomics Network（https：//solgenomics.sgn.cornell.edu/）下载模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）、黄瓜（Cucumis sativus L.）、番茄（Solanum lycopersicum L.）和辣椒（Capsicum annuum L.）D亚族bZIP基因的核苷酸序列，通过Clustal W软件进行序列比对，并利用MEGA 6.0软件中的邻接法（neigbor-joining method，NJ）构建系统进化树，设置自展检验（bootstrap）重复1 000次。

1.2.2 番茄D亚组bZIP转录因子在灰霉菌侵染中的表达模式

利用实验室前期测定的灰霉菌侵染‘Moneymaker’番茄的转录组数据，对D亚组的bZIP基因的表达量（FPKM）进行筛选，并制作热图。

1.2.3 SlbZIP1基因克隆与过表达载体构建

从番茄数据库（https：//solgenomics.net）下载番茄转录因子SlbZIP1基因的编码区序列，设计带接头的特异性扩增引物（表1）。提取‘Moneymaker’番茄叶片的总RNA，通过反转录获得的cDNA，以cDNA为模板，用高保真HS聚合酶（TaKaRa生物技术，中国大连）扩增SlbZIP1基因的编码区序列，回收PCR产物，参照一步克隆试剂盒说明书连接至P2301-35SN载体，构建过表达载体P2301-35SN-SlbZIP1。将构建的过表达载体转化至DH5α感受态细胞后，涂布于含相应抗生素的LB平板，37 ℃倒置培养12~16 h。挑取单菌落，PCR验证后，将阳性克隆送交奥科测序部（北京鼎盛生物科技有限公司）进行测序，保留测序正确的质粒。

1.2.4 番茄过表达SlbZIP1基因植株获得及抗病性鉴定

测序正确的载体转入农杆菌GV3101，进行番茄遗传转化。经抗性筛选及PCR检测（检测引物见表1）后确定阳性转化株，连续种植并自交获得T₃代过表达转基因株系（OE1、OE2）。选取三叶一心大小的番茄野生型（WT）及转基因株系（OE1、OE2）幼苗，参照Yang等^［23］的方法进行灰霉菌接种，观察植株叶片侵染进程，并于接种后0，2，3，4 d使用相机（索尼 ILCE-6400L，中国）进行相片采集，同时使用Image J（ImageJ 1.X，美国）软件测定侵染面积。

提取野生型（WT）和SlbZIP1基因过表达（OE1、OE2）番茄植株叶片总RNA并反转录为cDNA，以此为模板，采用表1所示引物进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR），分析候选靶基因在转基因和野生型植株中的表达差异。以番茄SlUBi基因为内参基因，使用2^－ΔΔCt 方法计算基因相对表达量，每个处理设置3次重复。

1.2.5 SlbZIP1基因转录活性分析

以pGBKT7-p53（实验室前期构建）为阳性对照，将对照质粒及构建正确的酵母表达载体pGBKT7-SlbZIP1（实验室前期构建）分别转化Y2H Gold 酵母细胞，挑取单克隆进行活化。活化后的菌液按照一定浓度梯度进行稀释，涂布于含x-α-gal（40 μg/mL）的SD/-Trp培养基，30 ℃倒置培养3~5 d后，观察酵母显色情况。

1.2.6 DAP-seq分析

为进一步筛选候选靶基因，首先将前期灰霉菌侵染‘Moneymaker’番茄的转录组数据中显著上调（|log₂FC|>2）且和植物激素合成与信号转导、植物‑病原互作、MAPK信号及谷胱甘肽代谢相关的差异基因，与DAP-seq注释为启动子区的基因取交集。随后依据以下3个条件进行进一步筛选：（1）Peak score>45；（2）结合元件核心序列为TGAC/TG/ATCA；（3）元件位于基因启动子区内。

选取生长一致三叶一心大小健壮的番茄植株，采集地上部叶片送往武汉康测科技有限公司（https：//www.seqhealth.cn）进行 DAP-seq。提取‘Moneymaker’番茄叶片DNA，利用超声对DNA进行片段化，并进行DNA片段末端修复、加A、加接头处理。同时构建带标签的体外表达载体pUC57-SlbZIP1，在体外进行蛋白表达及纯化。将纯化后的转录因子-亲和标签融合蛋白与基因组DNA文库共孵育，随后通过HaloTag特异性磁珠富集蛋白-DNA复合物，纯化后对捕获的DNA片段进行PCR扩增，并使用Illumina平台测序。

对2个技术重复样本及input对照组测序得到的原始数据进行过滤，得到高质量序列（clean data）后，将其比对至番茄参考基因组并进行全基因组峰值识别（peak calling）分析，以鉴定蛋白结合峰。进一步分析峰在基因组上的分布特征与序列信息，探究其结合偏好，并对结合位点进行基序（motif）分析。

1.2.7 候选基因的RT-qPCR验证

对筛选所得SlbZIP1基因候选靶基因做进一步验证。在获得的SlbZIP1基因过表达番茄株系（OE1、OE2）及野生型（WT）番茄植株中进行候选靶基因（Solyc03g098740.1、Solyc06g053710.3、Solyc05g053330.3、Solyc08g-150142.1）表达的RT-qPCR分析，试验方法同1.2.4节。

1.3 数据统计分析

采用GraphPad Prism 5（美国）整理试验相关数据并作图；采用 IBM SPSS Statistics 27（美国）软件进行one-way ANOVA 统计分析。

2 结果与分析

2.1 番茄SlbZIP1基因系统进化树

分别从在线网站上下载拟南芥（10个）、番茄（12个）、黄瓜（15个）和辣椒（9个）D亚族bZIP基因的核苷酸序列，将这些序列进行比对，构建SlbZIP1基因系统进化树，结果见图1。

由图1可知，SlbZIP1基因与SlbZIP73基因隶属于同一分支，且与黄瓜中的CsbZIP50基因具有较高的同源性，亲缘关系最近。

2.2 番茄D亚组bZIP转录因子在灰霉菌侵染中的表达模式

试验结果（图2）显示，编码bZIP转录因子的基因Solyc01g110480.4、Solyc01g079480.3、Solyc-01g109880.3、Solyc-04g082890.3、Solyc08g005290.3、Solyc01g008730.3（SlbZIP1）等能响应灰霉菌的侵染并显著上调表达，而Solyc05g009660.4、Solyc05g010516.1、Solyc02g089420.1、Solyc03g046440.3等基因在灰霉菌侵染下显著下调表达。

2.3 番茄SlbZIP1基因对灰霉菌侵染的抗性

菌落PCR验证和测序鉴定结果表明，过表达载体P2301-35SN-SlbZIP1构建成功。以番茄‘Moneymaker’野生型（WT）植株为对照，通过过表达SlbZIP1基因植株（OE1、OE2）和野生型植株叶片灰霉孢子悬浮液定量接种的方法进行抗病性分析，接种后的发病情况如图3-A所示。叶片在接种后2 d时均出现水渍症状，后发病部位面积随着侵染时间的增加而逐渐扩大；叶片在接种后4 d时均出现典型的腐烂现象。但叶片病斑面积统计结果发现，在接种3和4 d时，过表达SlbZIP1基因的叶片侵染面积均显著小于野生型（图3-B），表现出显著增强的灰霉抗病性。

连续自交后获得T₃代纯合过表达株系OE1和OE2，RT-qPCR检测结果显示，OE1和OE2株系中SlbZIP1基因的表达量均显著高于野生型WT（图3-C），可用于后续功能分析。

2.4 SlbZIP1基因转录活性分析

为证实SlbZIP1基因的转录因子特性，以 pGBKT7-p53为阳性对照，通过酵母转化试验分析了SlbZIP1基因的转录活性。结果（图4）显示，pGBKT7-SlbZIP1在含有x-α-gal的SD/-Trp培养基上能长出蓝色菌斑，表明SlbZIP1基因具有转录激活活性。

2.5 番茄SlbZIP1基因功能的DAP-seq分析

采用DAP-seq技术对SlbZIP1基因的功能进行分析。结果显示，在P<0.01阈值下，SlbZIP1基因两个生物学重复中共鉴定到70 260个共有结合峰（图5-A）。

这些峰主要分布于转录起始位点（TSS）上游2 000 bp以内的启动子区域（图5-B）；在染色体上分布相对均匀，其中1和3号染色体分布较多（图5-C）。同时，基因组区域分布显示，结合峰主要分布于基因间区（79.94%）、启动子区（10.98%）和内含子区（4.57%）（图5-D）。通过MEME对峰序列进行基序（motif）分析，鉴定出的2个最显著基序分别为［G/A/C/T］［A/G］TGACGT［A/C］［A/T］（基序1）和［T/A］［G/C］ACGTCA［T/C］［T/A/C］（基序2）（图5-E）。

2.6 番茄SlbZIP1基因对灰霉菌响应的候选靶基因筛选及验证

试验最终获得11个SlbZIP1调控的下游候选靶基因（表2），其中包括4个植物激素信号与MAPK通路相关基因、3个植物‑病原互作相关基因、1个谷胱甘肽代谢相关基因、1个JA合成相关基因、1个激素信号传导相关基因及1个生物大分子合成相关基因。

RT-qPCR结果表明，候选靶基因Solyc03g098740.1（Kunitz型胰蛋白酶抑制剂）、Solyc06g053710.3（乙烯受体）、Solyc05g053330.3（MYB转录因子）和Solyc08g150142.1（细胞色素P450）与SlbZIP1基因具有相似的表达模式（图6），这一结果初步明确了基因Solyc03g098740.1、Solyc06g053710.3、Solyc05g053330.3和Solyc08g150142.1为SlbZIP1基因的候选靶基因。

3 讨论

bZIP转录因子D亚族成员广泛参与种子成熟、休眠、发育与衰老等过程^［24］，并在盐、旱、冷、渗透及机械损伤等非生物胁迫响应中发挥关键作用^［25］，同时也参与植物对病原菌的防御反应^［26］。本试验以响应灰霉菌侵染的番茄D亚组成员SlbZIP1基因为研究对象，通过系统进化分析、转录活性鉴定、过表达植株抗病性评价及DAP-seq联合转录组分析，初步揭示其在响应灰霉菌侵染中的正调控作用及可能靶基因，为深入研究该基因的功能提供了依据。

3.1 SlbZIP1基因的抗病功能

转录因子的核心功能就是具备转录活性。本研究发现，SlbZIP1基因在酵母中具有明显的转录激活活性，这与前人在其他园艺作物中的研究结果一致。例如：Bai等^［27］通过酵母杂交系统发现，大白菜bZIP转录因子BrABI5a和BrABI5b具有转录激活能力，同样的结果在冬瓜^［28］、甘薯^［29］、胡萝卜^［30］、小麦^［31］、、水稻^［32］、拟南芥^［33］中得到证实，但是验证使用的方法不同，在水稻和拟南芥中均使用双荧光素酶报告系统进行转录活性验证。

具有转录活性的bZIP转录因子才能作为功能性转录因子发挥作用，行使相应的功能，而参与抗灰霉病防御反应是其主要的功能之一。如草莓^［14］果实中瞬时过表达FabZIP46基因后，与对照组相比，果实组织损伤程度明显减轻，病害发生率也显著降低，而利用RNAi技术沉默FabZIP46基因的表达则导致了相反的效果；灰霉菌侵染玫瑰后RhbZIP17基因上调表达，其与互作蛋白促进木质素积累限制了灰霉病菌的侵染与扩展，增强了玫瑰花瓣对该病原菌的抗性^［17］；Zander等^［13］研究显示，拟南芥TGA2/5/6基因的表达增强了其对灰霉菌的抗性；Wang等^［34］发现，葡萄柚VvTGA1基因能响应抗灰霉病反应。这些结果与本试验中过表达SlbZIP1基因增强番茄对灰霉病抗性的结果一致，表明SlbZIP1基因是番茄抵御灰霉病侵染的正向调控因子。然而这与其他一些bZIP转录因子在抗病反应中的功能相反，例如Tian等^［35］的研究显示，甜瓜CmTGA7、CmTGA9基因在拟南芥中异源过表达后，与野生型相比，转基因拟南芥对灰霉菌的抗性降低，表明CmTGA7和CmTGA9基因负调控灰霉菌的防御响应。这种不一致有可能是异源表达所致，CmTGA7和CmTGA9基因未在甜瓜中进行稳定的遗传转化及抗病性鉴定。另外一种可能性就是bZIP转录因子双向调控灰霉病抗性，至于其究竟是正向调控还是负向调控，还需要通过试验进行验证。本研究表明，SlbZIP1基因是番茄抵御灰霉病侵染的正向调控因子。

3.2 SlbZIP1基因的下游靶基因

本研究通过DAP-seq技术在全基因组范围内鉴定SlbZIP1基因的结合位点，发现其优先结合的DNA元件为TGACGT和ACGTCA，与经典TGA类转录因子识别的TGACG序列高度相似^［19-20］。转录因子功能的发挥依赖于对下游靶基因的精准调控。研究表明，bZIP转录因子可与下游靶基因顺式作用元件结合调控生物学过程及病原菌胁迫响应。例如：木薯中的MeTGA9.3蛋白可结合下游氮转运相关NRT1家族成员调控氮高效转运/利用^［36］；拟南芥AtbZIP10蛋白通过结合G-box与C-box顺式作用元件，负向调控植株对病原菌的抗性^［37］。本研究通过DAP-seq结合前期转录组数据筛选了4个受SlbZIP1基因调控的候选靶基因，即Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因（Solyc03g098740.1）、乙烯受体基因（Solyc06g053710.3）、MYB转录因子（Solyc05g053330.3）和细胞色素P450基因（Solyc08g150142.1），其与抗病反应密切相关。

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因是植物防御反应中的重要效应分子，通过特异性结合病原菌分泌蛋白酶的活性位点，形成稳定复合物抑制其水解活性，从而干扰灰霉菌对植物细胞壁的降解过程。研究发现，从马铃薯中分离的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂可通过直接抑制灰霉菌分泌的蛋白酶，有效阻断其孢子萌发、菌丝伸长及病斑扩展^［38］。MYB转录因子作为植物防御反应的关键调控枢纽，在灰霉菌抗性中发挥核心作用。该类转录因子通过其保守的SANT结构域识别，并结合防御基因启动子中的顺式作用元件，精准调控下游抗病基因的表达。例如，芥菜MYB转录因子BjMYB1通过激活防御基因BjCHI1的表达，增强对灰霉菌的抗性^［39］，而番茄中的SlMYB1基因则被证实可直接结合抗病基因SlPR5的启动子，共同介导对灰霉菌的诱导抗性^［40］。细胞色素P450在植物与病原菌互作中表现出双重功能：在寄主植物中，P450单加氧酶参与植保素、木质素等抗菌物质的生物合成，强化化学屏障；而在灰霉菌中，其特定编码基因（如cyp684基因）在杀菌剂存在时上调表达，降低病原菌对多种杀菌剂的敏感性，导致灰霉菌形成多重抗药性^［41］。乙烯受体基因通过整合衰老进程与激素信号平衡来调控植物抗病性，乙烯信号途径与茉莉酸途径通过交互作用共同影响防御反应。研究表明，乙烯受体基因（etr1-1）突变可引发矮牵牛对乙烯不敏感，从而通过以下双重机制影响植株对灰霉菌的耐受性：一方面，延缓叶片衰老以维持组织代谢活性，为防御反应提供物质与能量基础；另一方面，促进乙烯信号通路与茉莉酸信号通路的协同互作，强化两条通路介导的防御反应并增强防御基因表达^［42］。

综上所述，这4个靶基因与灰霉菌响应密切相关。因此，本研究进一步分析了过表达SlbZIP1基因株系中上述基因的表达模式，发现其表达变化与SlbZIP1基因高度一致。这一结果不仅证实了其与SlbZIP1基因的关联，也进一步支持其作为SlbZIP1基因靶基因的可能性。类似地，前人研究已表明，bZIP（又被称为TGA）转录因子可通过直接结合PR1基因或通过与NPR1互作，间接启动PR基因表达，从而调控植物对病原菌的防御响应^［21-22］。例如：Fan等^［43］研究发现，拟南芥中bZIP转录因子TGA2（AHBP-1B）可直接结合PR基因启动子参与系统获得性抗性（SAR）的建立；Miyamoto等^［32］研究发现，水稻中的OsTGAP1基因通过直接靶向MEP途径关键酶基因OsDXS3，增强水稻植株对病原菌的化学防御；Lambou等^［44］研究表明，稻瘟病菌自身的bZIP转录因子BIP1通过结合靶基因启动子中的GCN4/bZIP基序（TGACTC），直接调控侵染早期相关基因的表达，从而建立初生侵染。本研究发现的响应灰霉菌侵染的4个潜在靶基因，不仅为SlbZIP1基因调控抗病提供了更多潜在的直接靶基因，也可能作为SlbZIP1基因介导抗病调控网络中的新节点，为进一步解析其分子机制提供了重要线索。

4 结论

研究使用DAP-seq技术预测番茄bZIP转录因子D亚族成员SlbZIP1结合位点，结合前期转录组数据联合分析筛选出响应番茄灰霉菌侵染的4个潜在靶基因，分别为Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因（Solyc03g‐098740.1）、乙烯受体基因（Solyc06g053710.3）、MYB转录因子（Solyc05g053330.3）及细胞色素P450（Solyc08g150142.1）基因。这4个潜在靶基因均与病原菌的响应有关，推测其可与SlbZIP1基因相互作用共同响应番茄灰霉菌侵染。

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基金资助

宁夏回族自治区重点研发引才专项(2025BEH04010)

宁夏回族自治区科技创新团队建设方案(2024CXTD010)