6种生防菌对甜瓜ZYMV的防治效果

Control efficacy of six biocontrol bacteria against ZYMV in melon

摘要

目的 明确6种生防菌L1、LZ1-4、BYZ3-6、DM3-18、DM5-29和XYK2-4对小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）的预防和治疗效果，筛选预防和治疗效果最佳的生防菌及最佳喷施时间，为ZYMV的绿色高效防治提供科学依据和新途径。 方法 以‘灯笼红’甜瓜为试验材料，在接种ZYMV前后24，48和72 h分别喷施生防菌L1、LZ1-4、BYZ3-6、DM3-18、DM5-29和XYK2-4，以喷施LB液体培养基为对照（CK）。待对照甜瓜发病率达到100%时，调查各生防菌处理甜瓜ZYMV的发病率，计算病情指数和相对防效并进行生防菌筛选；测定不同处理甜瓜的株高和茎粗，采用RT-qPCR测定ZYMV的相对载量和LOX1的相对表达量。 结果 生防菌LZ1-4、DM3-18和L1对ZYMV的防治效果较佳，且在接种ZYMV前后24 h喷施的预防和治疗效果显著优于接种前后48和72 h，其中LZ1-4对甜瓜ZYMV的预防效果最佳，相对防效为88.9%；DM3-18对甜瓜ZYMV的治疗效果最佳，相对防效为90.8%。接种ZYMV前后24 h喷施生防菌对甜瓜的促生效果最佳，其中接种ZYMV前24 h喷施LZ1-4，接种60 d时甜瓜株高较CK提高70.6%，茎粗较CK增加15.5%；接种ZYMV后24 h喷施DM3-18，接种60 d时甜瓜株高较CK提高57.5%，茎粗较CK增加11.8%。接种ZYMV前24 h喷施LZ1-4，甜瓜叶片在各时间点ZYMV相对载量均最低，接种后20~50 d，相对载量均显著低于CK；接种后20 d时抑制率最高，为77.9%；至60 d时，抑制率仍高达53.9%。表明生防菌LZ1-4 对ZYMV相对载量的抑制效果最佳。接种ZYMV后24 h喷施DM3-18，甜瓜叶片在各时间点ZYMV相对载量均较低，接种后20~50 d，其相对载量均显著低于CK；接种后20 d时抑制率最高，为75.8%；至60 d时，抑制率为31.9%。表明生防菌DM3-18对ZYMV相对载量的抑制效果最佳。接种ZYMV前24 h喷施LZ1-4，甜瓜叶片LOX1相对表达量在各时间点均较高，且显著高于CK；接种20 d时LOX1相对表达量达到峰值，为CK的61.4倍，至60 d时，仍维持在31.7倍。表明生防菌LZ1-4在持续诱导LOX1表达方面表现更优。接种ZYMV后24 h喷施DM3-18，甜瓜叶片LOX1相对表达量在各时间点均较高，且显著高于CK；接种30 d时LOX1相对表达量达到峰值，为CK的61.3倍，至60 d时，仍维持在31.7倍。表明生防菌DM3-18在持续诱导LOX1表达方面表现更优。 结论 对ZYMV预防和治疗效果最佳的生防菌分别为LZ1-4和DM3-18，在接种ZYMV前24 h喷施LZ1-4的预防效果最佳，相对防效为88.9%；在接种ZYMV后24 h喷施DM3-18的治疗效果最佳，相对防效为90.8%。接种ZYMV前后24 h分别是预防和治疗的最佳时间。

Abstract

Objective This study aims to evaluate the preventive and therapeutic efficacy of six biocontrol bacteria （L1，LZ1-4，BYZ3-6，DM3-18，DM5-29，and XYK2-4） against zucchini yellow mosaic virus （ZYMV），and to identify the strains with optimal efficacy and their best application timing，thereby providing a scientific basis and a novel approach for the green and efficient control of ZYMV. Method Using ‘Lantern Re’ melon as the test material，six biocontrol bacteria L1，LZ1-4，BYZ3-6，DM3-18，DM5-29，and XYK2-4 were sprayed at 24，48，and 72 h before and after ZYMV inoculation，with LB liquid medium sprayed as the control （CK）.When the incidence rate of ZYMV in the control reached 100%，the incidence rates in each biocontrol bacterial treatment were investigated，and the disease index and relative control efficacy were calculated for biocontrol bacteria screening.Plant height and stem diameter of melon plants under different treatments were measured，while the relative viral load of ZYMV and the relative expression level of LOX1 were determined by RT-qPCR. Result Biocontrol bacteria LZ1-4，DM3-18，and L1 exhibited superior control efficacy against ZYMV，and their preventive and therapeutic efficacy of spraying at 24 h before and after ZYMV inoculation were significantly better than those at 48 and 72 h.Among them，LZ1-4 showed the best preventive efficacy against ZYMV in melon，with a relative control efficacy of 88.9%，whereas DM3-18 provided the best therapeutic efficacy，with a relative control efficacy of 90.8%.Spraying biocontrol bacteria at 24 h before and after ZYMV inoculation produced the optimal growth-promoting effect on melon.In particular，application of LZ1-4 at 24 h before inoculation increased plant height by 70.6% and stem diameter by 15.5% compared to CK at 60 d post-inoculation，whereas application of DM3-18 at 24 h after inoculation increased plant height by 57.5% and stem diameter by 11.8% compared to the control.For LZ1-4 sprayed 24 h before ZYMV inoculation，the relative viral load in leaves was consistently the lowest across all time points，and was significantly lower than that of CK from 20 to 50 d post-ino-culation.The inhibition rate peaked at 77.9% at 20 d and remained at 53.9% at 60 d，indicating its optimal efficacy in suppressing ZYMV relative viral load.For DM3-18 sprayed at 24 h after ZYMV inoculation，the relative viral load in leaves remained relatively low across all time points and was significantly lower than that of CK from 20 to 50 d post-inoculation.The inhibition rate peaked at 75.8% at 20 d and was 31.9% at 60 d，indicating its optimal efficacy in suppressing ZYMV relative viral load.For LZ1-4 sprayed 24 h before ZYMV inoculation，the relative expression level of LOX1 in leaves was consistently high across all time points and significantly higher than that of CK，peaking at 61.4 times that of CK at 20 d and remained at 31.7 times that of CK at 60 d，indicating that LZ1-4 performed better in continuously inducing LOX1 expression.For DM3-18 sprayed 24 h after ZYMV inoculation，the relative expression level of LOX1 in leaves was consistently high across all time points and significantly higher than that of CK，peaking at 61.3 times that of CK at 30 d and remained at 31.7 times that of CK at 60 d，indicating that DM3-18 performed better in continuously inducing LOX1 expression. Conclusion The biocontrol bacteria with the optimal preventive and therapeutic efficacy against ZYMV were LZ1-4 and DM3-18，respectively.The optimal preventive efficacy was achieved by spraying LZ1-4 at 24 h before ZYMV inoculation，with a relative control efficacy of 88.9%，whereas the optimal therapeutic efficacy was achieved by spraying DM3-18 at 24 h after inoculation，with a relative control efficacy of 90.8%.Therefore，24 h before and after ZYMV inoculation were identified as the optimal timings for prevention and therapy，respectively.

Graphical abstract

关键词

甜瓜 / 小西葫芦黄花叶病毒 / 生防菌 / LOX1基因 / 防治效果

Key words

melon / zucchini yellow mosaic virus （ZYMV） / biocontrol bacteria / LOX1 gene / control efficacy

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科（Cucurbitaceae）黄瓜属（Cucumis）一年蔓生草本水果^［1］，不仅口感清甜多汁，还含有多种对人体有益的营养成分。我国是甜瓜生产大国，根据FAO数据库（http：//www.fao.org/faostat）统计，2023年世界甜瓜种植面积为109.2万hm²，产量为2 954.1万t；我国甜瓜种植面积为39.2万hm²，产量为1 445.5万t，分别占世界甜瓜种植面积和产量的35.9%和48.9%，均居世界首位。‘灯笼红’甜瓜是内蒙古自治区巴彦淖尔市五原县的地标品种，由于成熟时瓜像一盏灯笼而得名，入选全国名特优新农产品名录，获得国家农产品地理标志认证^［2］。

小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员^［3］，其侵染的植物会产生花叶、黄化、叶片皱缩、果肉变硬并裂开等症状，发展到后期叶片边缘变为锯齿状，种子变形且发芽率下降，直至凋萎死亡^［4］。近几年‘灯笼红’甜瓜因感染ZYMV造成产量降低和品质下降的问题越发突出。目前ZYMV防治主要以化学药剂为主，但化学防治造成的大量农药残留、环境污染等问题越来越严重，并对食品安全造成了极大的隐患^［5］。近年来，研究发现多种芽孢杆菌具有防治马铃薯Y病毒属病毒的潜力，叶面喷施蕈状芽孢杆菌（Bacillusmycoides）可将西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus，WMV）的病情严重度降低87%，同时株高和茎干质量均显著提升^［6］。然而，关于生防菌防治ZYMV的研究报道甚少。基于此，本研究针对‘灯笼红’甜瓜ZYMV的防治开展了生防菌筛选研究，综合评价6种生防菌对ZYMV的防治效果，旨在为甜瓜ZYMV的生物防治和生防菌制剂开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物

‘灯笼红’甜瓜种子，由内蒙古鑫禾昌农业科技有限公司提供。

1.1.2 毒

源　ZYMV侵染性克隆（ZYMV42-25）和空载体pCB301，均由内蒙古农业大学园艺与植物保护学院果树保护实验室保存。

1.1.3 生防菌

供试6种生防菌分别为耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）XYK2-4（保存号：CGM-CC NO.28732）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）DM3-18^［7］、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）L1（保存号：CGMCC NO. 14373）、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）DM5-29^［7］及解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） XZ3-6（保存号：CGMCC NO.25051）和LZ1-4（保存号：CGMCC NO.25340），依次简称为XYK2-4、DM3-18、L1、DM5-29、XZ3-6、LZ1-4，其中XYK2-4、L1、XZ3-6和LZ1-4均保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，DM3-18和DM5-29均由内蒙古农业大学园艺与植物保护学院果树保护实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 育

苗　‘灯笼红’甜瓜种子在28 ℃恒温箱内催芽，出苗后播种于直径为6.5 cm的育苗钵，基质为经过消毒灭菌的商品基质，出苗后放置在人工气候室，于三叶一心期移栽至内蒙古农业大学温室中继续培养。甜瓜生长条件为日温28 °C/夜温18 °C，相对湿度65%，光照16 h/黑暗8 h。

1.2.2 农杆菌（GV3101）菌液活化与扩繁

将150 mL YEB液体培养基、90 μL卡那霉素（50 μg/mL）、90 μL利福平（50 μg/mL）和300 μL MgSO₄混匀。取50 μL侵染性cDNA克隆菌液加入1 mL含抗生素的YEB液体培养基中并混匀，28 ℃、180 r/min活化16~24 h。以体积比1∶30的比例混匀活化菌液与含抗生素的YEB液体培养基，28 ℃、180 r/min扩繁16~24 h。

1.2.3 ZYMV注射接种

用MES接种缓冲液重悬空载体pCB301和ZYMV42-25侵染性克隆，调整其OD₆₀₀为0.800。在甜瓜第1片真叶长出前，用去掉针头的1 mL注射器针管将0.5 mL菌液注射到2片子叶中。注射接种后暗处理8 h，移至相对湿度60%、光照16 h/黑暗8 h的人工气候室中继续培养。

1.2.4 生防菌液活化

在超净工作台中迅速取一小块菌体放入NA培养基中，用涂布器将菌体均匀涂开，放入28 ℃恒温培养箱中培养1~2 d，挑取单菌落于5 mL LB液体培养基中，28 ℃、120 r/min振荡培养48 h，调整菌液OD₆₀₀为1.200。

1.2.5 引物选择

ZYMV检测引物、ZYMV-CP相对载量和LOX1相对表达量的定量引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息详见表1。

1.2.6 叶片总RNA提取、cDNA合成及ZYMV检测

使用M5 HiPer Plant RNeasy Complex Mini KIT试剂盒（北京聚合美生物科技有限公司）提取甜瓜叶片总RNA。以提取的总RNA为模板反转录合成cDNA，以cDNA为模板PCR扩增ZYMVCP基因。PCR扩增体系为：2×M5 Hiper超光速mix（北京聚合美生物科技有限公司）10.0 µL，上游引物ZYMV-F和下游引物ZYMV-R各1.0 µL，cDNA 1.0 µL，添加ddH₂O至20.0 µL。PCR扩增程序：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min；12 ℃恒温保存2 min。PCR扩增结束后用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.3 6种生防菌对ZYMV的预防和治疗效果

1.3.1 6种生防菌对ZYMV的预防效果

在甜瓜播种第8天分别喷施LB液体培养基（对照，CK）和6种生防菌10 mL/株，在喷施后24，48和72 h分别接种ZYMV42-25，6次生物学重复。统计发病率和相对防效。

1.3.2 6种生防菌对ZYMV的治疗效果

在甜瓜播种第8天接种ZYMV42-25，分别在接种后24，48和72 h喷施LB液体培养基（对照，CK）和6种生防菌10 mL/株，6次生物学重复。统计发病率和相对防效。

1.3.3 ZYMV发病情况调查及防治效果分析

当对照甜瓜的发病率达到100%时，调查6种生防菌处理后甜瓜叶片的发病情况，统计发病率并计算病情指数及相对防效。参照古勤生^［11］的方法，将发病等级分为0~4级：0级，无症状；1级，只表现褪绿斑或明脉；2级，轻度花叶，无蕨叶；3级，严重花叶，无蕨叶；4级，严重花叶和蕨叶，叶片畸形。

发病率=（发病株数/调查总株数）×100%；

病情指数=∑（发病叶片数×病毒等级值）/（调查单株总叶片数×最高病毒等级值）×100；

相对防效=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。

基于前期甜瓜ZYMV的发病率和生防菌的防治效果，从6种生防菌中筛选出3种防治效果较优的生防菌L1、LZ1-4和DM3-18，后续分析喷施这3种生防菌对甜瓜生长、ZYMV相对载量以及LOX1相对表达量的影响，筛选对甜瓜ZYMV防治效果最佳的生防菌。

1.4 3种生防菌对甜瓜生长的影响

在接种ZYMV前后24 h分别配施生防菌L1、LZ1-4和DM3-18，并在接种ZYMV42-25后20，30，40，50和60 d测量甜瓜的株高和茎粗，其中株高用卷尺测量（子叶节至主茎生长点的长度），茎粗用游标卡尺测量。试验以接种ZYMV前后24 h喷施LB液体培养基的处理为对照（CK）。

1.5 3种生防菌对甜瓜叶片中ZYMV相对载量和LOX1相对表达量的影响

以接种ZYMV42-25阳性的甜瓜叶片cDNA为模板，以β-Actin为内参基因，进行实时荧光定量PCR，获得各时间点的Ct值。计算接种ZYMV后20，30，40，50和60 d时，3种生防菌L1、LZ1-4和DM3-18处理下，甜瓜叶片中CP的相对表达量（病毒相对载量）及LOX1的相对表达量，利用2^-ΔΔCt 法^［12］对不同处理甜瓜叶片中ZYMV相对载量和LOX1相对表达量进行定量分析。对照设置同1.4节。

1.6 数据处理与分析

用Microsoft excel 2010、Graphpad prism和SPSS 22进行数据统计分析，用单因素ANOVA检测和TurkeyHSD’s多重比较分析处理间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 ZYMV侵染检测

RT-PCR结果（图1）显示，接种ZYMV42-25的甜瓜均在463 bp处检测到CP基因特异性条带，而接种空载体（pCB301）的甜瓜未检测到特异性条带。试验结果表明，ZYMV已经侵染成功。

2.2 6种生防菌对ZYMV的预防效果

由表2可知，与CK相比，接种前24 h喷施不同生防菌均可显著抑制甜瓜ZYMV的发病率和病情指数，相对防效从高到低依次为LZ1-4（88.9%）>DM3-18（85.2%）>L1（81.5%）>XYK2-4（77.7%）>DM5-29（76.0%）>XZ3-6（52.8%）。喷施时间提前至接种ZYMV前48和72 h，各生防菌的相对防效总体降低，但LZ1-4仍保持较高且相对稳定的相对防效（≥81.5%）；DM3-18的相对防治效果为81.5%，变幅较小；L1处理的相对防效则降至61.2%~66.7%；XYK2-4、DM5-29和XZ3-6的相对防效降幅大且不稳定。综上可知，生防菌LZ1-4、DM3-18和L1在发病率、相对防效以及稳定性等方面效果较好，其中LZ1-4对ZYMV的预防效果最优；且在接种ZYMV前24 h喷施生防菌对ZYMV的预防效果显著优于接种ZYMV前48和72 h。因此，建议将接种前24 h喷施生防菌作为甜瓜ZYMV绿色预防的核心方案。

2.3 6种生防菌对ZYMV的治疗效果

表3显示，接种ZYMV后24 h喷施生防菌均可显著抑制甜瓜ZYMV的发病率和病情指数，相对防治效果从高到低依次为DM3-18（90.8%）>LZ1-4（81.5%）>L1（77.7%）>XZ3-6（74.1%）>DM5-29 （72.3%）>XYK2-4（53.7%）。喷施时间延后至接种ZYMV后48和72 h，6种生防菌对ZYMV的治疗效果逐渐递减，但DM3-18和L1仍保持较高且相对稳定的治疗效果，相对防效分别为77.7%~85.2%和76.0%~81.5%；LZ1-4的治疗效果则降低至50%~76.0%；XYK2-4、DM5-29和XZ3-6治疗效果降幅大且不稳定。综上可知，DM3-18、LZ1-4和L1在发病率、相对防效以及稳定性等方面效果较好，其中DM3-18对ZYMV的治疗效果最好，且在接种ZYMV后24 h喷施生防菌对ZYMV的治疗效果明显优于接种ZYMV后48和72 h喷施。因此，建议将接种后24 h喷施生防菌作为甜瓜ZYMV绿色治疗的核心方案。

2.4 3种生防菌对甜瓜生长的影响

2.4.1 接种ZYMV前24 h喷施生防菌对甜瓜生长的影响

由图2可知，接种ZYMV后60 d，DM3-18和LZ1-4处理甜瓜的株高均为58 cm，较CK（34 cm）提高70.6%；L1处理甜瓜的株高为55.5 cm，较CK提高63.4%。CK、L1、DM3-18和LZ1-4处理甜瓜的株高变异系数分别为47.5%，44.6%，45.3%和45.1%。上述结果表明，生防菌LZ1-4和DM3-18在促进甜瓜株高生长方面表现更优。由图2可知，接种ZYMV后60 d，LZ1-4处理甜瓜的茎粗为4.55 mm，较CK（3.94 mm）增加15.5%，增幅最大；接种ZYMV后20~60 d，LZ1-4处理甜瓜茎粗累计增加了1.12 mm；CK、L1、DM3-18和LZ1-4处理甜瓜茎粗的变异系数分别为17.1%，19.4%，17.8%和18.2%，表明各生防菌处理对甜瓜茎粗生长的促进效果相当。综合增量与稳定性，LZ1-4和DM3-18处理对甜瓜茎粗的促进效果较优。

2.4.2 接种ZYMV后24 h喷施生防菌对甜瓜生长的影响

图3表明，接种ZYMV后60 d，DM3-18处理甜瓜的株高为57.17 cm，较CK（36.33 cm）提高57.5%。接种ZYMV后20~60 d，各生防菌处理甜瓜的株高累计增量从高到低依次为DM3-18（49.58 cm）>LZ1-4（47.75 cm）>L1（39.67 cm）>CK（31.92 cm），CK、L1、LZ1-4和DM3-18处理甜瓜株高的变异系数分别为21.4%，20.8%，19.9%和18.7%。综合增量与稳定性，DM3-18对甜瓜株高的促进效果最佳。由图3可知，接种ZYMV后60 d，DM3-18处理甜瓜的茎粗为4.45 mm，较CK（3.98 mm）增加11.8%。接种后20~60 d，各处理甜瓜茎粗累计增量从高到低依次为DM3-18（0.70 mm）>LZ1-4（0.62 mm）>L1（0.54 mm）>CK（0.23 mm）；CK、L1、LZ1-4和DM3-18处理甜瓜茎粗的变异系数分别为14.2%，9.1%，10.4%和9.3%。上述结果表明，DM3-18对甜瓜茎生长的促进效果最佳。

2.5 3种生防菌对甜瓜叶片不同时期病毒相对载量的影响

2.5.1 接种ZYMV前24 h喷施生防菌对甜瓜叶片不同时期病毒相对载量的影响

图4结果表明，以CK叶片的ZYMV相对载量为基准（1.0），在接种后20，30，40，50和60 d时，L1处理叶片ZYMV相对载量分别为CK的30.8%，38.2%，62.6%，85.4%和76.3%； LZ1-4处理叶片ZYMV相对载量分别为CK的22.1%，29.5%，43.3%，54.1%和46.2%；喷施DM3-18处理叶片ZYMV相对载量分别为CK的24.2%，30.6%，46.5%，64.3%和55.7%。L1、LZ1-4和DM3-18处理在接种后20 d时对ZYMV的抑制率最高，分别为69.2%，77.9%和75.9%，至60 d时，分别降至23.6%，53.9%和44.3%。综上可知，喷施LZ1-4的叶片在各时间点ZYMV相对载量均最低，接种后20~50 d，ZYMV相对载量均显著低于CK，表明其对ZYMV的抑制效果最佳。

2.5.2 接种ZYMV后24 h喷施生防菌对甜瓜叶片不同时期病毒相对载量的影响

图5表明，以CK处理叶片ZYMV相对载量为基准（1.0），在接种20，30，40，50和60 d时，L1处理叶片ZYMV相对载量分别为CK的30.9%，35.4%，51.2%，85.3%和71.9%； LZ1-4处理叶片ZYMV相对载量分别为CK的24.1%，31.7%，41.2%，68.9%和42.9%； DM3-18处理叶片ZYMV相对载量分别为CK的22.0%，29.7%，34.9%，59.4%和59.1%。L1、LZ1-4和DM3-18处理在接种后20 d时对ZYMV的抑制率最高，分别为68.8%，75.8%和77.9%；至60 d时，抑制率分别降至14.6%，31.9%和40.9%。综上可知，DM3-18处理的甜瓜叶片在接种后各时间点ZYMV相对载量均较低，表明DM3-18对ZYMV的抑制效果最佳。

2.6 3种生防菌对甜瓜叶片不同时期LOX1相对表达量的影响

2.6.1 接种ZYMV前24 h喷施生防菌对甜瓜叶片不同时期LOX1相对表达量的影响

接种ZYMV前24 h喷施生防菌对LOX1相对表达量的影响如图6所示。

由图6可知，以CK处理叶片LOX1相对表达量为基准（1.0），在接种后20，30，40，50和60 d时，L1处理叶片LOX1相对表达量分别为CK的48.5，40.5，35.5，24.5和14.5倍；LZ1-4处理叶片LOX1相对表达量分别为CK的61.4，51.3，40.2，30.7和31.7倍；DM3-18处理叶片LOX1相对表达量分别为CK的54.8，45.8，45.7，36.1和26.6倍。LZ1-4处理在接种20 d时甜瓜叶片中LOX1相对表达量达到峰值（为CK的61.4倍），明显高于DM3-18和L1；接种后60 d时，LZ1-4处理甜瓜叶片中LOX1相对表达量仍最高，为CK的31.7倍，而DM3-18和L1处理分别降至CK的26.6和14.5倍。上述结果表明，LZ1-4处理甜瓜叶片LOX1的相对表达量在各时间点均较高，且显著高于CK，说明LZ1-4在持续诱导LOX1表达方面表现更优。

2.6.2 接种ZYMV后24 h喷施生防菌对甜瓜叶片不同时期LOX1相对表达量的影响

图7表明，以CK处理叶片LOX1相对表达量为基准（1.0），在接种后20，30，40，50和60 d时，L1处理叶片LOX1相对表达量分别为CK的38.1，47.2，36.5，30.8和14.5倍；LZ1-4处理叶片LOX1相对表达量分别为CK的44.9，53.3，41.2，36.1和26.5倍；DM3-18处理叶片LOX1相对表达量分别为CK的51.3，61.3，49.2，24.5和31.7倍。DM3-18处理在接种后30 d时LOX1相对表达量达到峰值（为CK的61.3倍），明显高于LZ1-4和L1处理；接种后60 d时，DM3-18处理LOX1的相对表达量仍维持较高水平。结果表明，DM3-18在持续诱导LOX1表达方面表现更优。

3 讨论与结论

作为植物病害的重要组成部分，植物病毒病对农业可持续发展造成严重威胁，导致果实品质下降和经济效益降低，也称为“植物癌症”^［13］。病毒病绿色生物防控技术是未来发展的主要方向，其中生防菌防治病毒病可能会成为新趋势。生防菌防治植物病害的作用机制比较复杂，直接作用机制有拮抗、竞争和减毒，间接作用机制有促生和诱抗^［14］。有些生防菌会通过诱导植物产生抗性从而减轻病毒对植株的伤害，例如防御、胁迫等抗性基因的表达和防御反应相关酶活性的变化等^［15］。本研究通过在接种ZYMV前后24，48和72 h喷施生防菌，确定接种ZYMV前后24 h喷施生防菌的预防和治疗效果最佳。过早（接种ZYMV前72 h）喷施，菌株活性或诱导的抗性可能已经衰减^［16］；过晚（接种ZYMV后72 h）喷施，病毒可能已经建立系统性感染，难以控制。本研究结果表明，生防菌LZ1-4对甜瓜ZYMV的预防效果最佳，相对防效为88.9%。Ghanem等^［17］将3种链霉菌（Streptomyces spp.S. sampsonii，S.rochei和S.griseus）混合进行种子预处理，并在接种前48 h于第一片真叶喷施，可以有效预防ZYMV，相对防效为74.8%，同时可以有效降低ZYMV的相对载量，这与本研究结果一致。生防菌DM3-18对甜瓜ZYMV的治疗效果最佳，相对防效为90.8%。Abdelkhalek等^［18］分别在接种黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）前后24 h喷施贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）PEA1，对CMV的抑制率分别为55.88%和72.88%，同时显著提高PAL、CHS、HQT、PR-1和POD基因的转录水平。这可能是贝莱斯芽孢杆菌直接攻击或钝化已入侵的病毒粒子（如分泌病毒外壳蛋白抑制剂或RNA酶），或在病毒已造成胁迫的情况下，更强力地调动植物的二次免疫反应，抑制了病毒的复制和移动^［19］。

植物激素如茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）和乙烯（ETH）等在植物抗病毒防御中起关键作用^［20］，这些激素可激活植物信号通路，诱导植物抗性，从而用于防治植物病毒病^［21］。JA是植物应对病害的核心激素信号，脂氧合酶（LOX）基因是JA合成途径的关键基因，在植物对病原体感染的防御反应和脂质过氧化过程中起着关键作用。植物被细菌、真菌和病毒等侵染后，其组织细胞中的LOX活性和相应基因的表达会发生变化^［22-23］。薄皮甜瓜在接种枯萎病菌后，叶片和根中LOX活性和部分CmLOXs均上调表达，说明其参与了病害防御反应^［24］。因此，测定LOX1的相对表达量可以从信号通路以及分子水平等方面评价抗性。Xuan等^［25］研究表明，贝莱斯芽孢杆菌HN-2通过高效定殖辣椒根系，激活JA介导的诱导系统抗性通路，上调防御酶活性和PAL、NPR1、PR等基因表达，缓解辣椒斑驳病毒（pepper mottle virus，PVMV）侵害，显著抑制病毒复制与扩散。Lee等^［26］研究表明，喷施解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）5B6能显著降低接种病毒后叶片中CMV外壳蛋白（CP）基因的RNA积累量，叶片中多个防御标记基因CaPR4、CaPR5、CaPR10显著上调，表明5B6诱导了一个涉及JA、SA、ETH多条信号通路的广谱系统抗性。刘欣^［27］对LZ1-4进行稳定性测试，发现其可在pH≥11的环境下正常生长，耐盐碱性较好，同时发现DM3-18对苹果金红和黄太平枝条上腐烂病菌的治疗效果在77%以上^［7］。本研究发现，LZ1-4用于预防ZYMV时，在接种后20 d时LOX1的相对表达量达到最大；DM3-18用于治疗ZYMV时，在接种后30 d时LOX1的相对表达量达到最大。然而Amin等^［28］研究表明，分别在接种马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）前后48 h喷施枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）EMCCN 1211，在接种后10 d防御病毒相关基因PR-1表达上调，PVY积累水平分别降低43.7%和48.54%，病毒抑制率分别为41.26%和66.57%，与本研究结果有一定差异。

本研究通过综合分析6种生防菌对甜瓜ZYMV的预防和治疗效果，成功筛选出2种预防和治疗效果较佳的生防菌，分别为LZ1-4和DM3-18。在接种ZYMV前24 h喷施LZ1-4预防效果最佳，相对防效为88.9%；在接种ZYMV后24 h喷施DM3-18治疗效果最佳，相对防效为90.8%。同时确定了在接种ZYMV前后24 h分别是预防和治疗的最佳时间。这不仅为甜瓜ZYMV的绿色防控提供了高效的生防菌剂，也为进一步探索生防菌在ZYMV防治中的应用奠定了基础。

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基金资助

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