葡萄斑点病毒RT-LAMP检测体系的建立及应用

Establishment and application of an RT-LAMP assay for the detection of grapevine fleck virus

摘要

目的 建立葡萄斑点病毒（grapevine fleck virus，GFKV）逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）检测方法，以实现葡萄斑点病毒的快速检测。 方法 以GFKV的外壳蛋白（coat protein，CP）基因序列为靶序列设计并筛选特异性引物，通过系统优化反应体系中的各项参数，评估该检测方法的特异性、灵敏度，并将其应用于田间样本检测。 结果 基于筛选获得的特异性引物建立的RT-LAMP检测体系，仅对GFKV的RNA呈阳性反应，而对葡萄红地球病毒（grapevine red globe virus，GRGV）、葡萄星状花叶相关病毒（grapevine asteroid mosaic associated virus，GAMaV）、葡萄卷叶伴随病毒-3（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）、葡萄扇叶病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）、葡萄病毒A（grapevine virus A，GVA）的RNA均无交叉反应。经优化后确定RT-LAMP最佳反应体系为温度65 ℃，反应时间60 min，Mg²⁺、甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶浓度分别为9.6 mmol/L、1.4 mol/L、2.0 mmol/L、4.8 U/μL。该体系对GFKV RNA检测的灵敏度达到10 pg/μL，是常规RT-PCR的10倍。在田间样本检测中，RT-LAMP的检测结果与RT-PCR完全一致。 结论 建立的葡萄斑点病毒RT-LAMP检测方法特异性好、灵敏度高、稳定可靠，可用于田间葡萄斑点病毒病的早期诊断与流行监测。

Abstract

Objective The study aims to establish a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP） method for detecting grapevine fleck virus （GFKV），in order to achieve rapid detection of the virus. Method Specific primers were designed and screened based on the coat protein （CP） gene sequence of GFKV.By systematically optimizing various parameters in the reaction system，the specificity and sensitivity of this detection method were evaluated，and it was applied to field sample testing. Result The RT-LAMP detection system established based on the screened specific primers was positive only for GFKV RNA，and showed no cross-reactivity with RNA of grapevine red globe virus （GRGV），grapevine asteroid mosaic associated virus （GAMaV），grapevine leafroll-associated virus 3 （GLRaV-3），grapevine fanleaf virus （GFLV），and grapevine virus A （GVA）. The optimized RT-LAMP reaction conditions were determined as follows：65 °C for 60 min，with concentrations of Mg²⁺，betaine，dNTPs，and Bst DNA polymerase at 9.6 mmol/L，1.4 mol/L，2.0 mmol/L，and 4.8 U/μL，respectively.This system detected GFKV RNA at a sensitivity of 10 pg/μL，which was ten fold higher than that of conventional RT-PCR.In tests of field-collected samples，the RT-LAMP results were completely consistent with those of RT-PCR. Conclusion The RT-LAMP method established for GFKV detection exhibited strong specificity，high sensitivity，and reliable stability，rendering it applicable for early diagnosis and epidemic monitoring of grapevine fleck virus disease in the field.

Graphical abstract

关键词

葡萄斑点病毒 / 检测灵敏度 / 逆转录环介导等温扩增 / 病毒检测

Key words

grapevine fleck virus / detection sensitivity / reverse transcription loop-mediated isothermal amplification / viral detection

葡萄（Vitis vinifera L.）为葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis）木质藤本植物，是世界上重要的“栽培水果”之一，也是我国主要的经济作物^［1］。近年来，葡萄栽培面积显著增加，然而伴随而来的病害问题也日益严重，其中由葡萄斑点病毒引起的潜隐型病毒病已成为制约葡萄产业可持续发展的关键因素^［2］。葡萄斑点病毒为芜菁花叶病毒科（Tymoviridae）葡萄斑点病毒属（Maculavirus）的代表种，可通过嫁接、汁液摩擦等多种途径扩散^［3］。该病毒侵染植株后会导致叶片出现褪绿斑点、叶脉黄化等轻微症状，虽不会造成植株急性死亡，但会显著影响光合效率，导致果实产量下降、糖度降低，进而削弱葡萄的商品价值和加工品质^［4］。随着分子生物学技术的快速发展，常规PCR检测法^［5］、实时荧光定量PCR法^［6］等广泛应用于葡萄斑点病毒检测。然而上述方法通常操作繁琐、耗时较长，且依赖PCR仪、凝胶电泳系统等精密仪器，限制了其在田间现场快速检测中的应用^［7］。因此，开发一种操作便捷，快速且稳定的检测体系，对于该病毒的流行监测至关重要。

逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）是在LAMP基础上结合逆转录反应发展而成的一种RNA病毒检测方法，由Fukuta等^［8］在2003年首次提出。RT-LAMP技术具有操作简便、扩增效率高、特异性强和灵敏度高等优势，检测结果可通过浊度仪、实时荧光检测、凝胶电泳或显色剂进行可视化判读，尤其适用于田间快速检测^［9］。目前，RT-LAMP技术已在多种葡萄病毒检测中得到应用。张强强等^［10］建立了一种用于检测葡萄卷叶伴随病毒-3（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3） 的RT-LAMP技术。该方法表现出良好的特异性，检测时间较常规RT-PCR缩短了三分之一，检测灵敏度提高了10倍。谈静惠等^［11］建立了葡萄扇叶病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）的RT-LAMP检测方法，该方法在64 ℃下反应最佳，可在1 h内完成检测，具有快速、便捷与结果可视化等优点。Almasi^［12］开发了一种葡萄斑点病毒（grapevine fleck virus，GFKV）的RT-LAMP方法，该方法以葡萄RNA为模板，在LAMP体系中加入禽成髓细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）逆转录酶，在60 ℃恒温条件下反应1 h，并使用羟基萘酚蓝（hydroxynapthol blue，HNB）染料通过目视法快速检测。

鉴于GFKV作为RNA病毒具有高度变异性，且来自不同地理区域的分离物序列差异较大，可能导致基于特定序列设计的引物出现检测灵敏度下降甚至漏检的风险^［13］。为克服这一局限性，确保检测方法在我国葡萄产区具有广泛的适用性，本研究针对我国范围内GFKV外壳蛋白（CP）基因的保守区域，重新设计并筛选特异性引物，通过系统优化反应体系的主要参数并与常规RT-PCR对比灵敏度，结合田间样本检测，最终建立一种高效、可靠且适应性更广的葡萄斑点病毒RT-LAMP检测方法，以期为该病毒的早期鉴定与流行监测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料、试剂及仪器

1.1.1 供试材料及毒源

于2025年8月中旬，在宁夏回族自治区银川市平吉堡酿酒葡萄示范园和宁夏贺兰县园艺产业园，分别采集15株表现出明显明脉及斑点症状的病株新鲜叶片作为样品。葡萄病害的主要病原葡萄红地球病毒（grapevine red globe virus，GRGV）、葡萄星状花叶相关病毒（grapevine asteroid mosaic associated virus，GAMaV）、葡萄卷叶伴随病毒-3（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）、葡萄扇叶病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）、葡萄病毒A（grapevine virus A，GVA），均由宁夏大学果树所分子生物实验室提供。脱毒葡萄组培苗叶片由宁夏大学姚文孔团队馈赠。供试葡萄品种为赤霞珠（Vitis vinifera L.cv.‘Cabernet Sauvignon’）。

1.1.2 试剂及仪器

植物RNA提取试剂盒，美国Omega Bio-tek公司；反转录试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；β-巯基乙醇，苏州赛默飞世尔科技公司；10×Reaction Buffer、Bst DNA 聚合酶、MgSO₄、甜菜碱，上海碧云天生物技术股份有限公司；dNTPs、SYBR Green Ⅰ，北京索莱宝科技有限公司；DYCP-31DN型电泳仪、OSE-DB-05 TGrade Lite金属浴、蓝光切胶仪，北京六一生物科技有限公司；T100型PCR仪，美国BioRad公司；5804R低温冷冻离心机，德国艾本德公司；Tanon 1600型电泳凝胶成像分析系统，上海天能生命科学有限公司；Simpli Nano超微量分光光度计，美国GE Healthcare 公司。

1.2 引物设计与合成

根据葡萄斑点病毒外壳蛋白（CP）基因序列（GenBank：PP481508.1），借助Primer Explorer V5在线平台（http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html），设计GFKV‐LAMP‐Ⅰ、GFKV‐LAMP‐Ⅱ和GFKV‐LAMP‐Ⅲ等3对RT-LAMP引物，每组引物包括2条外引物（F3和B3）、2条内引物（FIP和BIP）。此外，葡萄斑点病毒常规RT-PCR引物采用F/R组合，扩增片段大小为179 bp。本研究所用引物均委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，序列见表1。合成的引物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）纯化，用无菌ddH₂O溶解，并分别稀释至40和10 μmol/L，-20 ℃保存备用。

1.3 病样总RNA提取与cDNA合成

采集的葡萄叶片经液氮研磨后，收集不超过100 mg的植物样品至离心管中。随后按照植物RNA提取试剂盒的步骤完成RNA提取，并通过反转录试剂盒将提取的RNA反转录合成cDNA。将所得cDNA产物置于-20 ℃条件下储存备用。

1.4 GFKV的RT-PCR检测

参照李珊等^［14］的方法建立RT-PCR反应体系，并进行适当调整。RT-PCR反应体系（20 μL）：cDNA 1 μL，正、反向引物（10 mmol／L）各1 μL，2×Max Taq酶预混液10 μL，RNase-free Water 7 μL。RT-PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。反应结束后，通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行验证，并将剩余的cDNA样品于-20 ℃保存备用。

1.5 RT-LAMP反应体系的建立及判读

参照Angela等^［15］的方法建立RT-LAMP反应体系，并进行适当调整。反应总体积25 μL，体系组成为40 μmol/L FIP、BIP各1 μL，10 μmol/L F3、B3各1 μL，cDNA模板1.5 μL，8 U/μL Bst DNA聚合酶1 μL，100 mmol/L MgSO₄ 1.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10×Reaction Buffer 2.5 μL，5 mol/L甜菜碱5 μL，ddH₂O 7 μL。扩增反应在65 ℃恒温条件下持续60 min。反应结束后，取7 μL RT-LAMP扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。判读标准为：阳性样本呈梯状条带，阴性样本则无条带。此外，也可参照郭立新等^［16］的方法，反应前于管盖内加1 μL稀释10倍的SYBR Green Ⅰ，反应结束后离心混匀，于自然光及蓝光切胶仪下观察。判读标准为：体系呈现绿色并在蓝光下发出荧光的样本判定为阳性，体系保持橙红色且在蓝光下无荧光的样本则为阴性。

1.6 RT-LAMP引物初筛

为筛选出最优引物，以GFKV cDNA为模板，采用RT-LAMP技术对表1中所列的3对引物（GFKV-LAMP-Ⅰ、GFKV-LAMP-Ⅱ和GFKV-LAMP-Ⅲ）进行扩增效率评估。以脱毒葡萄组培苗叶片cDNA作为阴性对照，以ddH₂O作为空白对照。

1.7 RT-LAMP引物特异性检测

采用经筛选确定的引物，对GFKV、GRGV、GAMaV、GLRaV-3、GFLV和GVA等6种葡萄病毒的cDNA样本进行RT-LAMP扩增反应，试验以脱毒葡萄组培苗叶片cDNA作为阴性对照，以ddH₂O作为空白对照。

1.8 RT-LAMP反应体系的优化

根据反应条件，对RT-LAMP反应体系进行系统优化与调整。具体优化参数包括：反应时间（30，45，60，75，90，105，120，135 min）、反应温度（55，57，59，61，63，65，67，69 ℃）、Mg²⁺浓度（0，1.2，2.4，3.6，4.8，6.0，7.2，8.4，9.6，10.8 mmol/L）、甜菜碱浓度（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mol/L）、dNTPs浓度（0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2，3.6 mmol/L）和Bst DNA聚合酶浓度（0.8，1.6，2.4，3.2，4.0，4.8，5.6，6.4，7.2，8.0 U/μL）。反应体系组分筛选试验阴性对照和空白对照的设置同前。

1.9 RT-LAMP和RT-PCR灵敏度比较

采用超微量分光光度计对提取的GFKV RNA浓度进行精确测定。随后使用无菌水将RNA原液依次梯度（10⁻¹~10⁻⁷）稀释，并以各稀释度RNA样本为模板，同步进行RT-PCR与RT-LAMP扩增。最后对2种方法的扩增结果进行对比分析。

1.10 田间样品检测

于2025年8月，在宁夏银川平吉堡宁夏现代农业综合开发工程技术研究中心的酿酒葡萄试验园中随机采集表现为明脉及斑点症状的赤霞珠新鲜叶片共15份，以脱毒葡萄组培苗叶片作为阴性对照。依照1.2节所述流程，提取叶片总RNA并逆转录为cDNA；随后采用优化后的RT-LAMP体系对cDNA进行扩增。

2 结果与分析

2.1 RT-LAMP引物初筛

首先，利用GFKV特异性引物对样本RNA进行RT-PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，所得产物片段大小符合预期（图1-A），并经测序确认为GFKV。在后续的LAMP引物筛选中，3对候选引物中仅引物GFKV-LAMP-Ⅲ能产生清晰的梯状条带，而引物GFKV-LAMP-Ⅰ与GFKV-LAMP-Ⅱ均无特异性扩增（图1-B）。该结果进一步得到了SYBR Green Ⅰ荧光染料的验证：在所有测试组中，唯有引物GFKV-LAMP-Ⅲ的反应管颜色由橙红变为绿色，且在蓝光切胶仪下呈现强烈的荧光信号；其余引物对及阴性对照均保持橙红色且在蓝光切胶仪下无荧光信号（图1-C、D）。

2.2 RT-LAMP引物特异性检测

为验证引物GFKV-LAMP-Ⅲ的特异性，使用其对分别含有GFKV、GRGV、GAMaV、GLRaV-3、GVA和GFLV的样品RNA进行RT-LAMP扩增。结果（图2）显示，仅含有GFKV的样品能够扩增出清晰明亮的梯状条带，且在蓝光切胶仪下产生强烈的荧光信号，而其他病毒样品及阴性对照均未检测到任何扩增条带或荧光信号（图2-A、B、C）。上述结果表明，引物GFKV-LAMP-Ⅲ具有良好的特异性，可用于后续试验。

2.3 RT-LAMP 反应条件优化

2.3.1 反应时间

时间梯度试验发现，反应在45 min后即可检测到扩增条带（图3-A），而在超过60 min时，则出现明显的颜色变化和荧光信号（图3-B、C）。综合考虑扩增效率与时间成本，最终确定60 min为最佳反应时间。

2.3.2 反应温度

图4显示，扩增条带的亮度和清晰度随反应温度的升高呈现先增强后减弱的趋势。RT-LAMP从61 °C开始出现梯状条带（图4-A），且在61~67 °C的测试温度范围内均观察到反应液变绿（图4-B）且产生荧光信号（图4-C），表明扩增均有效进行，但各温度间的扩增效率差异并不显著。综合比较发现，65 °C时产生的梯状条带具有最佳的亮度和清晰度（图4-A），因此后续试验选择65 °C作为最佳反应温度。

2.3.3 Mg²⁺浓度

Mg²⁺浓度是影响RT-LAMP扩增的关键因素之一。由图5可知，Mg²⁺浓度为1.2~10.8 mmol/L时均能扩增出梯状条带，但亮度呈现显著的浓度依赖性（图5-A）。值得特别注意的是，当Mg²⁺浓度为9.6 mmol/L时，扩增条带最为明亮清晰，且在该浓度下的荧光检测信号也相对较强（图5-B、C），这与电泳结果相互印证。基于上述结果，确定后续试验的最佳Mg²⁺浓度为9.6 mmol/L。

2.3.4 甜菜碱浓度

甜菜碱浓度对RT-LAMP扩增的影响如图6所示。

甜菜碱作为稳定剂，其浓度对RT-LAMP扩增效果具有显著影响。由图6可知，甜菜碱浓度在0.2~1.8 mol/L时均能实现有效扩增。特别值得注意的是，扩增条带的亮度和清晰度均随甜菜碱浓度增加呈现先增强后减弱的趋势。在甜菜碱浓度为1.4 mol/L时，扩增条带质量达到最佳状态（图6-A）。继续提高甜菜碱浓度后，各项指标未见明显改善，同时相应的显色反应（图6-B）和荧光信号（图6-C）也差别不大，表明扩增效率的差异并不显著。综合上述试验结果，确定甜菜碱的最佳反应浓度为1.4 mol/L。

2.3.5 dNTPs浓度

如图7所示，dNTPs浓度在0.4~3.6 mmol/L时均能成功实现扩增，且扩增条带的亮度与清晰度随dNTPs浓度的提高而增强，并在dNTPs浓度达到2.0 mmol/L后进入平台期（图7-A）。在显色方面，dNTPs浓度为0.4 mmol/L时已可使反应液变为绿色（图7-B），但此时荧光信号微弱；随着dNTPs浓度的增加，显色结果无明显改变，但荧光强度则在dNTPs浓度为2.0 mmol/L时达到峰值并维持稳定（图7-C）。鉴于该浓度下扩增效率与检测灵敏度俱佳，故将dNTPs的最佳浓度确定为2.0 mmol/L。

2.3.6 Bst DNA聚合酶浓度

如图8所示，当Bst DNA聚合酶浓度为0.8~8.0 U/μL时，均能观察到梯状条带。然而，条带的亮度与清晰度随Bst DNA聚合酶浓度的增加呈先升后降趋势，并在Bst DNA聚合酶浓度为4.8 U/μL时达到最佳（图8-A）。此外，在Bst DNA聚合酶浓度为0.8 U/μL的低浓度下，反应液变为绿色（图8-B），并在蓝光切胶仪下发出荧光信号（图8-C）；当Bst DNA聚合酶浓度高于此水平后，显色与荧光强度则趋于稳定。鉴于4.8 U/μL时扩增效率最高，故将其确定为最佳浓度。

2.4 RT-LAMP和RT-PCR灵敏度比较

灵敏度评估结果显示，RNA模板的稀释导致电泳分析中条带信号强度呈现规律性递减（图9-A，B）。在使用SYBR Green Ⅰ进行荧光染色后，可观察到反应产物的颜色由绿色逐渐转变为橙红色（图9-C），相应地在蓝光切胶仪下显示的荧光强度也显著减弱（图9-D）。在检测下限方面，常规RT-PCR方法对GFKV的检出限为100 pg/μL，而本研究建立的RT-LAMP技术则将检出限提升至10 pg/μL。上述结果表明，建立的RT-LAMP检测体系在灵敏度上较常规RT-PCR提高了一个数量级，具备对痕量RNA模板进行有效检测的能力。

2.5 田间样品检测

为评估RT-LAMP检测方法的适用性，本研究利用RT-PCR和RT-LAMP技术分别对随机采集的15份田间疑似感染斑点病毒的葡萄样品进行平行测试。2种技术均鉴定出9份阳性样本（图10），且检测结果完全吻合，充分证实了本研究构建的GFKV RT-LAMP方法在田间实际检测中具有可靠的准确性。

3 讨 论

葡萄斑点病毒严重制约着我国葡萄产业的健康发展，因此，建立其快速、灵敏且稳定的检测技术对实现早期防控至关重要。逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术凭借其操作便捷、反应快速等优势，在此领域展现出巨大潜力。与RT-PCR技术相比，RT-LAMP的核心优势在于其恒温扩增特性，仅需水浴锅或金属浴等简易设备即可完成反应，显著降低了对昂贵仪器的依赖及检测成本，使其更适用于基层实验室及田间现场检测。该技术通过针对靶序列保守区域设计4~6条特异性引物，大幅提高了检测特异性，能够有效区分近缘病毒或不同株系^［16］。此外，反应借助SYBR Green Ⅰ等荧光染料通过颜色或荧光变化直接观察，无需进行凝胶电泳，更进一步提升了检测效率。

然而，现有的一步法RT-LAMP技术在检测GFKV时存在灵敏度不足的局限，这已成为其实际应用的主要瓶颈。Almasi^［12］以从葡萄中提取RNA为模板，体系内加入了AMV逆转录酶，扩增反应在60 ℃恒温条件下持续1 h后直接借助羟基萘酚蓝染料进行显色，通过目视完成结果判定。当应用此方法对本研究涉及的GFKV感染样品进行分析时，结果发现扩增产物中缺乏典型的梯状条带。推测可能是因为AMV酶的最佳反应温度为45~50 ℃，在60~65 ℃下虽能进行逆转录，但效率有所下降，从而使其敏感性受到影响^［17］。为此，本研究将逆转录与扩增步骤分离，以葡萄叶提取的RNA为模板合成cDNA，避免了AMV酶在高温下活性降低的问题，随后以cDNA为模板进行RT-LAMP试验，并用SYBR Green Ⅰ作为检测指示剂，颜色变化是由橙红色变为绿色，这较羟基萘酚蓝指示剂更易区分。

试验过程中还发现，RT-LAMP可视化结果判读容易导致模板污染。吴泽勇等^［18］研究发现，模板污染主要是因为开盖进行凝胶电泳验证时，扩增产物可能会以气溶胶形式扩散到环境中，进而污染后续试验的试剂或样品。为解决这一问题，在操作过程中需严格划分试剂准备区、样品处理区和扩增产物分析区，同时对试验台面、移液器等工具进行定期消毒也能在一定程度上降低污染风险^［19］。此外，樊荣辉等^［20］在构建齿兰环斑病毒的RT-LAMP检测体系时，于反应管盖内预先加入了SYBR Green Ⅰ荧光染料，反应结束后离心使染料与体系结合，并经涡旋混匀后再离心，最后通过自然光照射及蓝光切胶仪进行闭管荧光检测。本试验也同样采取了该方法，结果显示此方法不仅能有效避免模板污染，还能提高结果判读的客观性和准确性。

RT-LAMP检测体系的灵敏度因病毒不同而存在差异^［21-22］。Salit等^［23］研究证实，烟草花叶病毒的RT-LAMP灵敏度比常规RT-PCR高1 000倍；张俊蕾等^［24］报道的南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测灵敏度是RT-PCR检测的100倍。本研究中，葡萄斑点病毒的RT-LAMP检测方法比传统RT-PCR灵敏度提高10倍，这可能是因为葡萄斑点病毒基因组序列具有较高的复杂性或保守区域较少，导致设计出的RT-LAMP引物与靶序列的结合效率相对较低，从而限制了灵敏度的提升幅度^［25］。虽然本研究中灵敏度提升倍数不及其他病毒，但提高10倍的灵敏度仍能显著增强对低浓度病毒样品的检出能力，尤其是在田间样品检测中，极大地提高了病毒的早期发现能力，有助于在病毒种群建立和症状显现之前采取有效干预措施。

尽管RT-LAMP技术优势显著，但在推广应用过程中仍面临若干挑战，尤其是对RNA模板质量的内在要求以及复杂植物基质中抑制物的干扰。虽然RT-LAMP对部分降解或含有杂质的模板表现出较高的耐受性，但这并不意味着其对模板质量没有要求，模板的完整性和纯度仍是影响扩增效率与检测下限的关键因素^［17］。植物组织中富含的多糖、多酚、色素等次级代谢产物是常见的PCR抑制物，亦可能干扰RT-LAMP反应中Bst DNA聚合酶的活性^［26］。尽管通过优化反应缓冲液可在一定程度上缓解抑制效应，但对于单宁或多酚含量较高的植物样本，抑制问题依然突出，可能会导致假阴性或灵敏度下降。未来，该技术有望与便携式核酸提取方法或试纸条检测等便捷判读方式相结合。同时，开发针对不同植物的专用快速提取试剂盒，将是提升RT-LAMP田间适用性的关键研究方向。

4 结 论

本研究基于GFKV外壳蛋白基因的保守序列，设计并筛选出特异性引物。通过对反应温度、反应时间及关键组分浓度的系统优化，确立了葡萄斑点病毒RT-LAMP检测的最佳反应体系为Mg²⁺浓度9.6 mmol/L、甜菜碱浓度1.4 mol/L、dNTPs浓度2.0 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度4.8 U/μL，在65 ℃条件下反应60 min。该体系对GFKV具有高度特异性，与GRGV等5种常见葡萄病毒无交叉反应，其检测灵敏度达到10 pg/μL，较常规RT-PCR提高了10倍。利用15份田间样本进行验证，结果显示RT-LAMP的检测结果与RT-PCR完全一致。建立的RT-LAMP检测方法操作简便、快速且稳定，并支持可视化判读，适用于葡萄斑点病毒的田间快速筛查与早期监测，为该病毒的有效防控和葡萄安全生产提供了可靠的技术手段。

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基金资助

宁夏回族自治区重点研发计划项目(2025BBF02001)

宁夏贺兰山东麓葡萄酒产业技术协同创新中心科技人才开放课题资助项目(CXZXKT2024017)

国家市场监督管理总局科技计划资助项目(2024MK134)