多黏类芽孢杆菌hg18在黄瓜植株体内的定殖动态

Colonization dynamics of Paenibacillus polymyxa hg18 inside cucumber plants

摘要

目的 明确具有良好抑菌促生效果的内生多黏类芽孢杆菌hg18在黄瓜植株体内的定殖动态，为其应用于土传病害防控提供理论依据。 方法 以多黏类芽孢杆菌hg18为研究对象，利用电转化方法构建携带mCherry红色荧光基因的hg18-mCherry工程菌株，并对其生长曲线、群集运动能力、生物膜合成能力和抑菌活性等生物学特性以及遗传稳定性进行测定，结合激光共聚焦显微镜观察与平板分离计数法测定灌根处理后工程菌株hg18-mCherry在黄瓜植株体内的定殖部位及动态。 结果 标记获得的工程菌株hg18-mCherry在荧光显微镜下呈现明亮的红色，经转接培养100 h后其遗传稳定率达91.33%，该菌株的生长曲线、群集运动能力、生物膜形成能力和抑菌活性等均未受影响。工程菌株hg18-mCherry在黄瓜植株内定殖整体呈“先升后降再趋于稳定”的变化趋势，定殖量为根>茎>叶。根部定殖量于15 d达到峰值，为1.13×10⁴ CFU/g，25 d后稳定在8.47×10³ CFU/g；茎部定殖量也在15 d达到峰值，为4.73×10³ CFU/g，之后逐渐稳定在3.27×10³ CFU/g；叶片定殖量在10 d达到峰值，为1.53×10³ CFU/g，25 d后稳定在0.87×10³ CFU/g。在黄瓜根表皮以及根、茎、叶横切面维管组织部位，均可观察到hg18-mCherry聚集菌落。 结论 成功将mCherry红色荧光基因转入hg18菌株，获得红色荧光标记工程菌株hg18-mCherry，其可在黄瓜体内稳定定殖，且偏好在维管组织定殖并占据生态位点，具备作为生防资源应用于防控土传病害的潜力。

Abstract

Objective This study aims to clarify the colonization dynamics of the endophytic Paenibacillus polymyxa strain hg18，which exhibits potent antibacterial and growth-promoting effects in cucumber plants， thereby providing a theoretical basis for its application in the control of soil-borne diseases. Method Taking P.polymyxa hg18 as the research object，the engineered strain hg18-mCherry carrying the red fluorescent mCherry gene was constructed by electrotransformation.Its biological characteristics，including growth curve，swarming motility，biofilm formation ability，and antagonistic activity，as well as its genetic stability，were systematically determined.Moreover，colonization sites and dynamic changes in cucumber tissues after root irrigation were determined and observed using confocal laser scanning microscopy and plate counting. Result The engineered strain hg18-mCherry displayed bright red fluorescence under microscopy，and its genetic stability reached 91.33% after 100 h of subculture.Its growth curve，swarming motility，biofilm formation ability，and antagonistic activity remained unaffected.Colonization by hg18-mCherry in cucumber tissues followed an initial increase， subsequent decline，and eventual stabilization.The colonization density ranked as root>stem>leaf，with root colonization peaking at 1.13×10⁴ CFU/g at 15 d and stabilizing at approximately 8.47×10³ CFU/g after 25 d. Stem colonization peaked at 4.73×10³ CFU/g at 15 d before stabilizing at 3.27×10³ CFU/g，while leaf colonization peaked at 1.53×10³ CFU/g at 10 d and stabilized at 0.87×10³ CFU/g after 25 d.Aggregated colonies of hg18-mCherry were observed in the root epidermis and vascular tissues of root，stem，and leaf cross-sections. Conclusion The mCherry red fluorescent gene was successfully introduced into hg18，generating the engineered strain hg18-mCherry.This strain stably colonizes cucumber plants and preferentially occupies ecological niches in vascular tissues，showing its potential as a biocontrol resource to prevent and control soil-borne diseases.

Graphical abstract

关键词

多黏类芽孢杆菌 / mCherry荧光标记 / 定殖动态 / 黄瓜

Key words

Paenibacillus polymyxa / mCherry fluorescent labeling / colonization dynamics / cucumber

在绿色农业发展战略全面推进的背景下，利用植物内生细菌开发生防菌剂成为植物病害绿色防控领域的研究热点^［1］。目前应用最广泛的内生细菌主要有芽孢杆菌（Bacillus）、类芽孢杆菌（Paenibacillus）及假单胞菌（Pseudomonas）等，如Wei等^［2］研究发现，从辣椒中分离得到的解淀粉芽孢杆菌L1-7及贝莱斯芽孢杆菌L3-5在防治辣椒炭疽病上具有良好的应用前景；Chen等^［3］从玉米中分离的内生多黏类芽孢杆菌SF05对镰孢菌等多种病原真菌表现出良好的生防能力。

除了自身的抑菌拮抗能力外，生防菌在宿主植物体内的成功定殖是发挥持久生防效果的关键因素之一。已有研究表明，生防内生细菌的定殖能力直接影响其在植物体内的种群密度和存续时间，进而关系到其生防作用的稳定性^［4］。王帆帆等^［5］研究表明，生防菌BZJN1在白术叶片内有较好的定殖能力，同时对白术叶斑病有良好的防治效果；杜漪帆等^［6］研究发现，分离自烟草的内生解淀粉芽孢杆菌YN2014042不仅能在烟草根、茎、叶部稳定定殖，且其对烟草黑胫病表现出良好的防治潜力；张猛等^［7］的研究也表明，特基拉芽胞杆菌wm031能在西瓜植株内稳定定殖，并对西瓜枯萎病防治效果高达74.6%，明显高于化学农药百菌清；另外，王娜等^［8］的研究表明，不同内生细菌菌株SZ5、DP10和CCM9，虽均能在棉花体内定殖，但其定殖动态存在菌株特异性，且定殖规律不尽相同。因此，在将有益植物内生细菌开发为生物农药的进程中，系统评估其定殖能力，揭示其定殖动态规律，对于优化菌剂应用策略、提升防病效果具有重要的理论与实践意义。

目前研究解析定殖位点、追踪定殖动态最广泛的方法是荧光标记技术，该技术基于生物发光原理，借助激光共聚焦显微镜观察荧光信号，以实现对微生物实时、原位可视化观测^［9］。mCherry是一种性能优异的单体红色荧光蛋白，具有成熟速度快、光稳定性高及毒性低的特点，且激发峰和发射峰分别位于587和610 nm处，被广泛应用于微生物的标记研究中^［10-11］。例如，张峰程等^［12］通过原生质体转化法构建了不同交配型的拟轮枝镰孢菌mCherry标记菌株，为研究该菌在玉米体内的侵染、定殖动态提供了重要途径。

多黏类芽孢杆菌hg18分离自健康黄瓜植株组织，实验室前期对其生防功能进行了大量研究，发现其具有良好的防病促生作用^［13］。但多黏类芽孢杆菌hg18能否定殖于黄瓜植株体内及其在体内的定殖位点等尚不明确。因此，本研究通过电转化技术将mCherry荧光质粒导入hg18菌株，构建hg18-mCherry荧光标记工程菌株，并结合激光共聚焦显微镜观察与平板分离计数法，明确该菌株在黄瓜体内的定殖部位与动态变化规律，为揭示hg18菌株的生防机制提供理论依据，也为其菌剂的应用方法优化提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus.polymyxa）hg18和尖孢镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucurmerinum，Foc），均保存于甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室。pHY-PHpaⅡ-mCherry质粒委托重庆推博生物有限公司构建，具有四环素（Tetracycline）抗性，由PHpaⅡ启动子驱动mCherry的表达。

供试黄瓜品种：津研四号，其种子购自甘肃省兰州市安宁区种子市场。

供试培养基：LB培养基、PDA培养基，参照方中达^［14］《植病研究方法》制备；生长培养基、复苏培养液和电击缓冲液，参照高玲等^［15］的方法配制；LBGM培养基，参照Gao等^［16］的配方制备；半固体培养基为LB培养液中添加4 g/L琼脂。

供试试剂：四环素（Tetracycline，Solarbio）、质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司），2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix（北京聚合酶生物科技有限公司），质量分数1%结晶紫溶液，体积分数95%乙醇。

供试仪器：酵母细菌电穿孔仪（Bio-Rad）、DYY-6D型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、MiniAmp PCR仪（Thermo Fisher Scientific）、琼脂糖凝胶成像系统（UVITEC）、多功能酶标仪（Biotek Instruments）、荧光显微镜及LMS980激光共聚焦显微镜（Zeiss）。

1.2 hg18-mCherry红色荧光标记菌株的构建

1.2.1 hg18感受态制备及电转化

将野生多黏类芽孢杆菌hg18于LB培养基上活化培养，挑取单菌落于LB培养液中制备种子液，加入5%种子液于生长培养基后30 ℃、200 r/min培养至OD₆₀₀为0.5~0.6时，4 ℃冰浴30 min，5 000 r/min离心10 min获得菌体细胞，使用等体积预冷电击缓冲液洗涤菌体5次，用1 mL电击缓冲液重悬，并分装获感受态细胞。将质粒pHY-PHpaⅡ-mCherry和hg18感受态细胞混匀后置于2 mm的电击杯中冰浴30 min，设置细菌酵母电转化仪2 000 V，5 ms脉冲完成电击，随后向电转杯中迅速加入800 μL预热的复苏培养液，并转移至2 mL离心管中，30 ℃、180 r/min培养4 h后涂布于含5 μg/mL四环素抗性平板上培养48 h。

1.2.2 荧光标记菌株筛选及其荧光观察

利用特异性引物M-F（5′-TGGTATCTTTATAGTCCTGTCG-3′）和M-R（5′-TCAACTTTGGGAGAG-AGTTC-3′）对菌落pHY-PHaⅡ-mCherry进行PCR扩增。PCR反应体系：挑取单菌落为模板，M-F/M-R各0.5 μL，2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10 μL，ddH₂O补足至20 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性25 s，58 ℃退火 25 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃终延伸5 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，将符合目标条带大小的扩增产物测序，并使用荧光显微镜在561 nm激发波长下观察菌落及单菌体荧光情况，以野生hg18菌株为对照。将测序正确并发光的阳性克隆作为工程菌株进行下一步研究。

1.3 工程菌株hg18-mCherry生物学特性的测定

1.3.1 生长曲线

分别制备OD₆₀₀为1的hg18菌株和hg18-mCherry工程菌株种子液，以1%接种量接种至无选择压力的LB培养液中进行培养，每隔2 h使用多功能酶标仪测定OD₆₀₀值，以LB培养液做空白对照，绘制生长曲线。

1.3.2 群集运动能力

参考Shrout等^［17］的方法，分别在半固体琼脂游动平板中央接种培养OD₆₀₀为1的hg18和hg18-mCherry菌液5 μL，30 ℃培养12 h后，测量运动圈直径。

1.3.3 生物膜合成能力

将hg18和hg18-mCherry菌液分别培养至OD₆₀₀为1后，取菌液和LBGM培养液以体积比1∶9混匀后加入到24孔板中，30 ℃培养48 h后取出，参考Zeng等^［18］的方法，利用结晶紫染色生物膜后利用多功能酶标仪测定OD₅₉₅的吸光值，评估野生菌株hg18和工程菌株hg18-mCherry的生物膜合成能力。

1.3.4 室内抑菌活性

参考崔月贞等^［19］的方法，采用对峙培养法测定菌株hg18和工程菌株hg18-mCherry对黄瓜枯萎病菌（Foc）的抑制作用。以只接Foc病原菌为对照（CK）。对照组Foc菌落直径接近满皿时，测定处理组抑菌活性。

1.4 工程菌株hg18-mCherry的遗传稳定性检测

按1%接种量将工程菌株hg18-mCherry种子液添加至无选择压力的LB培养液中，30 ℃、180 r/min培养10 h，将其再转接至无选择压力的LB培养液中相同条件培养，如此重复培养100 h，每次转接培养液稀释后涂布于LB培养基，随机挑取100个单菌落点接于四环素抗性培养基上培养24 h，3次重复，计算工程菌株的遗传稳定性。

遗传稳定率=抗性平板上发光的菌落数/挑取菌落数×100%。

1.5 工程菌株hg18-mCherry在黄瓜植株体内的定殖动态测定

1.5.1 发酵液制备

挑取hg18-mCherry单菌落至含5 μg/mL四环素的LB培养液中制备种子液，将种子液以体积分数1%接入无抗LB培养液中，30 ℃、180 r/min振荡培养，获得hg18-mCherry发酵液。

1.5.2 定殖能力测定

用基质土培育黄瓜幼苗到两叶一心期时，用10 mL工程菌株hg18-mCherry发酵液（10⁷ CFU/mL）灌根接种^［20］，以等量LB培养液灌根作为对照，灌根后每隔5 d分别取黄瓜植株根部、茎部和叶片样品，称其质量。样品经消毒处理后在无菌研钵中用生理盐水研磨成匀浆，静置，取上清液，稀释后涂布至含四环素的抗性平板上培养48 h，在荧光显微镜下统计发光菌落数，5次重复，计算hg18-mCherry菌株的定殖数量。同时徒手切片，制作黄瓜植株根、茎、叶的临时玻片，在激光共聚焦显微镜（激发波长为561 nm）下观察hg18-mCherry菌株的定殖情况。

1.6 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2019软件对数据进行统计处理，采用IBM SPSS 26.0软件对数据进行成对样本t检验及Duncan’s多重比较方差分析，以P<0.05表示差异显著；使用Origin 2021绘制点线图及柱状图，误差线表示标准误。

2 结果与分析

2.1 多黏类芽孢杆菌hg18荧光标记阳性菌株的鉴定

挑取电转后的单克隆进行菌落PCR验证，结果（图1）显示，在1 000 bp上方有符合大小的目的条带，而对照hg18野生菌株未扩增到特异性条带，测序结果与pHY-PHpaⅡ-mCherry片段序列一致性为100%。说明mCherry荧光质粒已成功转入hg18菌株中，将该阳性克隆记为hg18-mCherry。

2.2 工程菌株hg18-mCherry荧光观察

在荧光显微镜下，野生菌株hg18菌落无红色荧光（图2-A），但工程菌株hg18-mCherry单菌落可见明显的红色荧光（图2-B），且hg18-mCherry单菌体在荧光场观察到菌体红色荧光（图2-C），表明mCherry得到了高效表达，工程菌可用于后续定殖动态研究。

2.3 工程菌株hg18-mCherry的生物学特性

2.3.1 生长曲线

菌株hg18和工程菌株hg18-Cherry的生长曲线如图3所示。由图3可知，培养4 h后，hg18和hg18-mCherry均进入指数增长期；hg18培养14 h进入稳定期，hg18-mCherry培养16 h进入稳定期，前期hg18-mCherry的生物量略低于hg18，但稳定期后二者生物量基本相当。该结果表明，外源质粒pHY-PHpaⅡ-mCherry的引入和mCherry荧光蛋白的表达对hg18菌株的前期生长略有影响，但达到稳定期后影响不明显。

2.3.2 群集运动能力

如图4所示，野生菌株hg18和工程菌株hg18-mCherry都具有群集运动能力，培养12 h后，hg18菌落直径为4.22 cm，hg18-mCherry菌落直径为4.19 cm，二者无显著差异（P>0.05），说明荧光标记质粒pHY-PHpaII-mCherry引入后不影响菌株hg18的群集运动能力。

2.3.3 生物膜合成能力

图5表明，培养48 h时，hg18野生菌株的OD₅₉₅为2.32，工程菌株hg18-mCherry的OD₅₉₅为2.19，二者无显著差异（P>0.05），说明荧光标记不会影响野生菌株hg18的生物膜合成能力。

2.3.4 室内抑菌能力

图6和表1显示，hg18菌株的抑菌率为65.24%，工程菌株hg18-mCherry的抑菌率为65.39%，二者无显著差异（P>0.05），表明荧光标记对hg18菌株的拮抗作用未产生明显影响。

2.4 工程菌株hg18-mCherry的遗传稳定性

hg18-mCherry的遗传稳定性检测结果（图7）表明，随着转接次数的增加，工程菌株hg18-mCherry的遗传稳定性呈降低趋势；经继代培养100 h后，其遗传稳定率为91.33%。说明荧光质粒在hg18菌株中基本可以稳定遗传。

2.5 工程菌株hg18-mCherry在黄瓜植株体内的定殖动态

由图8可知，工程菌株hg18-mCherry在黄瓜体内的定殖数量整体呈先升后降再趋于稳定的变化趋势，根部定殖量从第5天的3.4×10³ CFU/g逐步上升，第15天达到峰值，为1.13×10⁴ CFU/g，随后略有下降，第25天时定殖量为8.47×10³ CFU/g；茎部定殖量增长缓慢，第15天达到峰值，为4.73×10³ CFU/g，之后逐渐稳定在3.27×10³ CFU/g；叶片定殖量在第10天达到峰值，为1.53×10³ CFU/g，随后缓慢下降，第25天后稳定在0.87×10³ CFU/g。

由图8还可知，同一时间不同部位定殖量存在显著差异（P<0.05），定殖量从大到小依次为根>茎>叶。根部、茎部和叶部在10~20 d时的定殖量均无显著差异，说明该时段内工程菌株hg18-mCherry可在黄瓜植株内维持较为稳定的定殖量。

激光共聚焦显微观察发现，灌根15 d时，hg18-mCherry可在黄瓜根表皮黏附形成微菌落。从黄瓜根、茎、叶横切片中可以观察到，hg18-mCherry从根部侵入后沿植物维管系统向茎部、叶部移动传导定殖，偏好定殖于维管组织及其周围细胞间隙（图9-F~H），且在黄瓜各部位定殖菌体的荧光信号强度呈根>茎>叶，与平板涂布计数统计结果基本一致。

3 讨论

荧光基因标记技术是实现微生物在植物体内可视化追踪的核心手段，可为深入探究菌株定殖机制提供理想的试验材料^［21］。本研究选取mCherry荧光蛋白作为标记基因，通过PCR技术在分子层面确认了mCherry基因的导入，并成功构建荧光信号表达稳定的多黏类芽孢杆菌hg18-mCherry工程菌株，其与野生型hg18在菌落形态、生长速率、运动能力、生物膜合成能力及抑菌活性等方面的生物学特性一致，这与钟常城等^［22］所报道的结果相同，说明mCherry基因的表达不会影响hg18的生物学特性。吴启叶等^［23］使用mCherry成功实现了4种革兰氏阴性细菌的荧光标记，结果表明携带mCherry红色荧光蛋白基因的菌株遗传稳定性显著高于携带GFP绿色荧光蛋白基因的菌株。本研究中，hg18-mCherry菌株在无选择压力下转接培养100 h后遗传稳定率达91.33%，表明该工程菌株满足定殖动态研究的需求，可作为研究其定殖示踪的便捷工具。

内生菌在植物体内的定殖部位及数量的动态变化，是其与宿主植物互作关系的直接体现^［24］。刘敏等^［25］对人参内生细菌定殖消长动态的研究发现，ge15和ge25菌株在人参根和茎中的定殖数量均呈先升后降再逐渐平稳的趋势；烟草内生解淀粉芽孢杆菌YN2014042在烟草根部定殖50 d后仍能维持较高数量^［26］。在本研究中，多黏类芽孢杆菌hg18在黄瓜植株内定殖量整体呈先升后降再趋于稳定的趋势，这与人参及烟草内生菌的定殖规律基本一致^［25-26］。维管组织系统是植物水分以及有机养分运输的核心通道，也是土传病原菌侵染定殖扩散的主要路径^［27］。魏春燕等^［28］报道内生固氮克雷伯氏菌DX120在甘蔗植株内可实现从根表到叶部的迁移定殖，这与本研究结果相似，hg18-mCherry菌株可通过维管组织实现全株传导定殖，且可在维管组织聚集形成优势菌群，竞争性占据病原菌侵染扩散位点，这一特性可能是其防控土传病害的关键机理之一。前期研究已证实，hg18具有良好的抑菌及促生作用^［13］，推测其定殖后在定殖位点分泌抑菌物质及吲哚乙酸等生长素而实现抑制病原菌定殖、传导及促进植物生长的双重作用。不同内生菌定殖存在显著菌株特异性，金利容等^［29］报道的恶臭假单胞菌HB3S-20能附着在棉花根系表面，还可定殖在根部维管组织中。邱珊莲等^［30］证实内生菌甲基对硫磷降解菌DLLBR倾向于定殖于维管束结构密集的根茎部位，在叶片未观察到菌株定殖。而本研究中，hg18菌株可沿维管系统从根部向茎、叶部传导并全株定殖，推测可能是hg18菌株趋化性及运动信号传导途径相关基因在传导定殖过程中起到了关键作用，但具体机制尚待进一步研究。

本研究通过盆栽试验初步明确了hg18菌株在黄瓜体内的定殖规律，但由于田间土壤环境以及土壤微生物群落竞争、气候差异等因素对于植物内生细菌的定殖具有较大的影响，因此，后续还需开展田间试验进行验证，明确环境条件及土壤微生物群落对hg18定殖的影响等。此外，该菌株在黄瓜中实现特异性定殖的信号传导分子机制仍待厘清，后续需进一步解析其在宿主特异性识别、细胞黏附及体内定殖全过程中核心功能基因的作用，为该菌株的产业化应用提供更完备的理论基础。

4 结论

本研究以多黏类芽孢杆菌hg18为对象，利用mCherry荧光基因标记技术成功构建hg18-mCherry工程菌株，其在生长、群集运动、生物膜形成及抑菌等生物学特征上与野生菌株hg18基本一致，且遗传稳定性在传代培养100 h后仍保持91.33%。灌根后工程菌株hg18-mCherry可在黄瓜植株体内定殖，随定殖时间的延长，其定殖量整体呈现先升后降再趋于稳定的动态变化趋势，且根部定殖量显著高于茎部和叶片。本研究结果为将hg18菌株开发为土传病害生防菌剂奠定了理论基础。

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基金资助

甘肃省重大专项计划项目“枯草芽孢杆菌B2及耐盐碱多功能微生物菌剂的研发与试验示范”(24ZDNA009-2)