基于SNP的4个白花牡丹品种鉴别

SNP‐based identification of four white‑flowered tree peony cultivars

摘要

目的 明确4个白花牡丹品种在分子基因水平上的差异特征，实现品种的精准鉴别，为牡丹种质资源的建库保存及育种亲本的科学配置提供依据。 方法 以‘白王狮子’、‘白幡龙’、‘白神’以及‘莲鹤’4个白花牡丹品种为研究材料，开展形态学调查并提取叶片基因组DNA；利用特异性引物对植物花发育抑制基因EMF1以及叶绿体分裂基因ARC6和PARC6进行PCR扩增和Sanger法测序，比较不同品种间的单核苷酸多态性（SNP）位点，分析其遗传差异与亲缘关系。 结果 EMF1基因的3个SNP位点在4个品种间完全一致。ARC6和PARC6基因中均存在稳定的SNP差异，能够有效区分4个品种。综合SNP特征可知，‘莲鹤’与‘白神’遗传特征较为接近；‘白王狮子’与‘白幡龙’的序列高度一致，二者在多个位点均未表现出遗传分化。 结论 ARC6与PARC6基因的SNP位点可作为4个白花牡丹品种的有效分子标记；在4个品种中，‘莲鹤’与‘白神’的亲缘关系相对较近，而‘白王狮子’与‘白幡龙’的遗传背景几乎相同，推测其可能属于同一品种或关系很近。

Abstract

Objective This study aims to clarify the molecular genetic differences among four white-flo-wered tree peony cultivars and achieve their precise identification，thereby providing a scientific basis for the construction of germplasm bank and the rational selection of parental lines in breeding. Method Four white-flo-wered tree peony cultivars，including ‘Baiwangshizi’，‘Baifanlong’，‘Baishen’，and ‘Lianhe’，served as experimental materials.Morphological observations were conducted and genomic DNA was extracted from their leaves.Specific primers were designed for plant flowering suppression gene EMF1，and chloroplast division genes ARC6 and PARC6，followed by PCR amplification and Sanger sequencing. Single nucleotide polymorphisms （SNPs） among the four cultivars were compared to analyze genetic variations and relationships. Result The three examined SNPs of the EMF1 gene were completely identical among all four cultivars.Stable SNP variations in both ARC6 and PARC6 can effectively differentiate the four cultivasr.Based on SNP profiles，‘Lianhe’ and ‘Baishen’ were genetically close，whereas ‘Baiwangshizi’ and ‘Baifanlong’ exhibited highly similar sequences without detectable genetic differentiation at multiple sites. Conclusion SNP sites within the ARC6 and PARC6 genes can serve as effective molecular markers for distinguishing the four white-flowered tree peony cultivars.Among them，‘Lianhe’ and ‘Baishen’ are relatively closely related，whereas ‘Baiwangshizi’ and ‘Baifanlong’ share nearly identical genetic backgrounds，suggesting that they may represent the same or very closely related cultivars.

Graphical abstract

关键词

白花牡丹 / 单核苷酸多态性 / 表型性状 / 品种鉴别

Key words

white-flowered tree peony / single nucleotide polymorphism （SNP） / phenotypic traits / cultivar identification

牡丹（Paeonia suffruticosa）为芍药科芍药属落叶灌木，也被称为“木芍药”，其因花大色艳、观赏价值高而被广泛栽培。牡丹植株一般高约1~1.5 m，二回三出复叶，小叶常分裂成3~5裂^［1］，花期多在4月，开单瓣或重瓣的大型花，花径可达数十厘米，花色包括白、粉、红、紫、黄等9种。牡丹具有悠久的栽培与育种历史。现代栽培的牡丹起源于中国，是历代园艺工作者经长期选育而成^［2］。作为一种既有观赏价值又具药用价值的植物，牡丹在中国文化、园艺、医学等领域都有重要地位，其根皮被称为“丹皮”，自古就用于中药，有清热凉血、活血化瘀等作用^［3-4］。另一方面，牡丹因其“雍容华贵、富贵典雅”的花姿，在传统园林、高端切花生产、景观艺术设计和现代花卉产业中有广泛应用。在实际栽培与观赏中，牡丹显示出极高的多样性与丰富性，不同栽培品种在花型、花色、花瓣层数、开花时间、叶形、株型等方面差异巨大。白花牡丹花色素雅、清丽脱俗，往往被用于庭院布置、景区造景以及商业切花中，其因纯洁雅致的观赏特质在古典园林造景、高端鲜切花生产及特色育种实践中均占据不可替代的重要地位，具有极高的综合利用价值。

观察发现，4个常见白花牡丹品种‘白王狮子’、‘白幡龙’、‘白神’及‘莲鹤’在营养生长阶段的叶片形态、叶脉密度及株型结构相近；进入花期后，其花瓣层数、花萼形态、花径大小等关键观赏性状亦表现出很大相似性。另外，在有关牡丹的书籍记载中也显示，‘白神’和‘白幡龙’的表型高度相似^［5］。因此，仅仅依赖传统形态学特征的直观鉴定易出现品种误判的问题，这不仅给牡丹品种资源的系统整理、种质资源库的精准建库带来困难，还会导致良种繁育过程中的亲本错配，进而影响育种效率与目标性状的稳定性。

分子标记技术不依赖表型性状，有稳定性强和不受取材部位限制等优点，为植物品种鉴别、遗传育种和亲缘关系分析提供了有力工具。目前随机扩增多态性DNA （random amplified polymorphic DNA，RAPD）^［6-7］、简单重复序列间扩增 （inter simple sequence repeat，ISSR） ^［8］、简单重复序列（simple sequence repeats，SSR） ^［9］等标记已应用于品种鉴定、分子指纹图谱的构建和遗传连锁图谱的绘制。但这些分子标记比较复杂，需要大量筛选特异性高的引物，且凝胶电泳结果的分辨率和准确性不高，应用于牡丹品种鉴别有较大局限性。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指个体在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为新一代分子标记，基于基因组单个核苷酸变异，具备分布密度高、稳定性强、多态性丰富及可高通量检测等优势，其均匀的基因组分布可捕捉品种间细微的遗传差异，检测标准化程度与重复性优于传统标记，且检测效率更高，可以很好地用于品种的鉴别。近年来，SNP标记已广泛应用于桂花^［10］、柿树^［11］、葡萄^［12］、月季^［13］、波斯毛茛^［14］等园艺植物的品种鉴定、遗传多样性分析及分子身份证构建，成功实现了品种精准区分与亲缘关系解析。随着测序技术的发展，SNP标记在核心位点筛选、高通量分型及种质溯源等方面取得了显著成果，为园艺植物品种鉴别与种质创新提供了关键技术支撑，但迄今鲜有利用该标记开展牡丹品种鉴别的相关报道。为此，本研究以‘白王狮子’、‘白幡龙’、‘白神’及‘莲鹤’等4个白花牡丹品种为对象，依托研究前期建立的SNP高分辨率分析体系^［15］，通过扩增基因组中存在SNP的几个基因片段，系统解析不同品种之间在基因分子水平上的差异，旨在为白花牡丹品种的鉴定、种质资源的真伪鉴别提供可靠的科学支撑，并为后续杂交育种中亲本的精准选配奠定坚实的分子基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究所用的4种白花牡丹材料‘莲鹤’、‘白神’、‘白王狮子’和‘白幡龙’均采集自中国洛阳国家牡丹基因库（河南省洛阳市），于花期观察其形态学差异。试验材料选取各品种健康无损伤的新鲜叶片，经液氮速冻处理后，置于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于后续基因组 DNA 的提取。

1.2 植物DNA提取

植物样本用液氮研磨成细粉，与预热至65 ℃的CTAB裂解液混合。加入RNase（质量浓度10 mg/mL），在65 ℃水浴锅中温浴20 min，其间每隔5 min轻轻上下颠倒摇匀，以保证样本充分裂解。裂解后取出，冷却至室温，8 000 g离心5 min，取上清液转移到新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）混匀，然后在12 000 r/min（13 800 g）下离心10 min，重复提取2次。取上清液转移到新离心管中，与等体积预冷的异丙醇混匀，于-20 ℃放置1 h，12 000 g离心10 min，弃去上清液。样本干燥5 min至DNA沉淀呈半透明状，加入50 μL含RNase的TE缓冲液中，37 ℃水浴消化30 min，冻存在-20 ℃冰箱中。

1.3 EMF1、ARC6和PARC6基因PCR扩增及测序

设计并合成上、下游特异性引物，针对EMF1、ARC6及PARC6等3个目的基因分别进行PCR扩增，其中EMF1基因使用引物对BCL-EMF1-1/BCL-EMF1-2，ARC6基因使用引物对BCL-ARC6-1/ BCL-ARC6-4，PARC6基因使用引物对BCL-PARC6-1/BCL-PARC6-2。按照常规PCR反应体系配制反应混合液，完成目的片段扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测验证；验证合格的产物进行Sanger法测序。PCR引物信息详见表1。

1.4 单核苷酸多态性的可视化

Sanger测序的ab1文件结果可以用于识别杂合的SNP位点。该研究使用SnapGene可视化Sanger测序结果的序列图谱，将ab1文件的峰图x轴和y轴放大2倍展示结果。作图截取杂合SNP位点时，在前后位点分别各增加5个核苷酸。

2 结果与分析

2.1 4种白花牡丹的形态学观察

‘白王狮子’、‘白幡龙’、‘白神’以及‘莲鹤’均为晚花型白色系牡丹品种，在具体形态上几乎不存在差别。其中，‘莲鹤’房衣、柱头、花丝均为白色，花型为菊花型且花层较少，瓣数相对稀疏（图1-A）；‘白神’花色纯白，房衣呈乳黄色，柱头、花丝为白色，花型为菊花型至蔷薇型，雄蕊偶有瓣化，整体花型结构与其余三者存在一定差异（图1-B）；‘白王狮子’花色纯白，房衣紧密包裹且为白色，柱头呈乳黄色，花型同样为菊花型，花层和瓣数特征与‘莲鹤’高度相似（图1-C）；‘白幡龙’花色纯白，花瓣边缘具锯齿与波纹，花丝呈微白色，花型为蔷薇型，花瓣质硬，柱头、房衣均为白色（图1-D）。从花表型上来看，4 个白花牡丹品种差异小，仅‘白神’在花型上与其他3种白花牡丹有差异，而其余3种牡丹花的表型差异不明显。

2.2 4种白花牡丹不同基因的SNP位点差异分析

2.2.1 EMF1基因

为探究‘白王狮子’、‘白幡龙’、‘白神’以及‘莲鹤’4个白花牡丹品种在基因分子水平上是否存在差异，本研究首先选取参与植物花发育调控的EMBRYONIC FLOWER 1（EMF1）基因^［16-18］，进行PCR扩增及Sanger法测序。测序结果显示，4个品种在EMF1基因的3个具有SNP的检测位点上，碱基类型及峰型特征均完全一致（图2，表2）。

2.2.2 ARC6基因

叶绿体分裂关键基因ACCUMULATION AND REPLICATION OF CHLOROPLASTS6（ARC6）^［19-20］的PCR扩增及Sanger法测序结果（图3，表3）显示，4个品种在该基因的SNP位点检测中存在差异。其中，在位点1上，‘莲鹤’和‘白神’样本检测到腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）碱基，‘白王狮子’和‘白幡龙’则仅检测到G；在位点2中，‘莲鹤’与‘白神’碱基一致，均为胞嘧啶（C），‘白王狮子’与‘白幡龙’存在相同的SNP位点，检测到C与胸腺嘧啶（T）碱基；在位点3中，4个样本均存在SNP位点，均检测到A与G碱基。可见，‘莲鹤’与‘白神’在ARC6基因的SNP位点一致，而‘白王狮子’与‘白幡龙’一致，且这两组品种间存在明显碱基差异。上述分子水平的SNP位点特征表明，‘莲鹤’与‘白神’、‘白王狮子’与‘白幡龙’两两间亲缘关系相对更近。

2.2.3 PARC6基因

为进一步精准区分上述4个白花牡丹品种，本研究选取叶绿体分裂相关的基因PARALOG OF ARC6（PARC6）^［21-22］进行 PCR 扩增及 Sanger 法测序，以揭示各品种的亲缘关系差异。其中，在第1个位点上，仅‘莲鹤’存在杂合 SNP 位点，检测到T与C碱基，其余3个品种在此位点均仅检测到T碱基；在位点2中，‘莲鹤’与‘白神’序列一致，均为C碱基，‘白王狮子’与‘白幡龙’则存在杂合SNP位点，检测到G与C碱基；在位点3中，‘白神’、‘白王狮子’、‘白幡龙’均存在杂合SNP位点，检测到C与G碱基，而‘莲鹤’在此位点仅检测到C碱基（图4，表4）。上述结果表明，‘莲鹤’与‘白神’在PARC6基因这3个位点中存在差异，‘白王狮子’与‘白幡龙’间则无差异。结合ARC6基因的SNP特征，进一步佐证了‘莲鹤’与‘白神’亲缘关系较近、‘白王狮子’与‘白幡龙’亲缘关系则更紧密的结论。

3 讨论

本研究通过形态学观察结合EMF1、ARC6、PARC6基因的单核苷酸多态性（SNP）位点分析，系统探究了4个白花牡丹品种在表型及基因和分子水平上的差异，为白花牡丹品种精准鉴别及遗传背景解析提供了分子证据。

形态学分析显示，4个白花牡丹品种在花色纯度、花型结构等核心表型性状上高度保守，仅在花型上存在细微分化。这种核心表型的高度保守性可能源于白花牡丹育种中对花色核心目标的定向选择，而品种特异性表型的形成则可能与亲本遗传背景差异或选育过程中的突变积累密切相关。

在分子水平上，ARC6与PARC6作为叶绿体分裂调控的核心保守基因，其序列变异可以反映品种间的进化分化程度，基于这2个基因的SNP分子标记具有较高可靠性。ARC6与PARC6基因的SNP位点分析揭示了4个白花牡丹品种间的遗传差异：其中‘莲鹤’与‘白神’遗传特征较为相似，‘白王狮子’与‘白幡龙’遗传特征也高度吻合，表明这两组品种间的遗传关联更为紧密；进一步结合PARC6测序结果可见，‘莲鹤’与‘白神’存在明确遗传差异，而‘白王狮子’与‘白幡龙’未检测到遗传分化，推测二者关系极近或可能是同一品种。

牡丹作为我国传统名花，栽培品种繁多且部分亲缘关系相近，多个品种在花色、花型、叶形等外形特征上高度相似，传统形态学分类依赖结实率、花瓣基部色斑、花期等性状，易受环境因素干扰，且对于外形相似品种的鉴别分辨率有限，给牡丹品种精准鉴别带来极大挑战^［23-24］。迄今，牡丹品种鉴别研究多聚焦于花色、花型、叶片形态等多种形态学性状综合分析^［25-27］，普遍认为白花牡丹品种间表型差异较小，这与本研究中4个白花牡丹品种表型高度保守的结果一致。

相较于形态指标，基因的核苷酸序列多态性比较稳定，可以用于品种的鉴定、分析比较以及亲缘关系分析^［15］。目前RAPD、ISSR、SSR、CDDP等标记技术已被应用于牡丹亲缘关系分析。RAPD技术操作简便、成本较低，但存在重复性差等问题，限制了其在精准鉴定中的应用^［6-7］；ISSR标记多态性较高，但需多引物组合使用，对亲缘关系极近的品种区分能力有限^［8］；SSR标记具有共显性、稳定性强等优点，已用于牡丹遗传多样性分析与指纹图谱构建^［9，28］，但该标记开发依赖基因组序列信息，对单个碱基差异的分辨能力不足，难以满足白花牡丹品种间细微遗传差异的鉴别需求^［6］；CDDP虽在牡丹花色相关遗传研究中有应用^{［24，28］}，但其PCR扩增反应仅用一条引物，使其扩增出的多态性条带的本质不够明确^［24］。本研究选择SNP分子标记用于4个白花牡丹品种的鉴别，主要基于SNP技术是单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，稳定性强，分辨率高，可捕捉品种间细微遗传差异，实现目标品种的精准鉴别。目前SNP技术在牡丹研究中主要用于高密度遗传连锁图谱的构建^［29］以及早花相关遗传变异的鉴定与功能基因筛选^［30］，主要服务于分子标记辅助育种，其重点在于群体水平的性状关联。本研究通过SNP分析，不仅在基因分子层面增加了人们对4个白花牡丹品种特异性差异的认知，还为牡丹的品种鉴别提供了一种新的方法，对提升牡丹品种资源利用效率、推动牡丹产业高质量发展具有重要的理论价值与实践指导意义。

4 结论

‘莲鹤’、‘白神’、‘白王狮子’和‘白幡龙’4个白花牡丹品种在核心表型性状上高度保守，仅存细微分化；ARC6与PARC6基因的SNP位点可作为4个白花牡丹品种的有效分子标记，其中‘莲鹤’与‘白神’的亲缘关系相对较近，而‘白王狮子’与‘白幡龙’的遗传背景几乎相同，推测其可能属于同一品种或关系很近。本试验建立了基于功能基因SNP的品种鉴别方法，为牡丹种质资源鉴定、遗传背景解析提供了重要支撑。

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基金资助

河南省科学技术厅中原学者工作站项目(254400510008)