葡萄TINY1转录因子克隆及其在拟南芥水涝胁迫响应中的功能分析

Cloning and functional analysis of grape transcription factor VvTINY1 in Arabidopsis response to waterlogging stress

摘要

目的 探讨葡萄ERF转录因子DREB亚家族成员VvTINY1在植物水涝响应过程中的作用。 方法 以赤霞珠葡萄为材料，克隆获得VvTINY1基因，利用生物信息学手段分析其序列特征与系统进化关系，对VvTINY1蛋白进行亚细胞定位分析，采用RT-qPCR法分析VvTINY1基因在葡萄不同组织（根、茎、叶、花序、芽和果实）中的表达特性。构建VvTINY1过表达拟南芥材料，对其进行渍水处理（WL），观察表型变化，测定乙醇脱氢酶（ADH）活性及H₂O₂和丙二醛（MDA）含量，并采用RT-qPCR测定低氧胁迫响应基因AtADH、AtPDC、AtHB1、AtHB2、AtPCO1和AtPCO2的表达水平。 结果 成功克隆了750 bp的VvTINY1基因CDS区，其编码蛋白含典型AP2/ERF保守结构域，定位于细胞核。VvTINY1基因在赤霞珠葡萄根和茎中表达量较高。WL处理下，VvTINY1过表达（VvTINY1-OE1、VvTINY1-OE2）与野生（WT）拟南芥均出现叶片黄化和边缘卷曲等水涝伤害症状，但过表达株系抽薹和开花时间提前。与WT相比，VvTINY1过表达拟南芥株系中ADH活性及H₂O₂和MDA含量均显著降低。RT-qPCR结果表明，WL处理下，VvTINY1-OE1株系中AtADH、AtPDC、AtHB1、AtPCO1和AtPCO2等低氧胁迫响应相关基因表达显著升高。 结论 VvTINY1在葡萄水涝胁迫响应中发挥正向调控作用，可能通过减轻氧化损伤、调节低氧代谢及低氧信号响应来提高葡萄对水涝胁迫的适应能力。

Abstract

Objective This study aims to investigate the role of VvTINY1，a DREB subfamily member of the ERF transcription factor family in grapevine，in plant responses to waterlogging stress. Method Using Vitis vinifera cv.Cabernet Sauvignon as the experimental material，the VvTINY1 gene was cloned，after which its sequence characteristics and phylogenetic relationships were analyzed by bioinformatics.Transient expression analysis determined the subcellular localization of VvTINY，and RT-qPCR revealed its expression patterns in different tissues，including roots，stems，leaves，inflorescences，buds，and fruits.Arabidopsis plants overexpre-ssing VvTINY1 were generated and exposed to waterlogging stress （WL） for phenotypic changes.Subsequent measurements included alcohol dehydrogenase （ADH） activity，H₂O₂ content，and malondialdehyde （MDA） content，while RT-qPCR quantified the expression levels of hypoxia-responsive genes，including AtADH，AtPDC，AtHB1，AtHB2，AtPCO1，and AtPCO2. Result The 750 bp CDS of VvTINY1 was successfully cloned，encoding a protein with a typical AP2/ERF conserved domain that localized in the nucleus.VvTINY1 was highly expressed in the roots and stems of ‘Cabernet Sauvignon’ grapevine.Under waterlogging （WL） treatment，both wild-type （WT） and VvTINY1-overexpressing Arabidopsis plants （VvTINY1-OE1 and VvTINY1-OE2） exhibited waterlogging injury symptoms，including leaf chlorosis and marginal curling，whereas the overexpression lines bolted and flowered earlier than WT.Compared with WT，the VvTINY1 overexpression lines exhibited significantly lower ADH activity and reduced H₂O₂ and MDA contents.RT-qPCR analysis further revealed that，under WL treatment，the hypoxia-responsive genes AtADH，AtPDC，AtHB1，AtPCO1，and AtPCO2 were significantly upregulated in the VvTINY1-OE1 line. Conclusion VvTINY1 functions as a positive regulator in Vitis vinifera response to waterlogging stress，potentially enhancing Vitis vinifera adaptation to waterlogging by alleviating oxidative damage and modulating hypoxic metabolism and hypoxia signaling pathways.

Graphical abstract

关键词

葡萄 / VvTINY1 / 水涝胁迫 / 拟南芥

Key words

Vitis vinifera / VvTINY1 / waterlogging stress / Arabidopsis thaliana

近年来，随着全球气候变化的持续加剧，极端降水事件频繁发生且强度不断上升，水涝胁迫已成为制约葡萄（Vitis vinifera）种植业可持续发展的关键限制因素之一^［1］。葡萄为全球重要的经济果树作物，在我国农业生产中占据重要地位。受益于显著的经济价值、政策大力支持以及种植加工技术的持续进步，葡萄产业在我国多个地区已成为推进乡村振兴和促进农民增收的重要支柱产业。然而，在气候异常背景下，尤其是我国南方地区如湖南、湖北、四川、贵州和云南等地，常年高温高湿的环境叠加强降雨，极易导致土壤严重积水，葡萄植株因此易出现叶片黄化、根系腐烂、早期落叶等生理障碍，并且对白粉病、霜霉病等病害的感病性显著增强^［2］。若水涝发生于果实成熟期，还可能导致果实开裂、糖分积累不足、有机酸降解延迟以及酚类代谢紊乱，严重影响产量和品质^［3］。目前，防控水涝胁迫的主要农艺措施包括建设排水设施、避雨栽培、限根栽培、高垄栽培等^［4］，这些方法虽能缓解短期水涝胁迫，但其效果受环境条件制约，且无法增强葡萄植株自身抗性。因此，从分子层面解析葡萄的水涝应答机制，挖掘关键调控基因，培育耐涝品种，是实现根本性防控的重要途径^［5］。

植物应对水涝胁迫的分子机制十分复杂，通常涉及激素信号转导、活性氧清除、能量代谢重构及转录调控等多个环节。由土壤积水导致的根系缺氧是水涝胁迫最核心的初始逆境，为适应低氧环境，植物会迅速启动一套保守的低氧应答程序，涉及从感知、信号转导到代谢重塑等一系列基因的协同表达。在该程序中，乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxy-lase，PDC）、同源异型盒（homeobox，HB，包括HB1和HB2）以及脯氨酸氧化酶（plant cysteine oxidases，PCO，包括PCO1和PCO2）等基因已被广泛证实为关键的响应标志基因，其表达水平常作为评估植物耐涝性及解析低氧适应机制的核心分子指标^［6］。植物转录因子是逆境响应过程中的核心调控因子之一，能够识别靶基因启动子的顺式作用元件，调节其表达，以增强植物抗逆性^［7］。其中，花器官发育蛋白2/乙烯响应因子（APETALA2/Ethylene-responsive factor，AP2/ERF）为植物特有的转录因子家族，广泛参与植物对非生物胁迫（如干旱、盐碱、低温、水涝等）的响应调控^［8-9］。该家族通常含有保守的AP2结构域，根据AP2结构域的种类和序列特征，可进一步将其划分为AP2、ERF、DREB与RAV等4个亚类^［10］，其中DREB类中的A4亚家族成员TINY转录因子已被证实在多种胁迫响应中发挥重要作用^［11］。已有研究显示，TINY转录因子参与植物对干旱、盐胁迫和脱落酸信号的响应。如拟南芥AtTINY可调控油菜素内酯信号途径，通过油菜素内酯不敏感2蛋白磷酸化及与油菜素内酯不敏感1-甲磺酸乙酯-抑制子1的拮抗作用调节生长与干旱应答^［12］。玫瑰RcTINY2在脱落酸、聚乙二醇及NaCl胁迫下表达显著上调，将该基因在拟南芥中过表达可增强植株对胁迫的敏感性^［13］。此外，苹果MdTINY可促进花青苷积累，抑制愈伤组织生长，表明其可能兼具生长与代谢调控功能^［14］。

本课题组前期研究发现，在葡萄根系遭受水涝胁迫3~6 d后，多个AP2/ERF家族转录因子呈持续上调表达趋势，其中VvTINY1基因表达量显著上调^［15］，因而被选为水涝胁迫响应研究的关键候选基因。为进一步探究VvTINY1基因在葡萄抗涝机制中的功能，本研究以赤霞珠葡萄（Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon）为材料，对VvTINY1基因进行了克隆、生物信息学分析、亚细胞定位和组织表达模式分析，并将其在拟南芥中过表达，对过表达拟南芥中低氧响应标志基因（AtADH、AtPDC、AtHB1、AtHB2、AtPCO1及AtPCO2）的表达量进行了测定，旨在解析VvTINY1在葡萄响应水涝胁迫过程中的潜在生物学功能，为葡萄抗涝分子育种提供理论依据与候选基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究使用的植物材料包括赤霞珠葡萄和拟南芥Col-0株系。质粒pCAMBIA1300和pTF486-GFP及大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101，均购自唯地生物技术有限公司（上海）。试验所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 VvTINY1基因CDS的克隆与生物信息学分析

试验材料赤霞珠葡萄植株种植于西北农林科技大学葡萄酒学院曹新庄葡萄种植基地（陕西杨凌，34.29° N，108.35° E）。于冬季（12月）剪取健康休眠枝条，转移至葡萄酒学院人工气候培养间内进行水培扦插以诱导萌发，培养条件为：光照周期16 h/8 h（昼/夜），温度25 ℃，相对湿度60%。待新梢长出后，摘取新生枝条上完全展开的成熟健康叶片，用液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。采用RNA提取试剂盒（DP432，天根，北京）提取葡萄叶片总RNA，并使用反转录试剂盒（R323-01，诺唯赞，南京）合成cDNA。依据NCBI公布的VvTINY1基因序列设计特异性引物（F：5'-ATGGCTGAGCCGCTGAATTC-3'，R：5'-GTTATT-ATCCCACAAAAAG-3'）。以cDNA为模板，PCR扩增VvTINY1基因CDS。PCR扩增体系为50 μL，其中包含10×PCR Buffer（含Mg²⁺）5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL、上下游引物（10 μmol/L）各2 μL、cDNA模板2 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，用灭菌双蒸水补足至50 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃终延伸10 min。取5 μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DC301-01，诺唯赞，南京）对目的基因片段进行切胶回收纯化，将纯化产物交由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

利用NCBI BLAST程序将VvTINY1与椰子（Cocos nucifera）、豌豆（Pisum sativum）、苹果（Malus domestica）、烟草（Nicotiana tabacum）、高粱（Sorghum bicolor）及陆地棉（Gossypium hirsutum）等物种TINY1编码的蛋白序列进行同源比对。利用MEGA12软件的ClustalW进行多重序列比对，并采用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树。采用SOPMA在线工具预测蛋白二级结构，通过InterPro数据库注释蛋白功能结构域，基于SWISS-MODEL平台构建并优化蛋白三维结构模型。

1.3 VvTINY1基因的组织表达模式分析

于赤霞珠葡萄花期（2023-05-23）采集植株的根、茎、成熟叶片、芽、花序，于果实成熟期（2023-08-15）采集果实，所有样本用液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中保存。采用RNA提取试剂盒提取葡萄各组织总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA。将反转录得到的cDNA产物进行适当稀释，调整其质量浓度为100 ng/μL，作为实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的模板。使用NCBI网站设计VvTINY1基因及内参基因VvActin（登录号：XM_002282480）的特异性RT-qPCR引物，引物序列如表1所示。RT-qPCR的反应体系和程序同1.2节，使用2^-ΔΔCt 方法^［16］计算VvTINY1基因的相对表达量。每个样品设3个生物学重复和3个技术重复。

1.4 VvTINY1蛋白的亚细胞定位分析

PCR扩增VvTINY1基因CDS（试验所用引物序列F：5'-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGCTGAGCCGCTGAATTC-3'，R：5'-CACCACCACCACCACCGGATCCGTTATTATCCCAC-AAAAAG-3'，下划线碱基为连接pTF486-GFP的同源臂）。将VvTINY1基因编码区克隆至pTF486-GFP表达载体，构建P_35S：：VvTINY1-GFP亚细胞定位载体。取光照培养约4周的拟南芥健康莲座叶，参照Yoo等^［17］的方法分离叶肉原生质体，并采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介导法将载体P_35S：：VvTINY1-GFP和核定位标记载体P_35S：：Dof1a-mCherry共转化拟南芥叶肉细胞原生质体，培养18 h后，使用激光共聚焦显微镜（TCS SP8SR，莱卡）观察GFP荧光信号分布情况，确定VvTINY1蛋白的亚细胞定位。

1.5 VvTINY1过表达拟南芥构建与功能验证

1.5.1 VvTINY1过表达拟南芥植株构建

PCR扩增VvTINY1基因的CDS（引物序列F：5'-AC-AGTCGACTCTAGAGGATCCCCATGGCTGA-GCCGCTG-3'，R：5'-GGCCTACCGAATTCGA-GCTCGTTATTATCCCACAAA-3'，下划线碱基为连接pCAMBIA1300载体的同源臂）。采用一步克隆试剂盒（C112，诺唯赞，南京）将VvTINY1基因CDS序列插入植物表达载体pCAMBIA1300中，并置于CaMV35S启动子控制下，构建过表达载体pCAMBIA1300-VvTINY1。采用热激法将pCAMBIA1300-VvTINY1转化入根癌农杆菌 GV3101感受态细胞中。采用花序浸染法将pCAMBIA1300-VvTINY1转化野生型（wild type，WT）拟南芥Col-0，将T₁代转化植株在含50 mg/L卡那霉素的1/2 MS培养基上进行筛选，获得2个抗性植株，经连续自交获得2个T₃代纯合株系（VvTINY1-OE1、VvTINY1-OE2），经基因组PCR鉴定为VvTINY1过表达阳性植株。

1.5.2 VvTINY1过表达拟南芥功能验证

选取生长均一的21日龄（10叶期）VvTINY1-OE1、VvTINY1-OE2与野生型拟南芥，参考李健^［18］的方法进行渍水处理（waterlogging，WL）：将拟南芥植株置于装水的塑料桶（35 cm×23 cm×36 cm）中，用蒸馏水将植株完全淹没，使得水面高于植株顶部叶片上方约10 cm，保证完全达到低氧环境。随后将塑料桶放到温度为22 ℃的黑暗环境中渍水处理5 d。渍水结束后（将结束水涝胁迫的当日记为0 d），取出植株，用保鲜膜密封，放置于正常生长条件下进行复氧处理，分别于渍水结束后1，3和5 d观察表型，拍照记录。在渍水结束后5 d采集拟南芥叶片，利用试剂盒（格锐思生物科技，苏州）分别测定乙醇脱氢酶的活性及H₂O₂和丙二醛（MDA）含量；以AtActin为内参基因，参考1.3节的方法采用RT-qPCR检测水涝条件下低氧胁迫响应基因AtADH、AtPDC、AtHB1、AtHB2、AtPCO1和AtPCO2的表达水平（试验所用引物序列见表1）。试验设置未进行渍水处理的拟南芥为对照组（CK）。

1.6 数据统计分析

试验数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析，通过单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey事后检验进行组间差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 VvTINY1基因CDS的克隆与生物信息学分析

采用PCR扩增技术成功获得VvTINY1基因CDS区域，扩增片段长度约为750 bp，条带清晰，大小与理论预期一致（图1）。结果表明，VvTINY1基因CDS区域克隆成功。

生物信息学分析结果显示，VvTINY1编码一个由241个氨基酸组成的蛋白，其理论分子质量为26.13 ku，等电点为4.99；蛋白不稳定指数为72.77，预测为不稳定蛋白。系统进化分析结果显示，VvTINY1与木槿（Hibiscus syriacus）TINY1（HsTINY1）和陆地棉TINY1（GhTINY1）聚为一支，同属于Ⅵ组，系统发育关系较近（图2）。多序列比对结果显示，TINY1蛋白第57-114位氨基酸区段为AP2/ERF保守结构域，与预测的DREB类A4亚家族保守结构域位置一致（图3）。

二级结构预测结果（图4-A）表明，VvTINY1蛋白以无规则卷曲为主（58.92%），同时包含α-螺旋（29.88%）、β-折叠（8.30%）及β-转角（2.90%）。VvTINY1三级结构预测结果如图4-B所示，使用A0A6P5ZVD2.1.A蛋白进行同源建模，序列一致性为78.24%，GMQE值为0.64。图4-C为VvTINY1三级结构模型的拉氏构象图，由该图可以看出，大多数模型点位于深色区域（允许区）和浅色区域（最大允许区），少数模型点位于白色区域（不允许区），因而可认为该模型合理性较高。

2.2 VvTINY1在葡萄不同组织中的表达模式

采用RT-qPCR检测VvTINY1在赤霞珠葡萄不同组织（根、茎、叶、花序、芽、果实）中的表达情况。结果（图5）显示，VvTINY1在茎中表达量最高，达到38.63，显著高于其他组织（P<0.05）；在根中表达量次之，为17.90；在叶、芽和花序中的表达量相对较低；在果实中的表达量最低，仅为根部的2.58%。结果提示，VvTINY1可能在茎、根等营养器官中发挥重要功能。

2.3 VvTINY1蛋白的亚细胞定位分析

激光共聚焦显微镜观察结果如图6所示。由图6可知，P_35S∷VvTINY1-GFP转化组拟南芥叶肉细胞原生质体发出的绿色荧光信号与P_35S∷Dof1a-mCherry转化组拟南芥叶肉细胞原生质体的红色核信号重合，表明VvTINY1定位于细胞核，符合其转录因子的功能特性。

2.4 VvTINY1过表达拟南芥的功能分析

试验结果（图7）显示，与CK相比，WL处理的野生型和VvTINY1过表达拟南芥均表现出叶片黄化和边缘卷曲等水涝伤害症状，且症状随着渍水时间的延长逐渐加重，VvTINY1过表达株系表型与WT拟南芥无明显差异；在WL条件下，VvTINY1-OE1和VvTINY1-OE2株系的抽薹和开花时间均明显早于野生型。

2.4.1 生理生化响应分析

对供试拟南芥ADH活性及过氧化氢和MDA含量进行测定，结果显示，CK条件下，VvTINY1-OE1、VvTINY1-OE2与WT拟南芥中ADH活性差异不显著。WL处理下，WT拟南芥的ADH活性显著升高，约为7.1 nmol/（min·g），为CK条件下WT拟南芥的3倍以上，差异显著（P<0.05），而VvTINY1-OE1和VvTINY1-OE2株系的ADH活性分别为2.68和2.02 nmol/（min·g），均显著低于WL处理下的WT（P<0.05）（图8-A），表明VvTINY1过表达可显著抑制WL诱导的拟南芥ADH活性的升高。WL处理下WT拟南芥的H₂O₂含量剧烈升高，达到约3.2 μmol/g，而VvTINY1-OE1和VvTINY1-OE2株系分别约为0.83和0.90 μmol/g，均显著低于WT（P<0.05）（图8-B），这说明VvTINY1过表达抑制了WL诱导的拟南芥H₂O₂含量的升高。WL处理下不同株系拟南芥MDA含量均显著升高，其中WT拟南芥约为28 nmol/g，而VvTINY1-OE1和VvTINY1-OE2株系分别为22和18 nmol/g，显著低于WT（P<0.05）（图8-C），表明VvTINY1过表达可显著抑制WL诱导的拟南芥MDA含量升高。

2.4.2 低氧胁迫响应相关基因的表达变化

CK处理下，WT、VvTINY1-OE1和VvTINY1-OE2拟南芥株系中AtADH基因表达量均较低；WL处理下，VvTINY1-OE1株系中AtADH基因表达量显著升高，达到32.03，显著高于WT和VvTINY1-OE2株系（P<0.05）（图9-A）。CK处理下，AtPDC基因在WT和VvTINY1-OE2株系中的表达量显著高于VvTINY1-OE1株系；WL处理下，VvTINY1-OE1株系中AtPDC表达量升高至1.73，显著高于WT和VvTINY1-OE2株系（P<0.05）（图9-B）。AtHB1基因的表达结果（图9-C）表明，CK处理下3个株系中AtHB1表达量均较低；WL处理下，各株系中AtHB1表达量均有所升高，其中以VvTINY1-OE1株系升高幅度最大，表达量达到13.62，显著高于 WT和VvTINY1-OE2株系（P<0.05）。AtHB2基因的表达模式（图9-D）与AtHB1不同，CK处理下其在VvTINY1-OE2株系中的表达量最高，达到278.50，显著高于其余2个株系（P<0.05）；WL处理下，其在WT和VvTINY1-OE1株系中表达量升高，而在VvTINY1-OE2株系表达量显著降低（P<0.05）。AtPCO1和AtPCO2基因的变化趋势基本一致，二者在CK处理下的3个株系中表达量均较低；WL处理下，VvTINY1-OE1株系中AtPCO1和AtPCO2表达量分别升高至46.63和74.24，均显著高于WT和VvTINY1-OE2株系（P<0.05）（图9-E、F）。

3 讨 论

本研究以赤霞珠葡萄为材料，克隆获得了DREB类A4亚家族转录因子VvTINY1，并通过生物信息学方法系统解析其结构特征与进化关系。结果表明，VvTINY1蛋白含有典型的 AP2/ERF结构域，该区域高度保守，与木槿和陆地棉等物种的同源蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位试验结果显示，VvTINY1定位于细胞核内，符合其作为转录因子的功能特性，与AP2/ERF家族成员普遍核内定位的规律一致^［12］。表达模式分析表明，VvTINY1在葡萄的根和茎中表达水平显著高于其他组织。根系作为水分与养分吸收的关键器官，亦是水涝胁迫的首要受害器官。已有研究表明，多种与抗涝相关的AP2/ERF类转录因子在根系中呈现诱导表达，例如柑橘根中有多个AP2/ERF家族基因在水涝胁迫下表达量显著上调^［19］。

为进一步验证VvTINY1的功能，本试验构建了VvTINY1过表达拟南芥材料，并在水涝胁迫下对其表型与生理响应进行分析。结果表明，过表达VvTINY1基因的拟南芥在水涝胁迫下表现出典型的水涝症状（如叶片变黄、边缘卷曲），其抽薹和开花时间相比野生型提前。Voesenek等^［20］及Tamang等^［21］的研究表明，植物在水涝胁迫下通常会采取逃逸或静止策略来应对缺氧环境，其中逃逸策略是植物通过促进节间伸长快速突破水面，从而减轻水涝对生长的负面影响；静止策略是指植物通过抑制生长、降低代谢速率以保存能量和碳水化合物，从而在淹水条件下维持生存，待淹水解除后迅速恢复生长。已有研究表明，深水稻中的SNORKEL1/2基因可通过促进节间伸长介导洪水逃逸响应^［22］，因此推测VvTINY1基因可能与其具有相似的调控作用。此外，作为AP2/ERF类转录因子家族成员的TINY1在响应乙烯、赤霉素等植物激素通路中发挥着重要的调节作用，直接影响植物的生长发育^［23］。因此，VvTINY1基因的过表达可能通过调节生长激素信号通路而促进节间伸长，从而实现植物在水涝条件下的逃逸策略，提升其适应性和生存能力。菊花CmTINY2可通过调节气孔导度和能量代谢提高其耐涝性^［24］；玉米中的ZmEREB46^［25］和猕猴桃中的AvERF73^［26］也表现出正向调控水涝耐受的作用。这些研究表明，AP2/ERF转录因子在不同植物中均发挥着对抗水涝胁迫的作用。

VvTINY1过表达株系在渍水处理后ADH活性显著低于野生型，表明过表达拟南芥对无氧发酵代谢的依赖程度降低。ADH与PDC是植物在缺氧条件下启动发酵代谢的核心酶，其表达受ERF-Ⅶ类转录因子（如RAP2.12）调控^［27］。虽然发酵可在一定程度上维持ATP供应，但其持续进行可能导致胞内酸化等不利影响。因此，VvTINY1可能通过增强氧气利用或稳定线粒体呼吸，减少对发酵代谢的依赖，进而提升能量利用效率与细胞稳态。

水涝胁迫还常常伴随ROS的过量积累，引发氧化损伤。本研究中，VvTINY1过表达株系中H₂O₂和MDA含量显著下降，尤其是VvTINY1 OE2表现更好，这与李格格^［28］ 报道的ERF72可调控淹水胁迫下的抗氧化酶活性、缓解ROS伤害的研究结果一致。类似机制也见于猕猴桃AvERF75，其可通过与AvLOB41互作提高机体的抗氧化能力^［29］。另外，RT-qPCR检测结果表明，VvTINY1过表达后可上调多种低氧响应相关基因的表达，VvTINY1-OE1在渍水条件下显著上调了AtADH和AtPDC的表达，说明其有助于加强乙醇发酵通路，维持低氧环境下的能量供应，这与Mustroph等^［30］关于低氧代谢关键酶的研究结果一致。同时，AtHB1的表达也在VvTINY1-OE1中显著提高，表明VvTINY1可能通过调控ERFⅦ类转录因子参与低氧信号通路，增强植株的胁迫响应能力^［31］。更重要的是，VvTINY1-OE1中AtPCO1和AtPCO2的表达水平显著升高，提示VvTINY1还可能通过调控氧感受系统中的PCO类基因的表达来协调低氧感知与应答^［32］。综上，VvTINY1的过表达通过多层次调控低氧代谢、信号转导及氧感知相关基因的表达，显著增强了拟南芥对渍水胁迫的适应能力，为进一步解析DREB类A4亚家族转录因子在植物逆境响应中的功能提供了新的线索与理论支持。

4 结 论

本研究揭示了葡萄AP2/ERF转录因子VvTINY1在拟南芥响应水涝胁迫中的正向调控功能。VvTINY1具有典型的AP2/ERF结构域，定位于细胞核，且在根与茎中表达量高于其他组织。功能分析表明，VvTINY1通过缓解氧化损伤、调控低氧代谢并激活包括AtADH、AtHB1及AtPCO1/2在内的低氧信号通路关键基因，系统增强拟南芥对渍水环境的适应能力。此外，过表达VvTINY1拟南芥表现出提前抽薹开花的现象，提示VvTINY1可能通过调节生长发育策略来增强拟南芥的胁迫逃避能力。综上所述，VvTINY1是葡萄响应水涝胁迫的一个关键调控因子。本研究结果为深入解析葡萄抗涝分子机制提供了新的试验依据，也为利用VvTINY1基因进行葡萄抗逆遗传改良奠定了理论基础。

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基金资助

国家自然科学基金地区科学基金项目(32160688)

国家自然科学基金青年科学基金项目(32502649)