建兰叶色变异的蛋白质组学和转录组学分析

Integrated proteomic and transcriptomic analysis of leaf color variation in Cymbidium ensifolium

摘要

目的 分析建兰叶色变异的分子机制，为建兰叶艺分子育种奠定理论基础。 方法 以建兰品种‘小桃红’叶片边缘的绿色部分及其叶色突变体‘JQ’叶片边缘的白色部分为材料，进行光合色素含量测定、叶绿体超微结构观察、蛋白质组学和转录组学比较分析。 结果 ①‘JQ’的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量及叶绿素a/b均显著低于‘小桃红’。②‘JQ’的叶肉细胞叶绿体很少或没有，叶绿体膨胀，内部结构几乎消失，含有许多无序的单类囊体，并含有大量嗜锇颗粒。③共获得1 962个差异表达基因（DEGs），其中717个上调，1 245个下调；共鉴定出895种差异蛋白（DAPs），其中523种低丰度，372种高丰度。④ KEGG途径富集分析鉴定出的DEGs和DAPs主要与光合作用-天线蛋白和光合作用有关；通过比较‘小桃红’和‘JQ’数据，筛选出参与光合作用-天线蛋白和光合作用过程的8个DEGs/DAPs。 结论 光合作用和光合色素中关键酶的转录改变、转录后调控和翻译变化可能在建兰叶色突变中起着至关重要的作用。

Abstract

Objective Analyze the molecular mechanism of leaf color variation in C.ensifolium，to establish a theoretical foundation for molecular breeding of its leaf variegation. Method In this study，the green leaf margins of C.ensifolium ‘Xiaotaohong’ and the white leaf margins of its mutant ‘JQ’ were used as materials，and photosynthetic pigment content measurement，chloroplast ultrastructure observation，as well as comparative proteomic and transcriptomic analyses were conducted. Result ①The contents of chlorophyll a，chlorophyll b，and carotenoids，as well as the chlorophyll a/b ratio in ‘JQ’ were significantly lower than those in ‘Xiaotaohong’.② The mesophyll cells of ‘JQ’ contained few or no chloroplasts.The few existing chloroplasts were swollen，with nearly vanished internal structures，numerous unstacked single thylakoids，and abundant osmiophilic granules.③A total of 1 962 differentially expressed genes （DEGs） were detected，including 717 upregulated and 1 245 downregulated.In addition，895 differentially abundant proteins （DAPs） were identified，comprising 523 in low abundance and 372 in high abundance.④ The enrichment analysis of the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway revealed that the identified DEGs and DAPs were mainly related to photosynthesis antennas and photosynthesis.A comparative analysis between ‘Xiaotaohong’and ‘JQ’ identified eight DEGs/DAPs involved in photosynthesis antennas and photosynthesis. Conclusion Transcriptional alterations，post-transcriptional regulation，and translational changes of key enzymes involved in photosynthesis and photosynthetic pigment metabolism may play crucial roles in leaf color muttion of C.ensifolium.

Graphical abstract

关键词

建兰 / 叶色变异 / 分子机制 / 转录组 / 蛋白质组

Key words

Cymbidium ensifolium / leaf color variation / molecular mechanism / transcriptome / proteome

叶色突变在园艺植物中具有重要的经济意义，嵌合突变和白化突变是最常见的两种突变。光合作用色素含量的变化^［1］、叶绿体发育异常^［2］、光合效率降低^［3］和核转运失活^［4］等都可能导致褪绿突变体。

在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，叶绿体末端氧化酶IM的缺乏，导致光合色素含量降低，以及类胡萝卜素合成受阻^［5-8］。此外，FtsH基因参与光保护和类囊体发育，该基因的突变可导致叶色斑驳，同时增加光抑制的敏感性^［8-9］。在菠萝（Ananas comosus var.Bracteatus）中，低丰度的光合作用天线蛋白是造成白色嵌合体的主要原因^［10］。红掌（Anthurium andraeanum Lind.）和小麦（Triticum aestivum L.）的叶绿素缺陷突变体研究表明，叶绿体发育相关基因的表达受到抑制，从而造成叶色突变^［11-12］。这些研究为探索叶色突变的机制提供了基础。

建兰（Cymbidium ensifolium）为兰科兰属植物^［13］，是中国著名的兰花，因存在叶艺嵌合体而使其观赏价值越来越受到人们的关注^［14］。尽管组培快繁可以快速获得大量植株，但由于嵌合体在组培快繁中易发生性状分离，故建兰只能通过分株方法进行繁育^［15］。因此，研究建兰叶片的嵌合特性机制对于提高嵌合性状的稳定性具有重要意义。目前，叶色变异的机制还不十分清楚，叶色突变体已成为研究叶绿素生物合成、叶绿体发育和光合作用相关突变机制的理想材料^［16-17］。

近年来，转录组测序（RNA-seq）和蛋白质组学分析已成为研究复杂生物代谢的有力工具^［18-20］，并已对很多植物叶色变异机制的研究做出了重大贡献，如小麦^{［11，21］}、紫薇（Lagerstroemia indica）^［22-23］、茶叶（Camellia sinensis L.）^［12］和油菜（Brassica campestris）^［24］等。因此，RNA-seq和蛋白质组学可以为解析建兰叶色突变提供新的见解。本研究以建兰品种‘小桃红’及其叶片边缘变白的叶色突变体‘JQ’为材料，通过建兰嵌合叶的转录组学和蛋白质组学数据，对差异表达基因/差异表达蛋白（DEGs/DAPs）进行功能分析，以期更好地了解建兰叶色突变的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材　料

参试材料为3年生的建兰品种‘小桃红’及其叶片边缘变白的叶色突变体‘JQ’，每个品种20株，两者的叶片形态和叶色见图1。参试材料种植在福建省农业科学院的温室大棚中，2022年采集3年生‘JQ’叶片边缘的白色部分和‘小桃红’叶片边缘的绿色部分，采后立即在液氮中冷冻，并保存在-80 ℃冰箱中，用于叶绿素和类胡萝卜素含量测定以及蛋白质组、转录组测序和定量分析。每个材料3个重复。

1.2 叶绿体超微结构观察

在叶片主叶脉两侧用刀片切取大小为4 mm×2 mm的组织块，浸入体积分数2.5%戊二醛溶液中，在4 ℃初固定24 h以上，然后采用质量浓度0.01 g/mL的锇酸溶液增加固定，用浓度0.1 mol/L的磷酸缓冲液反复洗涤多次。固定后的样品用梯度乙醇丙醇脱水（丙酮洗涤脱水），最后包埋在Spur环氧树脂中。在超微切片机上切取超薄切片，用质量浓度0.025 g/mL乙酸铀酰染色，随后用柠檬酸染色后固定到铜网上，最后用透射电子显微镜以80 kV的加速电压观察、拍照。

1.3 叶绿素和类胡萝卜素提取及含量测定

叶片样品用液氮研磨，与提取物（V（丙酮）∶V（乙醇）∶V（水）=4.5∶4.5∶1）混合，然后将样品浸泡24 h以提取叶绿素和类胡萝卜素。测定提取液在645，663和470 nm波长下吸光度A₆₄₅，A₆₆₃和A₄₇₀，依公式（1）、（2）、（3）分别计算提取液中叶绿素a、叶绿素b及总类胡萝卜素质量浓度C_a（mg/L）、C _b（mg/L）及C_C （mg/L），再依据公式（4）计算样品中各色素含量（mg/g）。

C_a=12.21A₆₆₃-2.81A₆₄₅；（1）

C _b=20.13A₆₄₅-5.03A₆₆₃；（2）

C_C =4.37A₄₇₀+2.11A₆₆₃-9.10A₆₄₅；（3）

样品色素含量=色素质量浓度（mg/L）×提取液总体积（L）/样品质量（mg）。（4）

1.4 RNA‐seq、转录本装配及功能注释

采用通用RNA提取试剂盒（百泰克，中国北京）分别提取‘小桃红’和突变体‘JQ’叶片的总RNA。应用the Agilent 2100 Bioanalyzer系统评估RNA完整性。委托百迈客生物技术公司（中国北京）应用 Illumina HiSeq™ 4000进行文库构建和转录组测序（NCBI SRA登录号PRJNA790719）。

原始读数（raw reads）最初通过Illumina测序产生。通过删除低质量序列（reads），获得过滤后高质量序列（reads）。将高质量序列（reads）扩展到具有重叠区域的较长重叠群（contigs）中，然后进一步组装成转录本（transcripts），最后聚集成单基因（unigenes）。基于序列相似性，将所有组装的单基因与公共数据库进行比较（E-value cut-off at 10^-5）。装配及功能注释参照Ye等^［25］的方法。

1.5 蛋白提取与蛋白胰酶酶解

样品蛋白提取和蛋白胰酶酶解参照Chen等^［26］的方法。蛋白提取时，样品先用质量浓度0.1 g/mL TCA/丙酮洗涤4次，再进行SDS-酚抽提取。蛋白胰酶酶解时，酶与蛋白的质量比为1∶50，酶解过夜。

1.6 液相色谱-质谱联用分析

肽段用液相色谱流动相A相溶解后，使用NanoElute超高效液相系统进行分离。流动相A为含质量浓度0.001 g/mL甲酸和0.02 g/mL乙腈的水溶液；流动相B为含质量浓度0.001 g/mL甲酸和1 g/mL乙腈溶液。液相梯度设置：0~70 min，6%~24%B；70~84 min，24%~35%B；84~87 min，35%~80% B；87~90 min，80% B，流速维持在450 nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入到Capillary离子源中进行电离，再进timsTOF Pro质谱进行分析。离子源电压设置为1.75 kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的TOF进行检测和分析。二级质谱扫描范围（m/z）设置为100~1 700。数据采集模式使用平行累积串行碎裂（PASEF）模式。一张一级质谱采集后，进行10次PASEF模式采集母离子电荷数在0~5的二级谱图，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30 s，避免母离子的重复扫描。

用Bowtie 2将修剪后的序列（reads）与组装的转录组进行比较^［27］，用RSEM（RNA-seq by expectation maximization） 评估表达水平^［28］。应用FPKM （fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）计算单基因（unigenes）的表达丰度^［29］。用DESeq分析不同文库中的差异表达基因（DEGs）^［30］，将P<0.01和log₂（FC（fold change））>2作为筛选DEGs的阈值。

使用Trinity软件构建蛋白文库^［31］。将所有预测的基因序列翻译成蛋白序列，用CDHIT进行聚类^［32］，并通过BLASTP进行Nr、GO、KEGG、COG、InterPro和STRING注释。二级质谱数据使用maxquant进行鉴定^［33］。酶消化模式设置为Trypsin/P。缺失位数设置为2，肽的最小长度设置为7个氨基酸残基。肽修饰的最大数目设置为5。第一次搜索和主搜索的初级母离子的质量误差容限均设置为2×10^-5，次级片段离子的质量错误容限设置为2×10^-5。半胱氨酸烷基化氨基甲基（c）设置为固定修饰，可变修饰为蛋氨酸氧化和蛋白质N端乙酰化。差异蛋白（DAPs）鉴定的错误发现率（false discovery rate，FDR）设置为1%。对于蛋白质定量分析，折叠变化阈值（fold change threshold）（|log₂FC|>1.5）用于筛选高低丰度蛋白，以P<0.05确认统计学显著性。

1.7 RT-qPCR分析

应用荧光染料SYBR Green（TaKaRa，中国）在ABI 7500实时PCR系统上进行RT-qPCR。采用PrimerPremier 5.0设计用于RT-qPCR的引物（表1），Actin为内参基因。PCR条件如下：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，40个循环；然后90 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。使用2^-ΔΔCt 法计算相对表达水平^［34］。

2 结果与分析

2.1 ‘小桃红’及其叶色突变体‘JQ’叶片边缘叶绿体超微结构比较

‘小桃红’及其叶色突变体‘JQ’的叶绿体超微结构分析发现，‘小桃红’叶绿体表现出典型的正常结构，具有高度有序的内膜系统，排列有序的类囊体基层（图2-A~C）；在突变体‘JQ’中，叶肉细胞含有很少或无叶绿体，叶绿体异常膨胀，膨胀叶绿体的内部结构几乎消失，含有许多无序的单类囊体，并含有大量嗜锇颗粒（图2-D~F）。观测结果证实，建兰叶色突变体‘JQ’的叶绿体发育受到明显损害。

2.2 ‘小桃红’及其突变体‘JQ’叶片边缘叶绿素和类胡萝卜素含量比较

图3显示，突变体‘JQ’叶片边缘白色部分各种色素含量及叶绿素a/b值均显著低于‘小桃红’叶片边缘的绿色部分，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别仅占‘小桃红’叶片的1.41%，14.94%和5.0%；‘JQ’中几乎未检测到叶绿素a和类胡萝卜素，其含量分别仅为0.027和0.027 mg/g。

2.3 ‘小桃红’及其叶色突变体‘JQ’转录组数据分析

为了筛选DEGs，应用‘小桃红’和突变体‘JQ’构建了两个文库（表2）。通过组装，获得了88 677个单基因，平均长度为731 bp，其中有17 415个（19.6%）单基因长度超过1 000 bp。试验共获得1 962个DEGs，其中717个上调，1 245个下调。

在88 677个单基因中，26 832个被注释，约占所有单基因的30.3%。为进一步研究DEGs的功能，通过KEGG分析确定其富集途径，其中上调和下调的前20个富集途径见图4。

图4显示，与‘小桃红’相比，突变体‘JQ’中的脂肪酸延长、植物激素信号转导和光合作用-天线蛋白是显著富集的途径。

2.4 ‘小桃红’及其叶色突变体‘JQ’蛋白质组数据分析

由于RNA表达水平不能准确预测蛋白丰度，因此本研究应用无标记蛋白质组进行‘小桃红’与‘JQ’间的蛋白质组分析。结果显示，两类材料总共获得34 464个肽段、33 491个特异性肽段和4 823个被鉴定蛋白。与‘小桃红’相比，‘JQ’中有895种蛋白表现出不同的丰度，其中包括523种低丰度蛋白和372种高丰度蛋白（图5）。

为了阐明与叶色突变性状有关的代谢途径，通过KEGG数据库分析所有DAPs，得到15条主要途径。与‘小桃红’相比，突变体‘JQ’的低丰度蛋白主要参与光合作用-天线蛋白、光合作用和脂肪酸延长（图6）。

对‘JQ’与‘小桃红’中具有差异丰度的蛋白根据其亚细胞位置进行分类，共有6种亚细胞成分，主要包括叶绿体（44.3%）和细胞质（25.4%）等（图7）。

2.5 ‘小桃红’及其叶色突变体‘JQ’转录组和蛋白质组的联合分析

为了探索建兰绿色/白色嵌合叶代谢途径的变化，并筛选与叶色突变相关的关键基因，对转录组和蛋白质组进行了联合分析。在‘小桃红’和‘JQ’中筛选到与DAPs表达趋势一致的DEGs 112个，表达趋势相反的DEG s 16个（图5）。

对DEGs和DAPs进行KEGG富集联合分析，DEGs/DAPs在12个KEGG途径中显著富集，包括光合作用-天线蛋白、光合作用和脂肪酸延长等途径。其中，从‘小桃红’和‘JQ’中分别鉴定到8个光捕获叶绿素蛋白复合体（LHC）基因和8个光捕获叶绿素蛋白复合体（LHC）蛋白，这些蛋白均与光合作用-天线蛋白有关。其中，5个DEGs和DAPs（Lhca1（c52905.graph_c0）、Lhca2（c48001.graph_ c0）、Lhcb1-1（c53366.gra-ph_c0）、Lhcb2（c54023.graph_c0）和Lhcb3（c53408.graph_c0））具有相同的表达趋势，并在‘JQ’中显著下调（表3）。同时，从‘小桃红’和‘JQ’中分别筛选出8个与光合作用有关的基因和18个与光合作用有关的蛋白，其中3个DEGs和DAPs（PsbO（c55368.graph_c0）、PSB（c58650.graph-c0）和PsbA（c66675.graph.c0））的表达具有相同变化趋势，并在‘JQ’中表现出较低的表达水平和丰度（表3）。这表明‘JQ’和‘小桃红’在调节光合作用-天线蛋白和光合作用方面的模式略有不同。与光合作用-天线蛋白和光合作用相关基因的低表达可能影响‘JQ’叶绿体中光能的捕获和传输。

此外，对参与类胡萝卜素生物合成的DEGs的研究表明，类胡萝卜素裂解双加氧酶基因（carotenoid cleavage dioxygenase，CCD，c57341.graph_c0）在‘JQ’中显著上调。高CCD表达可增强下游代谢流并促进类胡萝卜素途径中相关色素的分解。

2.6 RT-qPCR验证

为了验证转录组和蛋白质组分析结果，对几个关键基因进行了RT-qPCR。结果（图8）显示，Lhca2、Lhca1、Lhcb1-1、Lhcb3、Lhcb2、PsbO、PsbS和PsbA等8个基因的RT-qPCR表达趋势与转录组和蛋白质组表达趋势相似；在转录组和蛋白质组中表达趋势不同的9个基因中，有6个基因（Lhcb4、Lhcb5、Lhcb1-2、Lhca3、PsaD、F-type ATP ase b）的RT-qPCR表达趋势与蛋白质组表达趋势相似，有3个基因（Lhca4、Lhcb6、CCD）的RT-qPCR表达趋势与转录组相同。

3 讨论

植物叶色变化与其叶绿体发育有关。叶绿体作为一种动态的超敏细胞器，其发育不仅受遗传因素的控制，还受环境条件的影响。一些代谢过程，如光合作用、叶绿素生物合成、类胡萝卜素和类黄酮代谢，均与叶绿体发育有关^{［10， 35］}。本研究对建兰品种‘小桃红’叶片边缘绿色部分及其突变体‘JQ’叶片边缘白色部分进行转录组学、蛋白质组学分析，以及转录组和蛋白质组联合分析，结果发现一些参与光合作用-天线蛋白和光合作用的基因具有相同的表达趋势，这可能是建兰绿色/白色嵌合叶片白化的主要原因。

叶绿素和类胡萝卜素是叶片组织中主要的光合色素。已有研究证明，叶片白化通常伴随着叶绿素和类胡萝卜素含量降低，以及叶绿素a/b值的变化^［3，36］。本研究中，与‘小桃红’相比，‘JQ’叶片边缘的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均较低。叶绿素被认为是稳定LHC蛋白的基础^［37］，LHC是光合系统Ⅱ（PSⅡ）组装不可或缺的组分，低水平的LHC蛋白会导致叶绿体发育异常^［38］。拟南芥中Lhcb1和Lhcb2蛋白的缺失导致叶绿素含量降低^［39］。茶叶中，LHC基因的下调可能导致叶绿体发育异常和叶绿素含量降低^［40］。本研究通过转录组学和蛋白质组学分析，筛选出‘JQ’中与光合作用-天线蛋白相关的5个DEGs和DAPs（Lhca2、Lhca1、Lhcb1-1、Lhcb3和Lhcb2）。结果表明，这些光合作用-天线蛋白在‘JQ’白绿色（pale-green）叶片表型的形成中起着重要作用。本研究中，被抑制的Lhca和Lhcb可能是由于‘JQ’中叶绿体发育不足造成的。

CCD基因是类胡萝卜素途径中的关键基因，CCD可以催化类胡萝卜素底物的氧化裂解^［41］。在杜鹃花花瓣中，黄色表型的缺失是由CCD切割类胡萝卜素引起的^［42］。在水稻中，过表达拟南芥AtCCD4基因能显著降低β-胡萝卜素和叶黄素含量，降幅分别达到74%和72%，而β-紫罗兰酮含量增加了1倍^［43］。本研究中，CCD基因在‘JQ’中的高水平表达，可能是类胡萝卜素含量降低的主要原因。

4 结论

建兰品种‘小桃红’叶色突变体‘JQ’叶片边缘白色部分的光合色素叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量以及叶绿素a/b均显著低于‘小桃红’叶片边缘绿色部分。在‘JQ’和‘小桃红’中共筛选出1 963个差异表达基因（DEGs）和895个差异丰度蛋白（DAPs）。基因组和蛋白质组学联合分析显示，在‘JQ’中筛选出5个参与光合作用-天线蛋白和光合作用并具有相同表达趋势的DEGs和DAPs，表明‘JQ’和‘小桃红’两个品种在调节光合作用-天线蛋白和光合作用方面有所不同。本研究结果为进一步探索建兰叶色变异的分子机制奠定了基础。

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基金资助

福建省农业科学院优秀科技创新人才专项(YCZX202502)

福建省科技特派团服务重点产业链项目(2024N0067)

国家重点研发计划项目(2023YFD1600504)

福建省人民政府与中国农业科学院高质量发展超越“5511”协同创新工程项目(XTCXGC2021003)