四季秋海棠U6启动子的克隆及活性分析

Cloning and activity analysis of U6 promoter in Begonia semperflorens

摘要

目的 筛选四季秋海棠（Begonia semperflorens）中具有高效转录活性的U6启动子，为建立四季秋海棠CRISPR/Cas9基因编辑体系、开展基因功能研究与分子育种奠定基础。 方法 利用拟南芥AtU6 snRNA序列在四季秋海棠基因组中进行比对，筛选同源性较高的BsU6 snRNA，选择E<3.12e^-40的U6 snRNA，分别取其5′端27 bp以及上游1 500 bp序列作为候选四季秋海棠U6启动子序列。对候选四季秋海棠U6启动子进行PCR克隆并与pGreenⅡ 0800-LUC载体连接，构建BsU6启动子驱动荧光素酶基因的融合表达载体，瞬时转化本氏烟草叶片，通过分析生物化学发光信号，比较各个启动子的转录活性。选择转录活性较高的BsU6启动子，对其进行5′端截短，构建表达载体，瞬时转化本氏烟草叶片，验证截短启动子的转录活性。 结果 共筛选到7个BsU6启动子，选择E<3.12e^-40的6条进行克隆，这6个BsU6启动子均有保守核心顺式作用元件USE和TATA盒（TATA box），且均具有转录活性，其中BsU6-3启动子驱动LUC表达的荧光信号最为强烈；对BsU6-3的5′端进行截短后（长度分别为1 057，952，620，434，187 bp），长度为434 bp的BsU6-3-4P启动子活性最强。 结论 从四季秋海棠中克隆出6条U6启动子，并筛选出转录活性最高U6启动子为BsU6-3-4P。

Abstract

Objective The study aims to screen the U6 promoter with high transcriptional activity in Begonia semperflorens throughout the four seasons，laying a foundation for establishing the CRISPR/Cas9 gene editing system in B.semperflorens，and conducting gene function research and molecular breeding. Method The AtU6 snRNA sequence of Arabidopsis thaliana was used to conduct homology comparison in the genome of B. semperflorens，and the U6 snRNA with high homology was screened.The BsU6 snRNA with E<3.12e^-40 was selected，and the 27 bp at the 5′ end and 1 500 bp upstream were taken as the candidate U6 promoter sequences of B.semperflorens.These candidate U6 promoter sequences were PCR cloned and ligated to the pGreenⅡ 0800-LUC vector to construct the fusion expression vector driven by the BsU6 promoter and the luciferase gene.The vector was transiently transformed into Nicotiana benthamiana leaves，and the transcriptional activity of each promoter was compared by analyzing the biochemical luminescence signal.The BsU6 promoter with higher transcriptional activity was selected and truncated at the 5′ end.The transcriptional activity of the truncated promoter was verified by transient transformation into Nicotiana benthamiana leaves again. Result A total of 7 BsU6 promoters were screened，and 6 of them with E<3.12e^-40 were selected for cloning.All of these 6 BsU6 promoters have the conserved core cis-acting elements USE and TATA box，and all have transcriptional acti-vity. Among them， the BsU6-3 promoter drives the LUC expression with the strongest fluorescence signal. After truncating the 5′ end of BsU6-3 （with lengths of 1 057，952，620，434，and 187 bp respectively），the BsU6-3-4P promoter with a length of 434 bp has the strongest activity. Conclusion Six U6 promoters were cloned from the B.semperflorens ‘Super Olympic’，and the BsU6-3-4P promoters with higher transcriptional activity were selected.

Graphical abstract

关键词

四季秋海棠 / U6启动子 / 瞬时转化 / 报告基因

Key words

Begonia semperflorens / U6 promotor / transient transfection / reporter gene

CRISPR/Cas9 系统作为新一代基因编辑工具，具有高效、精准、操作简便等优势，在植物基因功能研究与分子育种中展现出广阔的应用前景^［1］。该系统经过改良后，由Cas9核酸酶和单链向导RNA（single guide RNA，sgRNA）构成，其中sgRNA负责识别靶标序列，其表达水平直接影响编辑效率^［2］。sgRNA通常由RNA聚合酶Ⅲ型启动子驱动转录，其中U6启动子因转录起始位点明确（通常为“G”碱基）、转录活性高、在双子叶植物中能高效驱动sgRNA转录，被广泛应用于CRISPR/Cas9系统中^［3］。因此，筛选转录活性高的启动子以驱动sgRNA的转录对CRISPR/Cas9基因编辑体系功能的发挥有至关重要的意义。

研究表明，U6启动子通常具有物种特异性^［4-6］。使用受体植物自身或近缘物种的内源U6启动子，往往能够显著提高sgRNA的转录效率，从而提升基因编辑的成功率^［7］。U6 snRNA是一种小非编码RNA，其序列在不同物种中非常保守^［8］，由RNA聚合酶Ⅲ转录，并在细胞核内参与pre-mRNA的剪接成熟^［9-11］。驱动U6 snRNA转录的U6启动子常作为CRISPR/Cas9基因编辑载体中驱动sgRNA转录的重要元件。具有转录活性的U6启动子需要具备2个保守元件：上游60 bp处的USE和上游30 bp处的TATA盒（TATA box）^［8］。有研究表明，携带27 bp U6 snRNA的U6启动子转录活性较高^［12-13］。目前，已有多个物种的U6启动子被用于建立CRISPR/Cas9体系。在大豆中，使用GmU6和AtU6构建的CRISPR/Cas9载体可成功敲除Glyma06g14180、Glyma08g02290和Glyma12g37050基因，并且由内源启动子GmU6驱动的载体编辑效率比AtU6高2~4倍^［14］；在茄子中，基于SmU6-1P和SmU6-7P的T₀代植株突变率分别为27%和21%，而基于AtU6-P的T₀代植株并未检测到突变植株^［4］；在棉花中，内源性GhU6启动子显著提高了sgRNA的表达水平，使CRISPR/Cas9介导的突变效率比拟南芥AtU6-29启动子提高了4~6倍^［15］；在葡萄中，使用VvU6启动子取代AtU6可提升sgRNA的表达，显著提高葡萄基因组的编辑效率^［16］。筛选并获得高效转录的内源U6启动子，对优化植物CRISPR/Cas9编辑体系至关重要。

四季秋海棠（Begonia semperflorens）是秋海棠科秋海棠属的观赏花卉。李逸菲等^［17］已成功建立了四季秋海棠稳定遗传转化体系，为其基因编辑奠定了基础。虽然U6启动子已应用于多种植物，但关于四季秋海棠U6启动子（BsU6）的筛选尚未见报道。为此，本研究从四季秋海棠基因组中克隆BsU6启动子，构建BsU6驱动LUC报告基因的融合表达载体并在烟草叶片中进行瞬时表达分析，系统评估其转录活性，以筛选出高活性的四季秋海棠U6启动子，旨在为后续建立高效CRISPR/Cas9基因编辑体系开展四季秋海棠基因功能研究与分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材　料

四季秋海棠品种‘超级奥林匹克’和本氏烟草，种植于河南农业大学风景园林学院试验植物材料培养室。本氏烟草种子播种于湿润的蛭石中，覆膜保湿，置于光照环境中发芽，待幼苗长至2片叶时移入土中（蛭石和营养土体积比为3∶1），在温度23 ℃、光照强度230 μmol/（m²·s）、湿度60%、光周期14 h光照/10 h黑暗的条件下培养4~6周，选取生长良好的叶片用于试验。pGreenⅡ0800-LUC质粒，由河南农业大学风景园林学院实验室保存。

DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101 （pSoup）感受态细胞，均购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司；基因组DNA提取试剂盒、5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit、DNA聚合酶2×Phanta Flash Master Mix （Dye Plus）和同源重组酶Clon Express Ultra One Step Cloning Kit，购于南京诺唯赞生物技术有限公司；D-荧光素钾盐，购于笛医生物；启动子测序及引物合成由河南有康基因生物科技有限公司完成。

1.2 BsU6启动子序列分析

本研究使用的四季秋海棠基因组数据由本课题组委托基因公司组装获得，暂未公开。将拟南芥的AtU6-1 snRNA序列（GTCCCTTCGGGGA-CATCCGATAAAATTGGAACGATACAGAG-AAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGAT-

GACACGCATAAATCGAGAAATGGTCCAA-ATTTT）在四季秋海棠基因组中用TBtools软件进行Blast比对分析，共检索到7条BsU6 snRNA，选择E<3.12e^-40的6条，分别取其5′端27 bp U6 snRNA以及上游1 500 bp序列作为四季秋海棠候选U6启动子序列，分别命名为BsU6-1、BsU6-2、BsU6-3、BsU6-4、BsU6-5、BsU6-6。运用软件DNAMAN （V9.0）对AtU6-1及6条BsU6启动子序列进行比对，并分析影响U6启动子转录活性的2个必要元件TATA盒和USE，并分析2个元件之间的距离。

1.3 BsU6启动子克隆

试验所用引物序列见表1。

取生长良好的四季秋海棠‘超级奥林匹克’叶片，采用植物基因组提取试剂盒提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，利用高保真DNA聚合酶，按照说明书所提供的体系及程序扩增BsU6-1~BsU6-6启动子片段。将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带正确后，使用胶回收试剂盒纯化目的片段。将目的片段与5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit中的5×TA/Blunt-Zero Cloning Mix克隆酶连接，构建克隆载体，并转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定并送生工生物科技有限公司测序，将测序正确的克隆载体命名为T-BsU6-1、T-BsU6-2、T-BsU6-3、T-BsU6-4、T-BsU6-5和T-BsU6-6。

1.4 BsU6：：LUC融合表达载体构建

以1.3节得到的克隆载体T-BsU6-1~T-BsU6-6为模板，PCR扩增带pGreenⅡ 0800-LUC载体同源臂的BsU6-1a~BsU6-6a目的片段，试验所用引物序列见表1。用BamH Ⅰ限制性内切酶对pGreenⅡ 0800-LUC质粒进行单酶切，得到线性化载体。将带有pGreenⅡ 0800-LUC载体同源臂的BsU6-1a~BsU6-6a片段和线性化载体经1%的琼脂糖凝胶电泳检测正确后，切胶回收，并将二者用同源重组酶连接，构建BsU6启动子驱动荧光素酶基因的融合表达载体BsU6-1a：：LUC~BsU6-6a：：LUC。将上述融合表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌送生工生物科技有限公司测序，对测序正确的单克隆菌进行扩繁并提取质粒。不同BsU6启动子驱动荧光素酶基因BsU6：：LUC融合表达载体的结构如图1所示。

1.5 BsU6启动子转录活性检测

将测序鉴定正确的融合表达载体转化农杆菌GV3101 （pSoup）感受态细胞，于液体LB培养基中振荡培养（条件：28 ℃，220 r/min）至600 nm处吸光度（OD₆₀₀）为0.8，5 000 r/min离心10 min收集菌体，用缓冲液（10 mmol/L MgCl₂+10 mmol/L MES+200 μmol/L AS）重悬。将重悬后的菌液于28 ℃静置3 h后，瞬时转化本氏烟草叶片，避光24 h后，置于23 ℃光照培养箱进行14 h光照/10 h黑暗培养48 h。将瞬时转化72 h后的本氏烟草叶片取下，在叶片背面喷施100 mmol/L的D-荧光素钾盐，在黑暗环境中静置5~10 min后用多Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统拍摄活体荧光信号图像，根据荧光信号强弱判断不同启动子的转录活性。试验以pGreenⅡ 0800-LUC空载体作为阴性对照，设3次生物学重复。

1.6 BsU6-3-Ps启动子克隆及鉴定

有研究表明，U6启动子5′端可能存在抑制因子，导致转录活性下降^［18-23］。因此本试验利用plantCARE网站对转录活性较高的BsU6-3启动子序列进行分析，然后根据元件位置从5′端27 bp U6 snRNA之后进行5次截短，截短示意图见图2。以1.3节得到的克隆载体T-BsU6-3为模板，用引物（表1）重新克隆出5个截短启动子BsU6-3-P1、BsU6-3-P2、BsU6-3-P3、BsU6-3-P4和BsU6-3-P5。将各截短启动子用同源重组的方法分别与pGreenⅡ 0800-LUC载体连接，构建融合表达载体BsU6-3-P1：：LUC、BsU6-3-P2：：LUC、BsU6-3-P3：：LUC、BsU6-3-P4：：LUC和BsU6-3-P5：：LUC。参照1.5节的方法对BsU6-3及其5个截短的启动子进行转录活性验证。

2 结果与分析

2.1 BsU6启动子序列分析

对拟南芥和四季秋海棠的6条BsU6 snRNA及U6启动子序列进行比对，发现其在转录起始位点前26~32 bp处均存在TATA盒，在转录起始位点前54~65 bp处均存在USE元件（5′-ATCC/TCACATCG-3′）（图3）。TATA盒和USE元件与RNA聚合酶Ⅲ的识别和结合相关，表明这6个四季秋海棠U6启动子可能都具有转录活性。

2.2 BsU6克隆及克隆载体验证

从四季秋海棠‘超级奥林匹克’基因组中分别PCR扩增BsU6-1、BsU6-2、BsU6-3、BsU6-4、BsU6-5和BsU6-6，经1%凝胶电泳检测，在1 500 bp处出现明亮且单一的条带（图4），与预期结果相符。克隆载体测序验证结果显示，T-BsU6-1~T-BsU6-6序列与基因组序列比对正确，说明已成功克隆出以上6个BsU6启动子。

2.3 BsU6：：LUC融合表达载体的鉴定

对构建的BsU6-1a：：LUC~BsU6-6a：：LUC融合表达载体进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图5所示。由图5可知，6个融合表达载体均在2 000 bp处出现明显的单一条带，与预期结果相符。测序结果显示，BsU6启动子已正确插入到荧光素酶基因上游的多克隆位点。试验结果表明，BsU6启动子驱动荧光素酶基因的融合表达载体BsU6-1a：：LUC~BsU6-6a：：LUC构建成功。

2.4 BsU6启动子转录活性分析

将BsU6-1a：：LUC~BsU6-6a：：LUC载体瞬时转化本氏烟草叶片后，荧光信号检测结果显示，BsU6-3a：：LUC荧光信号最强，其次是BsU6-1a：：LUC和BsU6-5a：：LUC，BsU6-6a：：LUC荧光信号最弱（图6-A）；阴性对照具有微弱荧光（图6-B）。结果表明，BsU6-3具有较高的转录活性，因此选取BsU6-3进行后续试验。

2.5 BsU6-3-Ps启动子克隆及鉴定

截短后的启动子BsU6-3-P1、BsU6-3-P2、BsU6-3-P3、BsU6-3-P4和BsU6-3-P5长度依次为1 057，952，620，437和187 bp（图7）。对5个短截启动子和BsU6-3进行转录活性检测，结果显示，BsU6-3-P4的转录活性高于其他截短启动子，而BsU6-3-P5未显示出荧光信号（图8）。

3 讨 论

CRISPR/Cas9基因编辑技术相比转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和锌指核酸酶技术（ZFNs）具有更高效便捷、精准的优点^［24-26］，目前已经在月季^［27］、花生^［28］、马铃薯^［29］等多种植物中应用。然而，CRISPR/Cas9在实际应用中存在脱靶现象，导致基因编辑效率降低^［30］。而U6启动子作为CRISPR/Cas9系统中驱动sgRNA精确表达的核心元件，其活性直接影响基因编辑的效率，使用植物的内源U6携带27 bp U6 snRNA序列的U6启动子转录活性更高^［13］，可以进一步减少脱靶效应的产生，提高基因编辑效率。本研究克隆了6个四季秋海棠U6启动子，并对其序列和转录活性进行了分析。

3.1 U6启动子具有序列保守性

前人研究证明，在拟南芥、忍冬、西洋参、金银花、狗尾草、玉米等多个物种中，U6启动子的转录起始位点均为G碱基，且具有高度保守的核心顺式作用元件，即位于转录起始位点上游30~60 bp处的USE元件和TATA盒，二者之间的距离也较为固定^［18-22］。本试验将6条四季秋海棠U6和拟南芥U6-1启动子序列进行比对，发现每个启动子的转录起始位点均为G碱基，且均具有RNA聚合酶Ⅲ识别和结合元件USE和TATA盒，结果表明BsU6启动子符合序列保守性特征。

3.2 U6启动子转录活性具有物种特异性

尽管序列保守，不同物种U6启动子的转录活性仍然存在差异。菠萝AcU6-2P和AcU6-5P在本氏烟草中的转录活性远高于水稻OsU6启动子^［23］；在本氏烟草和月季中，野蔷薇RmU6-2启动子活性高于拟南芥AtU6-1^［5］。在苹果愈伤组织中，U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子^［6］，这可能是其转录效率受物种特异性转录因子或染色质环境的影响，导致U6启动子在亲缘关系较远的物种中转录活性存在一定差异^［8］。因此，将筛选出的BsU6-3-P4启动子直接应用于四季秋海棠自身的基因编辑体系，并在四季秋海棠稳定转化植株中验证其驱动sgRNA的效率，将是后续研究的重点。这一策略不仅能更真实地评估启动子的功能，也可为建立高效的四季秋海棠CRISPR/Cas9系统奠定基础。

3.3 同一物种的不同U6启动子活性存在差异

目前，常用于启动子活性检测的报告基因有GUS^［31］、eGFP^［32］和LUC^［33］。本试验选择LUC为报告基因，对荧光信号进行检测，结果显示所选的6条四季秋海棠U6启动子的转录活性存在差异，其中BsU6-3的转录活性较高。前人研究发现，U6启动子5'端可能存在抑制其转录活性的位点，5'端截短后的U6启动子则具有更强的转录活性。例如，在番茄^［34］上，U6启动子被截短到200 bp左右时具有较高的活性；Belhaj等^［35］将拟南芥U6启动子截短到79 bp应用于基因编辑体系。本研究进一步对BsU6-3启动子进行5'端截短，并进行转录活性比较，结果发现在本氏烟草叶片中，5'端截短后的BsU6-3-P4四季秋海棠U6启动子的转录活性最高。

4 结论

从四季秋海棠中克隆获得了6条BsU6启动子，均具有转录活性，但活性大小存在一定差异，其中BsU6-3启动子的转录能力高于另外5条。对BsU6-3的5′端进行截短后，启动子活性有所提高，其中BsU6-3-P4 （434 bp）活性最高。

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基金资助

国家自然科学基金项目“四季秋海棠BsMYB113L介导ROS诱导花色苷合成的分子机制研究”(32172622)