表达小反刍兽疫病毒F糖蛋白重组绵羊痘病毒的构建及其增殖特性分析

Construction of a recombinant sheeppox virus expressing the F glycoprotein of a peste des petits ruminants virus and analysis of its replication characteristics

摘要

目的 构建表达小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）F糖蛋白的重组绵羊痘病毒（sheep poxvirus，SPPV）毒株，为小反刍兽疫和绵羊痘二联疫苗的研发提供候选毒株。 方法 利用PCR扩增PPRV F基因、红色荧光蛋白（RFP）基因及pUC19T-ΔTK-SPPV质粒片段，通过无缝克隆技术连接上述3段DNA序列，构建同源重组转移载体pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP。将转移载体转染Vero细胞后感染SPPV弱毒株，利用同源重组技术将PPRV F-RFP基因表达盒整合至SPPV TK基因位点，并通过观察红色荧光初步判断重组SPPV是否拯救成功，随后利用有限稀释法和细胞单克隆挑取法纯化重组SPPV。通过Western-blot、PCR及DNA测序等方法，鉴定纯化的重组SPPV，检测PPRV F糖蛋白的表达水平以及PPRV F基因的遗传稳定性。 结果 成功拯救并纯化出重组SPPV rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP，该重组病毒能够正常表达PPRV F糖蛋白且表达量随病毒的增殖而增加；纯化的重组SPPV在P₁~P₁₅代次传代过程中，未发生PPRV F基因丢失现象。 结论 成功构建一株可稳定表达PPRV F糖蛋白的重组SPPV rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP，该毒株具有良好的遗传稳定性。

Abstract

Objective This research aims to construct a recombinant sheeppox virus strain expressing the F glycoprotein of peste des petits ruminants virus，thereby providing a candidate strain for the development of a bivalent vaccine against peste des petits ruminants and sheeppox. Method The PPRV F gene，the red fluorescent protein （RFP） gene，and the pUC19T-ΔTK-SPPV plasmid fragment were amplified by PCR.The three DNA fragments above-mentioned were ligated using seamless cloning technology to construct the homologous recombination transfer vector pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP.The transfer vector was transfected into Vero cells，which were then inoculated with an attenuated SPPV strain.The PPRV F-RFP expression cassette was integrated into the SPPV TK gene locus via homologous recombination，and red fluorescence was observed to preliminarily determine whether the recombinant sheeppox virus was successfully rescued. Subsequently， the recombinant sheeppox virus was purified using limited dilution and single-cell picking techniques.Western blot，PCR，and DNA sequencing methods were employed to identify the purified recombinant sheeppox virus，to analyze the expression level of the PPRV F glycoprotein，and to assess the genetic stability of the PPRV F gene during serial passages. Result The recombinant sheeppox virus rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP was successfully rescued and purified.This recombinant virus expressed the PPRV F glycoprotein normally，with expression le-vels increasing in parallel with viral proliferation.No loss of the PPRV F gene was observed in the purified recombinant virus during the passages from P₁ to P₁₅. Conclusion A recombinant sheeppox virus rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP that stably expresses the PPRV F glycoprotein was successfully constructed，which exhibits favorable genetic stability.

Graphical abstract

关键词

小反刍兽疫病毒 / 绵羊痘病毒 / 融合蛋白 / 小反刍兽疫和绵羊痘二联疫苗 / 山羊 / 绵羊

Key words

peste des petits ruminants virus / sheep poxvirus / fusion protein / PPR and SPP bivalent vaccine / goat / sheep

小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR）和绵羊痘（sheep pox，SPP）是危害山羊和绵羊等小反刍动物的2种重要动物疫病，分别由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）和绵羊痘病毒（sheep poxvirus，SPPV）感染引起^［1］。PPR和SPP属于世界动物卫生组织和联合国粮农组织规定的法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病^［2］，其暴发与流行给羊产业的健康发展造成了严重威胁和巨大的经济损失。PPR于2007年在我国西藏首次发现，2013-2014年在新疆再次暴发，随后波及全国22个省、自治区、直辖市^［3-4］。SPP主要在我国西北地区流行，如新疆、甘肃、青海和宁夏等，其次是中部和南部地区，2012-2019年甘肃报道了SPPV感染的病例^［5-7］。由于PPRV和SPPV在宿主和地理分布上具有相似性，开发PPR和SPP的二联疫苗对上述2种疫病的防控具有重要意义。

PPRV属于副黏病毒科麻疹病毒属成员，根据其N和F基因序列的差异可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ系，其中Ⅳ系分布最广^［8-9］。PPRV病毒粒子呈多形性，有囊膜，其基因组为一条单链RNA，外部包裹着核蛋白^［10］。PPRV基因组全长15 948 bp，从5′到3′端顺序依次是N-P/C/V-M-F-HN-L基因，基因间有间隔区，可编码6种结构蛋白（N、P、M、F、HN和L）和2种非结构蛋白（C和V）^［10-13］。PPRV囊膜表面的糖蛋白由融合蛋白（fusion，F）和血凝素蛋白（hemmagglutinin，HN）组成，为PPRV诱导中和抗体的主要抗原。F糖蛋白是病毒囊膜和宿主细胞膜融合所必需的^［14］，在HN糖蛋白结合信号淋巴细胞活化分子（signal lymphocyte activatingmolecules，SLAM）或上皮细胞受体（Nectin-4）后，F糖蛋白的膜融合活性被激活，发挥促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合的作用，从而介导PPRV侵入细胞^［8］。F糖蛋白的前体蛋白F₀被宿主蛋白酶切割后，产生由二硫键连接的F₁和F₂亚基，F₁亚基具有膜融合所需的N端和介导与基质蛋白（matrix protein，M）互作的C端，F₂亚基含有糖基化位点。F糖蛋白发挥膜融合活性的核心区域在不同PPRV毒株间是高度保守的^［11-14］。

羊痘病毒基因组具有稳定性好、容量大及含有多个复制非必需区等特点，是表达外源蛋白的理想载体。SPPV属于痘病毒科（Poxvirdae）羊痘病毒属（Capripoxvirus），同属成员还包括山羊痘病毒（goat poxvirus，GTPV）和牛结节性皮肤病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）^［15］。SPPV基因组为线性双股DNA，序列全长约150 kb，核苷酸组成A+T约占75%，包含2个完全相同的由反向末端重复序列（inver terminal repeat，ITR）区域围成的中央编码区，共含有147个开放阅读框（open reading frame，ORF）。SPPV中央编码区ORF24~ORF123包含病毒复制的保守痘病毒基因序列，末端基因组区域ORF1~ORF23和ORF124~ORF156含有与LSDV相似的假定毒力基因和宿主特异性基因^［15-17］。胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因作为痘病毒毒力相关基因和复制非必需基因，缺失后可导致病毒毒力降低但免疫原性不变^［17-18］，被认为是羊痘病毒基因组中理想的外源基因插入区。李继东等^［19-20］构建了表达PPRV F/H糖蛋白的重组GTPV毒株，并证明TK基因缺失对GTPV毒株的复制没有影响，但对其毒力及增殖速度有一定影响。Berhe等^［21］构建了表达PPRV F糖蛋白的减毒LSDV（KS-1）重组毒株，该毒株可保护山羊抵抗PPRV强毒株感染，表明表达F糖蛋白的重组病毒可诱导机体产生抵抗PPRV的特异性中和抗体。孙一瑞等^［18］构建了表达PPRV H糖蛋白的重组SPPV毒株，该毒株可诱导绵羊机体产生高水平的PPRV特异性中和抗体，表明SPPV可作为表达PPRV H糖蛋白的优势载体。

本研究在前期分析SPPV及PPRV毒株基因组结构和蛋白功能的基础上，构建了转移载体pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP，通过同源重组技术将SPPV TK基因替换为PPRV F-RFP基因，成功构建一株重组绵羊痘病毒rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP，并对其F糖蛋白的表达和遗传稳定性进行了分析，以期为小反刍兽疫和绵羊痘二联疫苗的研发提供材料。

1 材料与方法

1.1 材　料

1.1.1 细胞、毒株、质粒和抗体

牛卵巢上皮细胞（hTERT-OEC）、非洲绿猴肾细胞（Vero）、PPRV疫苗毒株（Nigeria 75）以及SPPV弱毒株，均由青海大学保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞（KTSM101L），购自康体生命科技有限公司。pCAGGS-PPRV F-HN质粒和pUC19T-ΔTK-SPPV-RFP质粒，本课题组前期构建。PPRV F多克隆抗体，由青海大学兽医公共卫生学实验室保存。LSDV ORF29单克隆抗体，由兰州兽医研究所馈赠。Anti-β-actin，购自Abmart生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂与设备

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（P505-d1）、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit（C112-01）和ClonExpress Uilra One Step Cloning Kit V3（C117-01），购自南京诺唯赞生物有限公司；Taq 2×PCR Mix with Dye V2（RM20391），购自爱博泰克生物有限公司；限制性内切酶Asc Ⅰ和Pme Ⅰ（R0558VVIAL和R0560VVIAL），购自New England Biolabs有限公司；病毒DAN提取试剂盒（DP315），购自Tiangen有限公司；细胞转染试剂jet PRIME（DP105-3），购自Poly plus；胎牛血清（FBS）（CF602/C04001-500），购自上海诺莱生物有限公司；DMEM培养基（66001-668），购自健顺生物有限公司；无钙镁PBS缓冲液（C3593），购自上海逍鹏生物有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒（D2500-02），购自Promega有限公司。

1.1.3 引物设计与合成

根据PPRV毒株全基因组序列（GenBank登录号：KT633939）、SPPV弱毒株全基因组序列（全基因组测序所得，尚未上传GenBank）、pCAGGS-PPRV F-HN质粒序列和pUC19T-ΔTK-SPPV-RFP质粒序列，采用SnapGene软件设计引物序列，交给金唯智（苏州）科技和生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物相关信息见表1。

1.2 目的基因片段的PCR扩增

以pCAGGS-PPRV F-HN质粒为模板，用引物Primer-PPRV F-F/Primer-PPRV F-R扩增PPRV野毒株F基因全长序列。以pUC19T-ΔTK-SPPV-RFP质粒为模板，用引物Primer-Vector-F/Primer-Vector-R扩增pUC19T-ΔTK-SPPV质粒载体基因片段（包含SPPV TK基因同源臂和启动子序列），使其线性化，并用引物Primer-RFP-F/Primer-RFP-R扩增红色荧光蛋白（RFP）基因全长序列。试验设立以ddH₂O代替模板的处理为阴性对照。PCR反应体系如下：2×phantas Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，Phanta Max Super DNA Polymerase 1 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，模板pCAGGS-PPRV F-HN质粒DNA 2 μL或pUC19T-ΔTK-SPPV-RFP质粒DNA 1 μL，ddH₂O补足50 μL。反应程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，58 或52 ℃（具体温度依表1中的引物而定）退火15 s，72 ℃延伸1 min（RFP基因）、2 min（PPRV野毒株F基因）或4 min（pUC19T-ΔTK-SPPV质粒载体基因片段），35个循环；72 ℃终延伸5 min。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收预期大小的基因片段。

1.3 pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP转移载体的构建

采用无缝克隆方法将上述PCR扩增所得目的基因片段进行连接，连接体系为2×CE Mix V3 10 μL，pUC19T-ΔTK-SPPV线性化载体片段2 μL，PPRV F 基因片段3 μL，RFP基因片段2 μL，ddH₂O补足20 μL；反应程序：50 ℃，30 min。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布2×YT固体平板（含10 μg/mL氨苄霉素），37 ℃培养12~14 h，挑取单克隆菌落接种至2×YT液体培养基，振荡培养14 h，提取质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP。

1.4 rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV的构建

将Vero细胞铺于6孔细胞培养板，待细胞长满培养板的80%~90%时，转染转移载体pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP，18~24 h后感染SPPV弱毒株，24~72 h后观察红色荧光及细胞病变情况。若荧光显微镜下观察到SPPV感染细胞病变与红色荧光重合，则表明重组SPPV初步拯救成功。随后，收取6孔板中红色荧光与细胞病变重合较多的孔中细胞及培养上清，冻融离心后接种hTERT-OEC细胞，对重组SPPV进行扩大培养，再通过挑取细胞单克隆及96孔板细胞亚克隆的方法连续多次传代纯化重组SPPV，将纯化的重组SPPV命名为rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP。

1.5 rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV的鉴定

采用PCR及DNA测序的方法对rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV中PPRV F基因的插入情况及纯化情况进行鉴定。用DNA提取试剂盒提取纯化至第25代（P₂₅）的重组SPPV和SPPV弱毒株基因组DNA，并以重组病毒DNA为模板，用引物Primer-F1-F/Primer-F1-R扩增PPRV F基因片段，用引物Primer-TK-F/Primer-TK-R扩增SPPV TK基因片段，用引物Primer-F2-F/Primer-F2-R扩增SPPV TK基因位点同源臂、启动子和PPRV F-RFP基因片段。试验同时设立pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP转移载体、SPPV弱毒株基因组DNA代替模板的处理为阳性对照，以ddH₂O代替模板的处理为阴性对照。PCR体系如下：2×Taq PCR Mix with Dye V2 25 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，模板pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP质粒DNA 1 μL或SPPV弱毒株基因组DNA 4 μL或rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP基因组DNA 3 μL，ddH₂O补足50 μL。反应程序如下：94 ℃预变性3 min；98 ℃变性15 s，54~58 ℃（具体温度依引物而定）退火30 s，65 ℃延伸1 min（PPRV F基因、SPPV TK基因）或3 min（SPPV TK基因位点同源臂、启动子、PPRV F-RFP基因），35个循环；72 ℃终延伸5 min。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增的PPRV F基因片段送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.6 rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV抗原蛋白表达鉴定

以β-actin为内参蛋白，采用Western-blot方法鉴定rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV F糖蛋白和ORF29蛋白的表达情况。将hTERT-OEC细胞铺于6孔板，待细胞融合度达80%~90%时，接种纯化后的rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV，培养96 h后，加入2×Loading Buffer收集感染细胞，于65 ℃金属浴中加热15 min，制备待检样品。同时，设立未接种rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV的hTERT-OEC细胞为阴性对照，PPRV疫苗株（Nigeria75株）和SPPV弱毒株感染的hTERT-OEC细胞为阳性对照。将制备的细胞样品进行10% SDS-PAGE电泳（80 V 30 min，120 V 1 h），湿转法（250 mA，2 h）转至硝酸纤维素膜，用50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜3次；4 ℃孵育一抗过夜，一抗分别为Anti-F（1∶1 250倍稀释）、Anti-ORF 29（1∶2 500倍稀释）和Anti-β-actin（1∶5 000倍稀释）；TBST洗膜3次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶5 000倍稀释）二抗，室温孵育1 h；TBST再次洗膜3次后，加入显色液显影。

1.7 rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV外源基因遗传稳定性分析

将hTERT-OEC细胞铺于6孔板，待细胞融合度达80%~90%时，接种纯化的rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV，待6孔板的细胞病变较明显时，将6孔板冻存于-80 ℃冰箱，反复冻融3次，收集培养上清及细胞，离心后接种至新的hTERT-OEC细胞6孔板。按照上述操作对rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV连续传代至第15代（P₁~P₁₅），在传代过程中对细胞进行荧光显微镜观察。使用DNA提取试剂盒分别提取P₁、P₂、P₃、P₅、P₇、P₉、P₁₁、P₁₃、P₁₅代次的病毒基因组DNA。以P₁~P₁₅代次重组病毒DNA为模板，用引物Primer-F1-F/Primer-F1-R对病毒传代过程中外源基因PPRV F的遗传稳定性进行PCR分析，试验设立pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP转移载体和ddH₂O分别为阳性和阴性对照。PCR体系如下：2×Taq PCR Mix with Dye V2 25 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，模板pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP质粒DNA 1 μL或rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV基因组DNA 3 μL，ddH₂O补足50 μL。反应程序如下：94 ℃预变性3 min；98 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，65 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸5 min。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8 rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV的增殖特性分析

采用Western-blot方法评估rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV在hTERT-OEC细胞内的增殖情况及PPRV F糖蛋白的表达情况。将hTERT-OEC细胞铺于6孔培养板，待细胞融合度达80%~90%时，感染纯化后的P₁₅代rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组病毒，分别于感染后24，48，72和96 h取样，进行Western-blot检测，具体试验方法同1.6节，试验设未感染P₁₅代重组病毒的空白hTERT-OEC细胞为对照。利用Image J软件对不同时间点F糖蛋白的表达水平进行分析。

2 结果与分析

2.1 目的基因扩增与pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP转移载体的构建

以质粒pUC19T-ΔTK-SPPV-RFP为模板，PCR扩增得到4 163 bp的pUC19T-ΔTK-SPPV质粒线性化基因片段（图1-A）。以质粒pCAGGS-PPRV F-HN为模板，PCR扩增得到1 710 bp的PPRV F基因片段（图1-B）。以质粒pUC19T-ΔTK-SPPV-RFP为模板，PCR扩增得到1 042 bp的RFP基因片段（图1-C）。pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP转移载体测序结果（图2）显示，PPRV F基因和RFP基因已经连接到pUC19T-ΔTK-SPPV质粒载体基因片段上，表明转移载体构建成功。

2.2 rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV的构建与纯化

在荧光显微镜下可见，SPPV感染的细胞病变与红色荧光相互重合（图3），表明重组SPPV拯救成功。随着重组SPPV传代次数的增加，观察到的红色荧光与病变细胞重合逐渐增加，未与红色荧光重合的病变细胞逐渐减少。传至第5代（P₅）时可观察到典型的羊痘细胞病变，传至第25代（P₂₅）时，红色荧光与细胞病变100%重合（图4），结果初步表明rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV已纯化。

2.3 rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV的鉴定

对PPRV F基因进行PCR扩增，pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP转移载体阳性对照和rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV均可扩增出约569 bp的F基因片段（图5-A），且测序正确（图6）；对SPPV TK基因进行PCR扩增，仅SPPV弱毒株DNA阳性对照可扩增出约345 bp的TK基因片段（图5-B）；对TK基因同源臂、启动子和PPRV F-RFP基因片段进行PCR扩增，pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP转移载体阳性对照和rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV均可扩增出约3 124 bp的同源臂、启动子和PPRV F-RFP基因片段（图5-C）。结果表明，rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV构建成功。

2.4 rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV抗原蛋白表达鉴定

Western-blot结果（图7）显示，相较于阴性对照，PPRV疫苗株（Nigeria 75株）和SPPV弱毒株感染细胞阳性对照及rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV感染细胞均可检测出PPRV F糖蛋白和ORF29蛋白，表明rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP可正常表达PPRV F糖蛋白和SPPV ORF29蛋白。

2.5 rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV外源基因遗传稳定性分析

在连续P₁~P₁₅传代过程中，rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV感染的hTERT-OEC细胞可观察到红色荧光与细胞病变完全重合（图8）。P₁~P₁₅代重组病毒均可扩增出约569 bp的PPRV F基因（图9）。结果表明，rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV在传代过程中PPRV F基因可稳定遗传。

2.6 rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV的增殖特性分析

Western-blot结果（图10-A）显示，rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组SPPV感染后24~96 h，hTERT-OEC细胞均可正常表达SPPV ORF29蛋白和PPRV F糖蛋白，且随感染时间的延长，2种蛋白表达量均逐渐增加。蛋白条带的灰度扫描分析结果（图10-B）与Wes-tern-blot结果一致，表明rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP感染的hTERT-OEC细胞生长特性良好，可稳定表达PPRV F糖蛋白。

3 讨 论

PPR和SPP是危害山羊、绵羊等小反刍动物的重大疫病，疫苗免疫是防控这2种疫病的有效方法。本研究利用同源重组方法在SPPV基因组TK基因位点插入PPRV F基因构建重组病毒，经多次筛选成功获得rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组病毒。PCR、Western-blot及DNA测序鉴定结果表明，构建的rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组病毒增殖特性良好，可稳定表达PPRV F蛋白，为后续PPRV和SPPV二联疫苗的研制提供了候选毒株。

同源重组技术已应用于羊痘病毒基因组的编辑^［22-27］。构建同源重组转移载体时，需选择合适的插入位点上下游同源臂、启动子、目的基因及筛选基因。本研究以PPRV TK基因上游ORF60基因序列及下游ORF62基因序列为参考设计同源臂，并引入启动子pmH5、PPRV F基因及红色荧光蛋白（RFP）标记基因，构建pUC19T-ΔTK-PPRV F-RFP转移载体。将转移载体转染Vero细胞18~24 h后感染SPPV弱毒株，感染后24~72 h可观察到红色荧光，表明重组病毒拯救成功，同源重组效率及红色荧光蛋白表达良好。

与大部分研究采用p7.5启动子调控PPRV HN/F基因表达盒、p11启动子调控荧光标记基因和压力筛选基因表达盒来拯救和筛选重组羊痘病毒的策略^［24-27］不同，本研究采用本实验室前期优化筛选的早晚期启动子pmH5调控PPRV F基因与RFP基因的表达，并在未引入压力筛选基因的条件下构建转移载体，进而拯救重组病毒，该方法简化了重组病毒的纯化过程。通过观察红色荧光及细胞病变，并结合细胞单克隆挑取技术，成功拯救rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组绵羊痘病毒，结果表明该策略是可行的。本课题组前期采用类似的策略构建了牛结节性皮肤病病毒（LSDV）TK基因缺失毒株^［28］及羊口疮病毒ORF112基因缺失毒株^［29］，这为本试验提供了经验参考。同时，鉴于RFP基因的引入可能会影响重组病毒的免疫原性，因此在其序列上下游引入了方向相同的loxP位点，以便后续切除该标记基因。本实验室前期已通过Cre-loxP系统成功切除了插入TK位点的RFP基因，构建了缺失TK基因的LSDV-ΔTK重组病毒^［30］，这为本研究后续切除重组病毒中的RFP标记基因提供了经验参考。

相比于酶切连接方法^［19-27］，本研究采用无缝克隆技术构建转移载体。该方法仅需通过酶切或PCR扩增将载体线性化，并利用在目的基因序列两端引入的15~20 bp同源臂，即可实现目的基因与载体的连接，且能同时插入多个基因片段，构建方式更灵活。马晨昕等^［31］使用该方法构建了伊蚊表皮蛋白基因AaCPR100A的双启动子原核表达载体；邓小亮等^［32］使用该方法构建了新西兰兔SOD1基因的分泌型原核表达载体。

PPRV F基因在重组病毒传代过程中的遗传稳定性是评价PPRV和SPPV二联疫苗候选病毒株的重要标准。本研究所构建的rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组绵羊痘病毒在纯化及纯化后的传代过程中，均未出现PPRV F基因缺失的现象，表明该基因可在重组病毒基因组中稳定遗传。PPRV F基因的成功插入及PPRV F糖蛋白和SPPV ORF29蛋白的表达量随感染时间的延长而增加的结果表明，SPPV TK基因可作为外源基因的插入位点。同样，TK基因的缺失未影响SPPV病毒的复制，这与以往的研究结果^［20］相符。

为进一步评估rSPPV-ΔTK-PPRV F-RFP重组绵羊痘病毒作为候选疫苗株的潜力，下一步将开展相关动物免疫试验，验证该重组病毒的保护效力。

参考文献

[1] Li J D， Wang J L， Guo Y N，et al.A recombinant capripoxvirus expressing the F protein of peste des petits ruminants virus and the P12A3C of foot-and-mouth disease virus［J］.BMC Veterinary Research，2023，19（1）：18.

[2] Fao， OIE. Guidelines for the control and prevention of peste des petits ruminants （PPR） in wildlife populations： peste des petits ruminants global eradication programme［EB/OL］. （2021-08-24）［2025-08-25］.

[3] 翟军军.小反刍兽疫病毒全长cDNA的构建及DNA疫苗的免疫学研究［D］.北京：中国农业科学院，2012.

[4] Zhai J J.Construction of full-length cDNA of peste des petits ruminants virus and immunological study of the developed DNA vaccine［D］.Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2012.

[5] 邝永胜，穆芸，孙甜甜，等.小反刍兽疫病毒诱导的内质网应激对山羊肾细胞PERK信号通路和细胞凋亡的影响［J］.中国兽医学报，2024，44（9）：1882-1891.

[6] Kuang Y S， Mu Y， Sun T T，et al.Effect of endoplasmic reticulum stress induced by peste des petits ruminants virus on PERK signaling pathway and apoptosis in goat kidney cells［J］.Chinese Journal of Veterinary Science，2024，44（9）：1882-1891.

[7] Zhou T， Jia H J， Chen G H，et al.Phylogenetic analysis of Chinese sheeppox and goatpox virus isolate ［J］.Virology Journal，2012，9（1）：25.

[8] 白衡，毛甜甜，方梅，等.小尾寒羊绵羊痘病例的诊断［J］.畜牧兽医学报，2021，52（1）：202-210.

[9] Bai H， Mao T T， Fang M，et al.The diagnosis of sheep pox cases in the small-tail Han ewes［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2021，52（1）：202-210.

[10] Yan X M， Chu Y F， Wu G H，et al.An outbreak of sheep pox associated with goat poxvirus in Gansu Province of China［J］.Veterinary Microbiology，2012，156（3/4）：425-428.

[11] Parida S， Muniraju M， Mahapatra M，et al.Peste des petits ruminants［J］.Veterinary Microbiology，2015，181（1/2）：90-106.

[12] Balamurugan V， Sen A， Venkatesan G，et al.Peste des petits ruminantsvirus detected in tissues from an Asiatic lion （Panthera Leo persica） belongs to Asian lineage Ⅳ［J］.Journal of Veterinary Science，2012，13（2）：203.

[13] 刘振东，孙跃峰，朵红，等.小反刍兽疫病毒致病机制研究进展［J］.病毒学报，2023，39（5）：1484-1495.

[14] Liu Z D， Sun Y F， Duo H，et al.Research progress on pathogenesis mechanism of peste des petits ruminants virus［J］.Chinese Journal of Virology，2023，39（5）：1484-1495.

[15] Bailey D， Banyard A， Dash P，et al.Full genome sequence of peste des petits ruminants virus，a member of the Morbillivirus genus［J］.Virus Research，2005，110（1/2）：119-124.

[16] 李玲霞，张旭辉，令小东，等.稳定表达小反刍兽疫病毒N蛋白的THP-1细胞系的建立与应用［J］.中国兽医科学，2025，55（4）：456-462.

[17] Li L X， Zhang X H， Ling X D，et al.Establishment and application of THP-1 cell line with stable expression N protein of peste des petits ruminants virus［J］.Chinese Veterinary Science，2025，55（4）：456-462.

[18] Baron M D， Diallo A， LAncelot R，et al.Peste des petits ruminants virus［J］.Advances in Virus Research，2016，95：1-42.

[19] Chard L S， Bailey D S， Dash P，et al.Full genome sequences of two virulent strains of peste-des-petits ruminants virus，the Côte d’Ivoire 1989 and Nigeria 1976 strains［J］.Virus Research，2008，136（1/2）：192-197.

[20] Tulman E R， Afonso C L， Lu Z，et al.The genomes of sheeppox and goatpox viruses［J］.Journal of Virology，2002，76（12）：6054-6061.

[21] Hamdi J， Munyanduki H， Omari T K，et al.Capripoxvirus infections in ruminants：a review［J］.Microorganisms，2021，9（5）：902.

[22] 雷震.山羊痘病毒“GTPV-gp024”基因区插入外源基因的表达研究［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2009.

[23] Lei Z.Study on expression of foreign genes inserted into locus of “GTPV-gp024” in goatpox virus［D］.Urumqi：Xinjing Agricultural University，2009.

[24] 孙一瑞.表达小反刍兽疫病毒H蛋白的重组绵羊痘病毒的构建及免疫原性研究［D］.北京：中国农业科学院，2017.

[25] Sun Y R.Construction and immunogenicity study of recombinant sheep pox virus expressing PPRV H protein［D］.Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2017.

[26] 李继东，蒙学莲，朱学亮，等.小反刍兽疫病毒H基因或F基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究［J］.中国兽医科学，2015，45（2）：111-117.

[27] Li J D， Meng X L， Zhu X L，et al.Study on recombinant goatpox virus vaccines vectored with H or F gene of peste des petits ruminants virus［J］.Chinese Veterinary Science，2015，45（2）：111-117.

[28] 李继东，才学鹏.山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响［J］.中国畜牧兽医，2017，44（2）：319-326.

[29] Li J D， Cai X P.Effect on proliferation of goat pox virus of TK gene deficiency［J］.China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2017，44（2）：319-326.

[30] Berhe G， Minet C， Le Goff C，et al.Development of a dual recombinant vaccine to protect small ruminants against peste-des-petits-ruminants virus and capripoxvirus infections［J］.Journal of Virology，2003，77（2）：1571-1577.

[31] Teffera M， Babiuk S.Potential of using capripoxvirus vectored vaccines against arboviruses in sheep，goats，and cattle［J］.Frontiers in Veterinary Science，2019，6：450.

[32] Chaudhary S S， Pandey K D， Singh R P，et al.A vero cell derived combined vaccine against sheep pox and peste des petits ruminants for sheep［J］.Vaccine，2009，27（19）：2548-2553.

[33] Chen W Y， Hu S， Qu L M，et al.A goat poxvirus-vectored peste-des-petits-ruminants vaccine induces long-lasting neutralization antibody to high levels in goats and sheep［J］.Vaccine，2010，28（30）：4742-4750.

[34] Caufour P， Rufael T， Lamien C E，et al.Protective efficacy of a single immunization with capripoxvirus-vectored recombinant peste des petits ruminants vaccines in presence of pre-existing immunity［J］.Vaccine，2014，32（30）：3772-3779.

[35] 陈韵，任善会，杜新潮，等.表达小反刍兽疫田间毒株HN糖蛋白重组山羊痘毒株的构建及其增殖特性分析［J］.病毒学报，2026，42（3）：976-986.

[36] Chen Y， Ren S H， Du X C，et al.Construction of a recombinant goatpox virus expressing the hemagglutinin glycoprotein of a field strain of peste des petits ruminants virus and analysis of its replication characteristics［J］.Chinese Journal of Virology，2026，42（3）：976-986.

[37] 李继东.小反刍兽疫及口蹄疫病毒抗原基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究［D］.北京：中国农业科学院，2014.

[38] Li J D.Study on recombinant vaccine of goatpox virus vectored antigen genes of peste des petits ruminants virus and foot and mouth disease virus［D］.Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2014.

[39] 张玉哲，任善会，姚威，等.应用Cre-LoxP系统构建牛结节性皮肤病病毒缺失TK基因毒株［J］.畜牧兽医学报，2024，55（10）：4517-4529.

[40] Zhang Y Z， Ren S H， Yao W，et al.Application of the Cre-LoxP system to construct the deleted TK gene of the lumpy skin disease virus［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2024，55（10）：4517-4529.

[41] 尤婷，任善会，王萌，等.羊口疮病毒ORF112基因缺失毒株的构建及增殖能力分析［J］.畜牧兽医学报，2024，55（11）：5200-5210.

[42] You T， Ren S H， Wang M，et al.Construction and replication ability of the ORF112 gene deleted orf virus strain［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2024，55（11）：5200-5210.

[43] Ren S H， Zhang Y Z， Gao X L，et al.Platform establishment of the Cre-loxP recombination system for genetic manipulation of the Lumpy skin disease virus［J］.Veterinary Microbiology，2024，294：110122.

[44] 马晨昕，张莹心，刘思寒，等.利用无缝克隆方法构建埃及伊蚊表皮蛋白基因AaCPK100A双向启动子苏云金芽孢杆菌穿梭载体［J］.中国热带医学，2023，23（11）：1141-1145.

[45] Ma C X， Zhang Y X， Liu S H，et al.Construction a shuttle vector containing AaCPK100A epidermal protein gene of Aedes aegypti with two spore-producing-dependent promoters in Bacillus thuringiensis by in-fusion cloning［J］.China Tropical Medicine，2023，23（11）：1141-1145.

[46] 邓小亮，马文康，付欣，等.新西兰兔SOD1基因的分泌型原核表达载体构建及在E.coli表达［J］.畜牧与兽医，2019，51（8）：47-51.

[47] Deng X L， Ma W K， Fu X，et al.Construction and expression of the SOD1 gene of New Zealand rabbits on E.coli by recombinant secretory prokaryotic vector［J］.Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2019，51（8）：47-51.

基金资助

青海省基础研究计划项目(2024-ZJ-721)

甘肃省自然科学基金项目(24JRRE011)

高校教师创新基金项目(2025A-326)

国家自然科学基金地区科学基金项目(32460876)