奶牛乳房炎两种主要链球菌可视化LAMP检测方法的建立

Establishment of a visual LAMP assay for two major Streptococci associated with bovine mastitis

摘要

目的 分别建立无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）的可视化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法，为快速准确诊断和有效防控奶牛乳房炎提供技术支撑。 方法 以无乳链球菌cfb基因和停乳链球菌16S rRNA基因作为检测靶标，设计并筛选特异性LAMP引物组合，通过优化Mg²⁺、甜菜碱和dNTPs浓度以及反应温度和反应时间，构建最佳LAMP检测体系。在体系中加入钙黄绿素荧光染料实现结果可视化。对建立方法的特异性和灵敏度进行评价。采用建立的方法与常规PCR法对宁夏地区300份临床乳样进行平行检测，比较二者的检出率。 结果 无乳链球菌和停乳链球菌LAMP检测的最优引物组分别为Sa-LAMP-2和Sd-LAMP-3。无乳链球菌和停乳链球菌检测体系的最佳Mg²⁺浓度均为5 mmol/L，dNTPs浓度均为1.6 mmol/L，甜菜碱均无需添加，反应温度均为65 ℃，反应时间分别为50和40 min。优化后的方法仅对目标菌产生特异性扩增信号，检测灵敏度均为5.0×10¹ 拷贝/μL，较PCR法提高了100倍。可视化LAMP对临床乳样的检测结果显示，无乳链球菌和停乳链球菌的检出率分别为42.0%和32.3%，均高于PCR法的31.0%和24.3%。 结论 建立了2种链球菌的可视化LAMP检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性强、快速简便且结果可视等特点，可用于奶牛乳房炎主要链球菌的现场即时检测与流行病学调查。

Abstract

Objective The study aims to establish visual loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assays for detecting Streptococcus agalactiae and Streptococcus dysgalactiae，thereby providing technical su-pport for rapid and accurate diagnosis，and effective prevention and control of bovine mastitis. Method cfb gene of S.agalactiae and 16S rRNA genes of S.dysgalactiae were selected as target sequences.Specific LAMP primer sets were designed and screened.The optimal LAMP reaction system was established by optimizing the concentrations of Mg²⁺，betaine，and dNTPs，and the reaction temperature and time.Calcein fluorescent dye was added to the reaction system for visual detection.The specificity and sensitivity of the established assays were evaluated.The developed LAMP assays and conventional PCR assays were used in parallel to detect 300 clinical milk samples from Ningxia，China，and the detection rates of the two methods were compared. Result The optimal primer sets for the LAMP detection of S.agalactiae and S.dysgalactiae were Sa-LAMP-2 and Sd-LAMP-3，respectively.For both LAMP systems，the optimal Mg²⁺ concentration was 5 mmol/L，the optimal dNTPs concentration was 1.6 mmol/L，and no betaine supplement was required.The optimal reaction temperature for both assays was 65 °C，while the optimal reaction time was 50 min for S. agalactiae and 40 min for S. dysgalactiae.The optimized method generated specific amplification signals only for the target bacteria，with a detection sensitivity of 5.0×10¹ copies/μL，which was 100-fold higher than that of conventional PCR.Clinical milk sample detection results revealed that the positive detection rates of S.agalactiae and S.dysgalactiae were 42.0% and 32.3%，respectively，which were higher than the corresponding rates of 31.0% and 24.3% obtained by conventional PCR. Conclusion Visual LAMP assays for the detection of S.agalactiae and S.dysgalactiae were successfully established.The developed assays possess high sensitivity，excellent specificity，rapi-dity，simplicity，and visualized readout.Therefore，they are suitable for on-site point-of-care detection and epidemiological investigation of mastitis-associated streptococci in dairy cows.

Graphical abstract

关键词

奶牛乳房炎 / 链球菌 / 环介导等温扩增技术（LAMP） / 可视化检测

Key words

bovine mastitis / Streptococcus / loop-mediated isothermal amplification （LAMP） / visual detection

奶牛乳房炎是一种严重威胁奶牛健康和牧场经济效益的常见疾病，其发生通常与乳房组织受损、环境应激以及病原微生物的侵入等密切相关。乳房炎可破坏乳房结构和功能，引起泌乳能力下降及乳汁品质改变，给奶牛养殖业和乳制品生产带来严重的经济损失^［1］。相关调查显示，我国奶牛乳房炎发病率为20%~70%，每年由此导致的经济损失高达150亿~450亿元，约占奶牛常见生产疾病造成总损失的38%^［2］。在奶牛乳房炎的多种致病菌中，链球菌属细菌具有较高的分离率，其中无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）是最为常见的2种链球菌病原^［3-4］。无乳链球菌属于典型的传染性病原，易在牛群中持续传播并引起乳房慢性感染^［5］；停乳链球菌兼具传染性和环境性病原的特性，感染后常出现乳房红肿及血奶等症状^［6-7］。因此，针对上述链球菌建立高效、可靠的检测方法，对于乳房炎的早期诊断和防控具有重要意义。目前，针对无乳链球菌和停乳链球菌的检测方法主要包括传统的病原分离鉴定、免疫学检测、分子生物学检测等。传统的病原分离鉴定法能够实现病原菌的直接鉴定，但培养周期较长、操作繁杂，难以满足现场快速检测的需求^［8］。免疫学检测主要基于抗原抗体反应的原理，操作相对简单，但其检测灵敏度和特异性在复杂样品检测中效果不佳，易出现假阳性结果^［9］。分子生物学方法准确性和灵敏度较高，但该方法操作流程复杂，对试验条件和仪器设备要求较高，不适用于基层和现场检测^［10］。因此，开发一种适合于现场快速、准确的乳房炎检测方法迫在眉睫。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等^［11］ 在2000年提出的一种等温核酸扩增方法，该方法在60~65 ℃的恒温条件下，通过4~6条引物协同识别靶基因的6~8个特定区域位点，并依赖具有高链置换活性的Bst DNA聚合酶实现快速自引发扩增，无需DNA变性步骤，可在30~60 min内实现靶基因单拷贝模板的10⁹倍扩增^［12］。Nagamine等^［13］引入2条环引物，将LAMP反应速率提升了2~3倍，相较于常规PCR法，显著提高了反应效率与灵敏度，并大幅缩短反应时间。此外，LAMP扩增产物可通过荧光染料、侧流试纸条及浊度法等多种方式实现结果的可视化判读^［14-15］。近年来，LAMP技术凭借操作简化、快速、成本低、灵敏度高及单管反应等特点，已广泛应用于食品安全、动植物病害以及生物医药等多个领域^［16-18］，并成功用于新型冠状病毒^［19-20］、结核分枝杆菌^［21-22］、乙型肝炎病毒^［23］及猪圆环病毒^［24］等病原微生物的检测。然而，针对奶牛乳房炎主要致病链球菌的可视化LAMP检测研究不足，尤其是同时面向无乳链球菌和停乳链球菌的系统研究报道较少。

基于此，本研究分别以无乳链球菌cfb基因和停乳链球菌16S rRNA保守基因为检测靶标，通过设计并筛选特异性引物，优化反应温度、反应时间、Mg²⁺浓度、甜菜碱浓度和dNTPs浓度，建立稳定可靠的LAMP反应体系，同时引入钙黄绿素荧光染料实现结果的可视化判读，使检测过程无需依赖复杂仪器即可通过肉眼观察完成，以期为奶牛乳房炎主要链球菌的基层现场即时检测和流行病学调查提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材　料

1.1.1 试验菌株和乳样

乳房炎相关的20株细菌，来源于美国菌种保藏中心（ATCC）和中国医学细菌菌种保藏中心（CMCC），其基本信息见表1。从宁夏银川市周边3家规模化奶牛养殖场采集疑患乳房炎奶牛的乳样300份，备用。

1.1.2 主要试剂

Bst 2.0 DNA Polymerase、MgSO₄及10×Isohermal Amplification buffer，购于美国New England BioLabs公司；甜菜碱，由美国Sigma和Biotium公司提供；DNeasy PowerFood Microbial kit，购于德国QIAGEN公司；钙黄绿素，购于中国荣研生物科技公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司；dNTP Mix、质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒以及大肠杆菌感受态细胞DH5α，购于北京天根生化科技有限公司；50×TAE、pUC57载体及Premix Taq，购于北京TaKaRa生物有限公司；氨苄青霉素，购于北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方　法

1.2.1 DNA模板的提取

采用细菌基因组提取试剂盒提取供试20株菌的DNA，使用Nanodrop 8000测定DNA浓度与纯度。取1.8 mL乳样于2 mL EP管中，于13 000 r/min条件下离心1 min，弃上清，加入1 mL生理盐水重悬后再次离心，重复洗涤2次以去除乳样中的杂质成分，随后依据Deasy PowerFood Microbial Kit操作说明提取乳样DNA。试验所得的DNA样品均于-20 ℃保存，备用。

1.2.2 靶基因筛选与引物设计

从NCBI数据库获取无乳链球菌cfb基因（GenBank ID：HQ148672.1）和停乳链球菌16S rRNA基因（GenBank ID：EF121447.1）序列，用BLAST比对分析其保守性与特异性。利用Primer Explore V5软件设计cfb和16S rRNA的LAMP引物，每个基因均设计3组引物，各组引物均包含外引物F3和B3、环引物LF和LB以及由F1c-F2和B1c-B2区域组成的内引物FIP与BIP。同时，针对无乳链球菌cfb和停乳链球菌16S rRNA基因各设计1对PCR引物，其扩增片段长度分别为293和551 bp。无乳链球菌LAMP和PCR引物分别命名为Sa-LAMP、Sa-PCR，停乳链球菌LAMP和PCR引物分别命名为Sd-LAMP和Sd-PCR。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列见表2。

1.2.3 质粒标准品的制备

以无乳链球菌和停乳链球菌基因组DNA为模板，PCR扩增cfb和16S rRNA基因，反应体系为50 μL，包括Premix Taq25 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH₂O 22 μL。反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，共32个循环；72 ℃ 7 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收与纯化，连接至pUC57载体，构建pUC57-cfb、pUC57-16S rRNA，并转化到大肠杆菌DH-5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒并测定浓度与纯度，部分样品送至上海生工生物工程有限公司进行测序验证，其余样品-20 ℃保存备用。

1.2.4 LAMP引物的筛选

以质粒标准品pUC57-cfb、pUC57-16S rRNA为阳性对照，ddH₂O为阴性对照，对3组LAMP引物进行筛选。初始反应体系包括Isothermal Amplification Buffer 2.5 μL，Bst 2.0 DNA Polymerase（8 U/μL）1 μL，甜菜碱（5 mol/L）2.4 μL，dNTPs（10 mmol/L）2.8 μL，MgSO₄（100 mmol/L）2 μL，F3/B3引物（10 μmol/L）各0.25 μL，FIP/BIP引物（10 μmol/L）各0.8 μL，LF/LB引物（10 μmol/L）各0.5 μL，EvaGreen（20×）1 μL，模板DNA 1 μL，ddH₂O 9.2 μL。反应在Roche Light Cycler^® 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪中于65 ℃扩增1 h，通过荧光扩增曲线综合评价引物的扩增性能与特异性。

1.2.5 LAMP反应体系和条件的优化

以质粒标准品pUC57-cfb、pUC57-16S rRNA为阳性对照，ddH₂O为阴性对照（N），采用单因素试验对LAMP反应体系和条件进行优化。试验设置Mg²⁺浓度分别为2，3，4，5，6，7，8，9和10 mmol/L；甜菜碱浓度分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mol/L；dNTPs浓度分别为1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2和2.4 mmol/L；反应温度分别为61，62，63，64，65和66 ℃；反应时间分别为20，30，40，50，60 min。通过比较不同条件下的扩增效果确定最佳检测体系和条件。

1.2.6 可视化LAMP反应的建立

在优化后的反应体系中加入1 μL钙黄绿素荧光染料，将反应管放入恒温金属浴中65 ℃反应相应时间，肉眼观察颜色变化，若反应体系呈黄绿色则为阳性，若呈浅橙色则为阴性。

1.2.7 特异性评价

以质粒标准品pUC57-cfb、pUC57-16S rRNA作为阳性对照，ddH₂O为阴性对照，目标菌株（无乳链球菌和停乳链球菌）为阳性样本，非目标菌株为阴性样本，在优化好的条件下进行可视化LAMP扩增。同时进行PCR扩增，扩增引物序列见表2，反应体系和程序见1.2.3节，对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。结合实时荧光扩增曲线、可视化结果及PCR电泳对所建立LAMP方法的特异性进行评价。

1.2.8 灵敏度评价

测得质粒标准品pUC57-cfb、pUC57-16S rRNA的质量浓度分别为89.36和65.8 ng/μL，依据拷贝数（拷贝/μL）=6.02×10²³×质粒浓度（ng/μL）×10^－9/（质粒长度×660），计算可得2种质粒含量分别为2.4×10¹⁰和1.5×10¹⁰ 拷贝/μL。将2种质粒含量统一调整至5×10¹⁰ 拷贝/μL后进行10倍倍比稀释，制备（5×10⁶）~（5×10⁰）拷贝/μL的7个梯度标准品，分别进行可视化LAMP检测和PCR检测，比较2种方法的灵敏度。试验以ddH₂O为阴性对照。

1.2.9 临床样本的检测

采用建立的可视化LAMP检测方法对300份奶牛乳样进行检测，同时用PCR方法进行平行检测（对照），比较二者的检出率，评价所建立方法在实际样本检测中的应用效果和可靠性。

2 结果与分析

2.1 质粒标准品的构建

采用表2所示的Sa-PCR与Sd-PCR引物，分别对无乳链球菌cfb与停乳链球菌16S rRNA基因进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，目的条带大小分别约为293和551 bp，与预期片段长度一致（图1）。对构建的pUC57-cfb和pUC57-16S rRNA进行测序验证，序列比对分析结果表明，扩增序列与无乳链球菌cfb基因及停乳链球菌16S rRNA基因的保守区域序列完全一致，表明质粒标准品pUC57-cfb和pUC57-16 SrRNA构建成功，可用于后续试验。

2.2 LAMP引物筛选

2种链球菌不同LAMP引物组的扩增结果如图2所示。由图2可知，以pUC57-cfb和pUC57-16S rRNA为模板，引物Sa-LAMP-2（图2-B）和Sd-LAMP-3（图2-F）分别在反应开始后27和29 min出现明显扩增信号，与其他组相比，这两组引物的扩增曲线均呈现典型的“S”型，能更早进入平台期；同时各组阴性对照均未观察到非特异性扩增信号，表明背景干扰较小。因此，试验最终选用Sa-LAMP-2和Sd-LAMP-3引物分别作为无乳链球菌和停乳链球菌的最优LAMP引物。

2.3 LAMP反应体系的优化

2.3.1 Mg²⁺、甜菜碱及dNTPs浓度的优化

在其他条件保持不变的情况下，对Mg²⁺、甜菜碱及dNTPs的浓度进行优化。结果（图3~5）显示，当Mg²⁺浓度为5 mmol/L、不添加甜菜碱（0 mol/L）且dNTPs浓度为1.6 mmol/L时，2种链球菌的扩增效率最优，表现为出峰最早、荧光值最大，Mg²⁺低于或高于此浓度时均会导致出峰延迟或荧光值减小。因此，确定2种链球菌LAMP检测体系中无需添加甜菜碱且Mg²⁺和dNTPs最适浓度分别为5和1.6 mmol/L。

2.3.2 反应温度的优化

在保持其他条件不变的情况下，对反应温度进行筛选，结果（图6，7）显示，在65 ℃时，2种链球菌的扩增曲线均表现为出峰最早且荧光信号最强；温度低于或高于65 ℃时，LAMP扩增延迟或效率下降。因此，确定65 ℃为2种链球菌LAMP检测的最适反应温度。

2.3.3 反应时间的优化

在确定最适反应温度为65 ℃后，对反应时间进行优化，结果（图8，9）显示，2种链球菌均在20 min内未观察到有效扩增，而在30~60 min均可观察到扩增信号，其中无乳链球菌在50 min、停乳链球菌在40 min时扩增出峰最早且荧光信号最强，继续延长反应时间并未显著提高扩增效率。因此，确定无乳链球菌和停乳链球菌LAMP检测的最适反应时间分别为50和40 min。

2.4 可视化LAMP检测方法特异性评价

实时荧光LAMP检测结果显示，仅目标菌株及其对应阳性质粒出现典型的“S”型扩增曲线，非目标菌株和阴性对照均无扩增信号（图10-A、D）。可视化LAMP检测结果显示，只有目标菌株与其对应的阳性质粒DNA结果为黄绿色，其余处理均为浅橙色（图10-B、E）；PCR结果进一步证实，仅目标菌扩增出现符合预期大小的特异性条带（图10-C、F）。以上结果表明，所建立的可视化LAMP检测方法对这2种链球菌均具有高度特异性，可准确区分目标菌与非目标菌。

2.5 可视化LAMP检测方法灵敏度评价

为评价所建立方法的灵敏度，以5×10⁶ ~ 5×10⁰ 拷贝/μL的2种链球菌重组质粒为模板，同步进行可视化LAMP和PCR检测。实时荧光与可视化结果显示，当重组质粒含量低至5×10¹ 拷贝/μL时，2种链球菌均出现典型的扩增曲线（图11-A、D），且反应管呈黄绿色，低于此浓度则保持浅橙色（图11-B、E），因此确定2种链球菌可视化LAMP检测限均为5×10¹拷贝/μL。与常规PCR的最低检测限（5×10³拷贝/μL，图11-C、F）相比，本研究建立的可视化LAMP方法的灵敏度提高了100倍，在低拷贝目标核酸检测方面具有明显优势。

2.6 可视化LAMP方法对临床样本的检测

为评估本研究建立的可视化LAMP方法在实际样品检测中的可行性与准确性，用该方法对宁夏地区300份奶牛乳样进行检测，并以PCR法进行平行检测（对照），结果（表3）表明，无乳链球菌和停乳链球菌可视化LAMP法的检出率分别为42.0%和32.3%，均高于PCR方法的31.0%和24.3%。结果表明，可视化LAMP方法在实际样本检测中具有更高的阳性检出能力，显示出良好的应用潜力。

3 讨 论

奶牛乳房炎严重制约着奶牛养殖业的健康发展，导致奶牛产奶量下降，治疗与淘汰成本增加，经济损失严重。无乳链球菌和停乳链球菌是引发该病的关键致病性链球菌，感染早期多呈隐性感染或亚临床状态，临床症状不明显，易造成病原的持续传播。因此，建立一种适用于基层现场的快速、灵敏、特异的检测方法，对奶牛乳房炎的早期诊断和防控具有重要意义。

本研究以无乳链球菌cfb基因和停乳链球菌16S rRNA的特异性区域为靶标，设计LAMP引物组合，通过对反应体系和反应条件的系统优化，成功建立了2种链球菌的可视化LAMP检测方法。用该方法对宁夏地区300份临床乳样进行检测，结果显示，2种链球菌的检出率均高于常规PCR法，灵敏度提高了100倍，扩增反应时间仅需50 min，整体检测周期明显短于PCR方法，且较Guo等^［25］基于fbsB基因建立的无乳链球菌RT-LAMP方法的反应时间缩短了10 min。本试验建立的方法在反应前将钙黄绿素荧光染料直接加入到反应体系中，实现扩增结果的可视化判读，避免了扩增后开盖添加染料及凝胶电泳步骤，既简化了检测流程，也有效降低了气溶胶污染与假阳性风险。综上，与常规PCR法相比，本研究建立的LAMP检测方法具有操作简便、检测快速、结果可视化且灵敏度高等特点，适用于无乳链球菌和停乳链球菌感染所致奶牛乳房炎的基层现场快速检测。

特异性是LAMP检测技术区分不同病原菌的前提，而高度特异性引物的设计是保证检测结果准确性的核心。在奶牛乳房炎病原菌分子检测中，常以16S rRNA、23S rRNA、scpB、tuf、cylE、gapC、nuc、pauA、lmb、napr和uidA等基因为靶标^［26-29］，设计引物进行检测。16S rRNA基因是细菌分类鉴定的经典分子标记，其序列在不同细菌间具有较高的保守性，同时包含多个可变区，因而被广泛用于细菌的分类鉴定与检测研究^［30］。cfb基因编码具有协同溶血活性CAMP因子，是无乳链球菌的重要毒力因子，可作为快速检测的重要分子靶标^［9］，有研究显示，基于cfb基因的检测方法在灵敏度方面优于以scpB基因为靶标的检测方法^［31］。因此，本研究选取无乳链球菌cfb基因和停乳链球菌16S rRNA基因作为靶标设计特异性引物，从而保证了所建立的LAMP检测方法具有较强的特异性。

灵敏度高是实现目标病原菌早期检测的关键。Banerjee等^［32］基于无乳链球菌cfb基因构建了LAMP检测体系，用于新生儿败血症血样检测，该方法最低检测限为2 CFU/mL，灵敏度是PCR法的100倍；Jang等^［33］以sodA基因为靶标开发的人工关节周围感染无乳链球菌LAMP检测方法的最低检测限为1×10² 拷贝/μL；余艳玲等^［34］针对罗非鱼无乳链球菌Sip基因建立了LAMP检测方法，其可检测的DNA最低含量为2.5×10⁴ 拷贝/μL。本研究所建立的方法对目标菌DNA的最低检测限达到5×10¹ 拷贝/μL，其灵敏度略低于Miao等^［35］联合LAMP技术与分裂酶生物传感器建立的针对链球菌16S rRNA的检测方法，但高于Griffioen等^［36］以乳房炎链球菌16S rRNA基因为靶标建立的LAMP检测方法。

4 结 论

本研究以无乳链球菌cfb基因和停乳链球菌16S rRNA基因为靶标，建立了奶牛乳房炎2种主要链球菌可视化LAMP检测方法。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便、对仪器设备要求低以及结果可视化等特点，为奶牛乳房炎主要链球菌的基层现场快速检测提供了可靠的技术支持，具有良好的临床应用潜力。

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基金资助

宁夏回族自治区重点研发计划项目(2023BEG03053)

宁夏回族自治区重点研发计划项目(2026BBF02008)

宁夏回族自治区自然科学基金项目(2025AAC020018)

宁夏回族自治区自然科学基金项目(2026AAC020016)

国家自然科学基金项目(32460172)