新疆北疆不同动物源肠球菌的分离鉴定及耐药性分析

Isolation，identification，and antimicrobial resistance analysis of Enterococcus from different animal sources in Northern Xinjiang

摘要

目的 探究新疆北疆地区不同动物源肠球菌的耐药性及耐药基因携带情况，为不同动物肠球菌病的临床合理用药提供指导。 方法 在新疆石河子市和沙湾市分别采集鸡（100份）、羊（62份）和猪（113份）的肛拭子样本，分离培养肠球菌。采用琼脂稀释法测定9种抗菌药物［氨苄西林（AMP）、氟苯尼考（FFC）、红霉素（ERY）、四环素（TET）、利奈唑胺（LZD）、替加环素（TGC）、庆大霉素（GEN）、万古霉素（VAN）、环丙沙星（CIP）］对分离菌株的最小抑菌浓度；通过PCR方法检测11种耐药基因（恶唑烷酮类耐药基因optrA、poxtA、cfr，氨基糖苷类耐药基因acc（6'）/aph（2''）、aph（3'）‐Ⅲ），糖肽类耐药基因vanA，四环素类耐药基因tetM、tetA，大环内酯类耐药基因ermB，酰胺醇类耐药基因（fexA、floR）在分离菌株中的分布情况。 结果 从鸡、羊、猪中分别分离出肠球菌73，19和92株，分离率分别为73.0%，30.6%和81.4%，其中粪肠球菌153株（占55.6%），屎肠球菌31株（占11.3%）。药敏试验结果显示，184株分离菌株对FFC、ERY、TET和GEN等4种抗菌药物的耐药率均超90%，未检测出耐AMP的肠球菌。不同动物源肠球菌耐药严重程度为猪源>鸡源>羊源。多重耐药分析结果显示，肠球菌在0~7耐均有分布，以4~6耐为主（占89.6%），共有22种耐药谱型，以FFC-ERY-TET-GEN（占27.2%）和FFC-ERY-TET-LZD-GEN-CIP（占24.5%）谱型为主。耐药基因检测结果显示，共检出optrA、acc（6'）/aph（2''）、aph（3'）‐Ⅲ、tetM、tetA、ermB和fexA等7种耐药基因，其中tetM耐药基因的检出率最高，为92.4%；分离株普遍携带2种以上耐药基因。 结论 新疆北疆地区养殖场肠球菌耐药形势严峻，耐药基因携带率较高，应建立“基因型+表型”的双重耐药监测体系，动态调整用药方案，合理规范使用抗菌药物。

Abstract

Objective The study aims to investigate the antimicrobial resistance and carriage of resistance genes in Enterococcus isolates from different animal sources in Northern Xinjiang，and to provide a reference for rational clinical antimicrobial use in these animals. Method Anal swab samples were collected from chickens （n=100），sheep （n=62），and pigs （n=113） in Shihezi and Shawan，Xinjiang，for the isolation and cultivation of Enterococcus.The agar dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentrations （MICs） of 9 antimicrobial agents ［ampicillin （AMP），florfenicol （FFC），erythromycin （ERY），tetracycline （TET），linezolid （LZD），tigecycline （TGC），gentamicin （GEN），vancomycin （VAN），ciprofloxacin （CIP）］ against the isolates.PCR assays were performed to detect the distribution of 11 resistance genes，including oxazolidinone resistance genes （optrA，poxtA，cfr），aminoglycoside resistance genes （acc（6'）/aph（2''），aph（3'）‐Ⅲ），glycopeptide resistance gene （vanA），tetracycline resistance genes （tetM，tetA），macrolide resistance gene （ermB），and amphenicol resistance genes （fexA，floR） in the isolates. Result A total of 73，19，and 92 Enterococcus strains were isolated from chickens，sheep，and pigs，with isolation rates of 73.0%，30.6%，and 81.4%， respectively.Among them，153 isolates （55.6%） were E.faecalis and 31 isolates （11.3%） were E.faecium. Antimicrobial susceptibility testing showed that 184 isolates exhibited resistance rates exceeding 90% to four antimicrobials （FFC，ERY，TET，GEN），and no AMP-resistant Enterococcus was detected.The severity of antimicrobial resistance in Enterococcus from different animal sources ranked as：pig-derived>chicken-derived > sheep-derived.Multidrug resistance analysis revealed that the isolates were resistant to 0-7 classes of antimicrobials，with 89.6% resistant to 4-6 classes.A total of 22 resistance phenotypes were identified，dominated by FFC-ERY-TET-GEN （27.2%） and FFC-ERY-TET-LZD-GEN-CIP （24.5%）.Resistance gene detection showed that 7 genes （optrA，acc（6'）/aph（2''），aph（3'）-Ⅲ，tetM，tetA，ermB，fexA） were positive，among which tetM had the highest detection rate （92.4%）.Most isolates carried ≥2 resistance genes. Conclusion Enterococcus from livestock farms in Northern Xinjiang presents a severe antimicrobial resistance profile with high carriage rates of resistance genes.A dual resistance monitoring system combining “genotype+phenotype” should be established to dynamically adjust medication regimens and promote the rational and standardized use of antimicrobials.

Graphical abstract

关键词

肠球菌 / 粪肠球菌 / 屎肠球菌 / 耐药性 / 耐药基因 / 新疆北疆

Key words

Enterococcus / Enterococcus faecalis / Enterococcus faecium / antimicrobial resistance / resistance genes / Nothern Xinjiang

肠球菌（Enterococcus）是人和多种动物肠道中普遍存在的革兰氏阳性细菌。肠球菌属目前已报道的菌种有90余种，其中粪肠球菌（E.faecalis）和屎肠球菌（E.faecium）是最主要的菌种^［1-2］。肠球菌作为人和动物肠道中的常见共生菌，多数菌株无致病性，且部分菌株具有调节肠道菌群平衡、促进营养物质消化吸收等益生功能^［3］，但在一定条件下，部分致病性菌株可引发尿路感染、菌血症、心内膜炎等多种疾病，尤其对免疫功能低下的宿主危害显著，是临床和畜牧养殖中需重点关注的病原菌之一^［4-5］。

抗菌药物在临床诊疗及畜牧养殖中的滥用，导致细菌耐药性问题日趋严峻。目前，肠球菌的耐药性日益突出，多重耐药菌株乃至“超级细菌”频繁出现，给临床感染治疗带来巨大挑战^［6-8］。肠球菌耐药问题不仅影响畜禽疾病防治效果，造成养殖成本增加，还对食品安全和人类健康构成潜在威胁^［9-12］。新疆北疆地区作为新疆重要的畜牧业基地，养殖规模大、动物品种多样，若能在养殖中实现精准用药则可减少耐药菌的出现及传播，实现提质增效的目的。本研究以新疆北疆部分地区规模化鸡场、羊场和猪场为研究对象，对肠球菌进行分离鉴定，并对其耐药情况及耐药基因流行情况进行调查，以期为临床合理用药、制定抗菌药物使用监管政策提供理论支持，助力畜牧业绿色可持续发展，同时为公共卫生安全提供保障。

1 材料与方法

1.1 材　料

在新疆石河子市141团采集鸡源肛拭子100份，在塔城地区沙湾市采集羊源肛拭子62份，在石河子市采集猪源肛拭子113份。

肠球菌培养基、琼脂粉、BHI培养基和MH培养基，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；革兰氏染色液，购自北京索莱宝科技有限公司；抗菌药物，购自上海源叶生物科技有限公司；DNA分子量标准（Marker），购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Gold View核酸染料，购自北京博奥拓达科技有限公司；2×Es Taq PCR Master Mix（Dye）、ddH₂O，购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 细菌的分离纯化与鉴定

将采集的样品菌悬液振荡混匀，吸取10 μL于1 mL灭菌BHI培养基中，在摇床上37 ℃、200 r/min条件下过夜增殖。用接种环蘸取增菌液，在肠球菌选择性培养基上划线，37 ℃培养18~24 h，挑取培养基上长出的菌落，接种至新的BHI液体培养基中，37 ℃培养8~10 h，获得纯化菌液后划线纯化，重复2次。取纯化后的肠球菌菌液进行革兰氏染色，镜检观察。

以粪肠球菌ddl基因和屎肠球菌ddl基因序列为参考，采用Primer Premier 5软件设计引物（表1）。对初步鉴定为肠球菌的菌株进行PCR扩增，PCR反应体系为：2×Es Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 6 μL。粪肠球菌PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min。屎肠球菌PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。试验以本实验室前期经测序鉴定为粪肠球菌/屎肠球菌的阳性分离株DNA作为阳性对照，以无菌ddH₂O替代DNA模板作为阴性对照。对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR扩增产物送至新疆有康生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST序列比对分析，相似性>96.0%的分离株确定为肠球菌菌株。将鉴定出的菌株与60.0%灭菌甘油按体积比2∶1混合后，-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 药物敏感性试验

试验以粪肠球菌ATCC29212和金黄色葡萄球菌ATCC29213为标准质控菌株。参照美国临床和实验室标准协会（clincal and laboratory standards institute，CLSI）^［13］推荐的琼脂稀释法进行药敏试验，测定氨苄西林（ampicillin，AMP）、四环素（tetracycline，TET）、氟苯尼考（florfenicol，FFC）、红霉素（erythromycin，ERY）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、利奈唑胺（linezolid，LZD）、万古霉素（vancomycin，VAN）、替加环素（tigecycline，TGC）和庆大霉素（gentamicin，GEN）等9种抗菌药物对不同来源肠球菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。试验设供试菌株和质控菌接种不含抗菌药物培养基的处理为阳性对照，设不接种任何菌株的空白培养基为阴性对照。药物对质控菌的MIC值在质控范围内，则试验测得的MIC结果有效。结果判定方法为：各处理在37 ℃培养箱中孵育18~24 h，以肉眼可见可抑制菌落生长的最低药物浓度为MIC。MIC≥耐药临界值判定为耐药（R），MIC≤敏感临界值判定为敏感（S），介于两者之间的判定为中介（I）^［14］。

1.4 耐药基因检测

根据文献［15］，合成恶唑烷酮类耐药基因optrA、poxtA、cfr，氨基糖苷类耐药基因acc（6'）/aph（2''）、aph（3'）‐Ⅲ），糖肽类耐药基因vanA，四环素类耐药基因tetM、tetA，大环内酯类耐药基因ermB，酰胺醇类耐药基因fexA、floR等6大类11个基因的引物，引物由新疆有康生物科技有限公司合成，具体信息见表1。采用PCR方法对分离纯化的鸡源、羊源、猪源共184株肠球菌进行耐药基因检测。本研究采用20 μL体系进行PCR扩增：2×Es Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH₂O 6 μL。PCR 反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，49~62 ℃（具体温度依表1中的引物而定）退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳验证，经凝胶成像系统成像并采集图像，扩增条带大小与目标条带相符判定为耐药基因阳性，无特异性目标条带则记为阴性。

1.5 数据分析

采用 SPSS 27.0软件，通过交叉表法对不同动物源粪肠球菌和屎肠球菌分离率、耐药率及耐药基因检出率进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同动物源肠球菌的分离

经纯化培养处理后，得到光滑、隆起、不透明、灰白色的菌落，在菌落周围有黑色晕轮形成（图1-A）。取纯化后的肠球菌菌液进行革兰氏染色镜检，结果可观察到紫色，单个、成双或短链排列，无芽孢，无荚膜的球状菌，为革兰氏阳性菌（图1-B）。对分离株的粪肠球菌和屎肠球菌基因进行特异性扩增，结果粪肠球菌ddl基因扩增产物片段大小为941 bp，屎肠球菌ddl基因扩增产物片段大小为658 bp（图2）。

不同动物源肠球菌分离结果（表2）显示，共分离到184株肠球菌，总分离率为66.9%，其中粪肠球菌153株，分离率为55.6%；屎肠球菌31株，分离率为11.3%。肠球菌分离率从高到低依次为猪源（81.4%）>鸡源（73.0%）>羊源（30.6%）；猪源粪肠球菌分离率（76.1%）显著高于鸡源（57.0%）和羊源（16.1%）的分离率（P<0.05）；鸡源屎肠球菌分离率（16.0%）显著高于猪源的分离率（5.3%）（P<0.05）。

2.2 不同动物源肠球菌的耐药性分析

不同动物源肠球菌药敏试验结果（图3）显示，184株肠球菌对TET、ERY、GEN、FFC耐药率均超过90.0%，分别为95.1%，93.5%，92.4%和90.8%；对VAN和TGC具有较好的敏感性，耐药率分别仅为7.1%和4.3%；对AMP没有耐药性。

不同动物源肠球菌耐药严重程度为猪源>鸡源>羊源。猪源肠球菌对TET、FFC、ERY、GEN等4种抗菌药物的耐药率均超过90.0%，分别为100.0%，100.0%，97.8%和96.7%。鸡源肠球菌对FFC和TET的耐药率均为100.0%；对ERY、GEN耐药率均超过94.0%，分别为98.6%和94.5%。羊源肠球菌对GEN、FFC、TET等3种抗菌药物的耐药率均超过52.0%，分别为63.2%，57.9%和52.6%。

由表3可知，153株粪肠球菌对TET、ERY、GEN和FFC的耐药率均高于94.0%，分别为98.0%，95.8%，95.4%和96.1%；对LZD和CIP的耐药率均超过40.0%，分别为46.4%和52.9%；对VAN和TGC有较好的敏感性，耐药率分别仅为6.5%和5.2%；对AMP没有耐药性。不同动物源粪肠球菌耐药严重程度表现为猪源>鸡源>羊源。猪源粪肠球菌对TET、ERY、GEN和FFC的耐药率均高于85.0%，分别为100.0%，97.7%，96.5%和100.0%；对CIP的耐药率为72.1%；对AMP和TGC无耐药性。鸡源粪肠球菌对FFC、TET、ERY和GEN耐药率均超过98.0%，分别为100.0%，100.0%，98.2%和98.2%；对AMP、TGC和VAN无耐药性。羊源粪肠球菌对FFC耐药率100.0%；对TGC、TET和GEN耐药率均≥70.0%，分别为80.0%，70.0%和70.0%。数据分析结果显示，羊源粪肠球菌对TGC的耐药率显著高于鸡源和猪源粪肠球菌（P<0.05），鸡源和猪源粪肠球菌对ERY、TET和GEN的耐药率显著高于羊源粪肠球菌（P<0.05）。

由表3可知，31株屎肠球菌对ERY、TET、FFC和LZD的耐药率均超过60.0%，分别为80.6%，80.6%，74.2%和64.5%；对VAN耐药率较低，为9.7%；对AMP和TGC无耐药性。不同动物源屎肠球菌耐药严重程度表现为猪源>鸡源>羊源。猪源屎肠球菌对FFC、ERY、TET、GEN和CIP的耐药率均为100%，对AMP和TGC无耐药性。鸡源屎肠球菌对FFC、ERY、TET、LZD的耐药率均为100%，对AMP、TGC和VAN无耐药性。羊源屎肠球菌对GEN、ERY和TET的耐药率较高，分别为55.6%，33.3%和33.3%；对AMP、TGC和VAN无耐药性。鸡源和猪源屎肠球菌对ERY和TET的耐药率显著高于羊源屎肠球菌（P<0.05），且鸡源屎肠球菌对LZD耐药率显著高于羊源和猪源屎肠球菌。

2.3 不同动物源肠球菌的多重耐药分析

不同动物源肠球菌的多重耐药结果详情见表4。由表4可知，不同动物源肠球菌的多重耐药在0~7耐，以4~6耐为主，占89.6%。鸡源肠球菌多重耐药分布在4~6耐，以4耐和5耐为主，分别占41.1%和42.5%；羊源肠球菌多重耐药分布在0~7耐，3耐及3耐以上占63.2%；猪源肠球菌多重耐药分布在3~7耐，以4~6耐为主，占92.4%。

不同动物源粪肠球菌多重耐药在2~7耐均有分布，以4~6耐为主，占92.8%。鸡源粪肠球菌以4~5耐为主，占87.7%，羊源粪肠球菌以4~5耐为主，占60.0%，猪源粪肠球菌以4~6耐为主，占91.8%。

不同动物源屎肠球菌的多重耐药分布在0~6耐，主要集中在5~6耐，占71.0%。鸡源屎肠球菌以5~6耐为主，占93.8%，羊源屎肠球菌3耐以上菌株占33.3%，猪源屎肠球菌全部分布在6耐。

2.4 不同动物源肠球菌的多重耐药谱型分析

184株肠球菌共有22种多重耐药谱类型，以FFC-ERY-TET-GEN（27.2%）和FFC-ERY-TET-LZD-GEN-CIP（24.5%）谱型占比较高。鸡源粪肠球菌共有5种耐药谱，以4耐谱型FFC-ERY-TET-GEN为主（50.9%）；羊源粪肠球菌共有9种耐药谱型，以5耐谱型FFC-ERY-TET-TGC-GEN为主（20%）；猪源粪肠球菌共有10种耐药谱型，以6耐谱型FFC-ERY-TET-LZD-GEN-CIP为主（33.7%）。鸡源屎肠球菌共有4种耐药谱型，以5耐谱型FFC-ERY-TET-LZD-GEN为主（50.0%）；羊源屎肠球菌共有3种耐药谱型，以3耐谱型ERY-TET-GEN为主（50.0%）；猪源屎肠球菌共有2种耐药谱型，分别为FFC-ERY-TET-GEN-VAN-CIP（50%）和FFC-ERY-TET-LZD-GEN-CIP（50%）。

73株鸡源肠球菌有7种耐药谱型，其中4耐谱型以FFC-ERY-TET-GEN为主（15.8%）；5耐谱型以FFC-ERY-TET-LZD-GEN为主（12.0%）；6耐谱型为FFC-ERY-TET-LZD-GEN-CIP，占比6.5%。

19株羊源肠球菌共有11种耐药谱型，2耐谱型为FFC-GEN，3耐谱型为FFC-TET-TGC和ERY-TET-GEN，4耐谱型为FFC-LZD-TGC-CIP、FFC-TGC-GEN-CIP和FFC-ERY-TET-GEN，5耐谱型为FFC-TET-LZD-TGC-CIP和FFC-ERY-TET-TGC-GEN，6耐谱型为FFC-ERY-TET-LZD-TGC-GEN和FFC-ERY-TET-LZD-GEN-CIP，7耐谱型为FFC-ERY-TET-LZD-TGC-GEN-VAN。

92株猪源肠球菌有10种耐药谱型，其中4耐谱型以FFC-ERY-TET-GEN为主（11.4%）；5耐谱型以FFC-ERY-TET-GEN-CIP为主（8.2%）；6耐谱型以FFC-ERY-TET-LZD-GEN-CIP为主（17.4%）；7耐共有6株菌，耐药谱型为FFC-ERY-TET-LZD-GEN-VAN-CIP。

2.5 不同动物源肠球菌的耐药基因检测

由图4可知，不同动物源肠球菌ermB、fexA、optrA、acc（6'）/aph（2''）、aph（3'）-Ⅲ、tetM、tetA基因均有检出，其中以tetM基因检出率最高，为92.4%，poxtA、vanA、cfr和floR等耐药基因均未检出。鸡源肠球菌中，ermB、acc（6'）/aph（2''）、aph（3'）-Ⅲ和tetM等4种耐药基因的检出率均超过95%，分别为98.6%，98.6%，95.9%和95.9%；fexA和optrA耐药基因的检出率较低，分别为35.6%和32.9%。猪源肠球菌中tetM耐药基因的检出率最高（94.6%），ermB、acc（6'）/aph（2''）、aph（3'）-Ⅲ耐药基因的检出率均超过44.0%，fexA和optrA耐药基因的检出率较低。羊源肠球菌中ermB、aph（3'）-Ⅲ、tetM耐药基因的检出率均高于60.0%，optrA和tetA耐药基因的检出率仅为5.3%。

不同动物源粪肠球菌和屎肠球菌耐药基因检测结果（表5）显示，粪肠球菌和屎肠球菌中tetM基因检出率均超过90.0%；aph（3'）-Ⅲ、ermB和acc（6'）/aph（2''）基因检出率均超过60.0%，且鸡源粪肠球菌中这3个基因的检出率显著高于猪源和羊源粪肠球菌（P<0.05）；粪肠球菌中optrA和fexA基因检出率低于15.0%；屎肠球菌中optrA和fexA基因检出率分别为29.0%和48.4%，且检测出1株tetA阳性菌株。

鸡源粪肠球菌和屎肠球菌中tetM、aph（3'）-Ⅲ、ermB和acc（6'）/aph（2''）耐药基因的检出率均高于90.0%，屎肠球菌中fexA和optrA基因的检出率高于粪肠球菌。羊源粪肠球菌和屎肠球菌中tetM、aph（3'）-Ⅲ和ermB基因的检出率均高于50.0%，粪肠球菌中7种耐药基因的检出率均低于屎肠球菌，仅检出1株optrA阳性的屎肠球菌。猪源粪肠球菌和屎肠球菌中tetM基因的检出率均高于90.0%，粪肠球菌中aph（3'）-Ⅲ、ermB、acc（6'）/aph（2''）、optrA和fexA基因的检出率均高于屎肠球菌。

2.6 耐药表型与耐药基因的相关性分析

不同动物源肠球菌耐药率均高于耐药基因检出率，但二者基本呈正相关关系（表6）。鸡源肠球菌对四环素和大环内酯类药物的耐药率为98.6%~100.0%，但相关耐药基因检出率仅为48.0%~49.3%；猪源肠球菌对四环素、氨基糖苷类和大环内酯类药物的耐药率为96.7%~100.0%，但耐药基因检出率为29.9%~47.3%。此外，不同动物源肠球菌对酰胺醇类药物的耐药率为90.8%，但耐药基因检出率未超过10.1%。

3 讨 论

3.1 不同动物源肠球菌的分离结果

肠球菌作为人和动物肠道中的常见共生菌，也是一种重要的条件致病菌和耐药基因储存库，其耐药性可经食物链与环境扩散，对免疫功能低下的宿主危害显著，导致生长性能下降甚至死亡，给养殖业带来直接损失，是临床和畜牧养殖中需重点关注的病原菌之一^［16-17］。本研究从新疆北疆石河子等地区的鸡源、羊源、猪源样本中共分离出184株肠球菌，整体分离率为66.9%，肠球菌分离结果低于陈万昭^［15］在2022年报道的新疆部分地区动物源肠球菌分离率（77.7%）和夏盼盼等^［1］在2024年报道的新疆某猪场肠球菌分离率（94.8%），与李宏博等^［18］报道的伊犁昭苏县肠球菌分离率（74.3%）接近。不同地区动物源肠球菌的分离率存在差异，这可能与样本来源、养殖场中使用的抗菌药物种类和使用频率、养殖密度等不同有关，另外实验室中肠球菌培养基的选择与鉴定方法也会导致分离率存在差异。本研究中粪肠球菌分离率（55.6%）高于屎肠球菌分离率（11.3%），与赵婕霖等^［19］报道的江苏地区不同畜禽养殖场肠球菌属细菌的菌种分离率截然不同，其报道的粪肠球菌分离率为22.4%，屎肠球菌分离率为78.6%，造成此结果的原因可能是采样地域、采样方式、养殖模式及环境条件等存在较大差异。

本研究中鸡源肠球菌（73.0%）和猪源肠球菌（81.4%）的分离率高于赵婕霖等^［19］报道的江苏地区畜牧养殖场鸡源肠球菌（36.6%）和猪源肠球菌（22%）的分离率；而羊源肠球菌的分离率低于陈万昭^［15］报道的羊源肠球菌分离率（63.6%）。本研究中肠球菌的检出率较高，可能是肠球菌在宿主肠道中广泛存在^［20］，故易在样本中被分离检出。而不同的样本地区来源、养殖管理模式和抗菌药物的使用偏好都会导致检测出的肠球菌中粪肠球菌与屎肠球菌占比出现差异。以上研究2种菌分离率的差异可能与样本宿主肠道菌群结构存在差异及养殖模式和用药习惯不同有关。

3.2 不同动物源肠球菌的耐药结果

药敏试验结果表明，新疆北疆地区不同动物源肠球菌对FFC、ERY、TET和GEN等4种抗菌药物高度耐药，该结果与王东等^［21］对新疆阿克苏地区猪源粪肠球菌分离株对ERY、TET和GEN耐药率均达90%以上的结果一致，但本研究中菌株对LZD的耐药率（49.5%）远高于王东等^［21］报道的耐药率（21.3%）。不同地区分离的肠球菌均对FFC、ERY、TET和GEN等有较高的耐药率，原因可能是这4种药物在畜禽养殖中使用历史悠久、应用范围广且给药方式粗放，导致菌株高度耐药^［22］；此外，FFC、TET、ERY等药物还常被用于预防性给药，这使得肠球菌对恶唑烷酮类、四环素类和大环内酯类等抗菌药物普遍呈现高度耐药，进一步加剧了耐药菌株的富集^［23］。上述结果表明，研究区肠球菌对不同类别抗菌药物的耐药性存在差异。鉴于本研究中分离菌株对FFC、ERY、TET和GEN等4种药物的耐药率较高，建议当地临床用药时优先选用窄谱、高敏感性的AMP作为首选治疗药物，以提高治疗的精准性。

本研究中，不同动物源肠球菌多药耐药集中在4~6耐（89.6%），且有93.9%的菌株耐4种及以上的受试药物，结果表明研究区动物肠球菌耐药情况严重。鸡源和猪源肠球菌多重耐药主要集中在4~6耐，而羊源多重耐药分布较广，造成这一差异的主要原因可能是，不同动物及养殖场的用药习惯不同，其次也与羊源肠球菌分离率低、样本量偏小有关。鸡源和猪源肠球菌的耐药率较高，因此建议研究地区养殖场应严格规范抗菌药物使用，强化养殖环境与生物安全管理，并建立耐药性检测体系，动态掌握耐药谱变化，实现抗菌药物的科学合理使用，以保障养殖场公共卫生安全和畜牧业的可持续发展。

3.3 不同动物源肠球菌的耐药基因检出结果

本研究耐药基因检测结果显示，研究区动物源肠球菌耐药基因携带率较高，检测的11种耐药基因中，除poxtA、vanA、cfr和floR等未检出外，其他7种耐药基因均有检出。几乎所有菌株都含有2种以上的耐药基因，部分菌株含6种以上耐药基因。肠球菌中tetM检出率超过92%，aph（3'）-Ⅲ、ermB和acc（6'）/aph（2''）的检出率均高于65%，这与徐琦琦等^［16］和王东等^［21］对新疆阿克苏地区猪源粪肠球菌耐药基因检测结果基本一致。本研究中optrA和fexA基因的检出率远低于徐琦琦等^［16］的研究结果，optrA基因的检测率高于王舒丰等^［24］对自繁自养猪场中不同生长期猪源肠球菌optrA基因的检出率（12.2%）。不同研究耐药基因检出率存在差异，原因可能是不同养殖环境中的抗菌药物暴露强度、种类及给药模式不同，形成了差异化的选择压力，从而影响了耐药基因的检出率^［25］。此外，温度、饲养密度、pH及营养成分等环境因子也会对耐药基因检出率产生重要影响^［26］。

本研究肠球菌的耐药表型与耐药基因型基本呈正相关。肠球菌对TET耐药率为95.1%，其四环素类tetM基因检出率为92.4%，仅1株菌检出tetA基因，提示所分离出的肠球菌菌株对四环素耐药性主要由tetM介导。本研究中肠球菌aph（3'）-Ⅲ、ermB和acc（6'）/aph（2''）等3种耐药基因检出率均在65.0%以上，对大环内酯类和氨基糖苷类抗菌药物的耐药率分别为93.5%和92.4%，提示肠球菌对氨基糖苷类和大环内酯类药物耐药率较高，其耐药基因具有高度转移的特性^［27］。值得注意的是，肠球菌属细菌对氨基糖苷类药物固有耐药，单一治疗时无效，需与青霉素类或糖肽类药物联用才能对肠球菌发挥协同抗菌作用。然而，肠球菌可产生氨基糖苷类修饰酶，例如最常见的由aac（6'）/aph（2''）基因编码的AAC（6'）/APH（2''）双功酶，会导致协同作用消失^［28］。因此养殖场应建立“基因型+表型”的双重耐药监测体系，动态调整用药方案，避免长期使用单一的抗菌药物。

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基金资助

新疆维吾尔自治区人才发展基金-天池英才培养计划项目(CZ004309)

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