基于WWP2/KLF5/TRAIL通路探讨芪黄逐瘀方对心肌缺血再灌注损伤保护作用

摘要

目的 探讨芪黄逐瘀方对大鼠心肌缺血再灌注（I/R）损伤的保护作用及机制。方法 36只雄性SD大鼠按照随机原则分为空白对照组（Control）、假手术组（Sham）、模型组（I/R）、芪黄逐瘀方低剂量组（I/R+QHZYF-L）、芪黄逐瘀方中剂量组（I/R+QHZYF-M）、芪黄逐瘀方高剂量组（I/R+QHZYF-H），每组6只。芪黄逐瘀方连续灌胃给药2周后，行左前降支（LAD）结扎45 min，再灌注4 h建立I/R模型。记录术前术后心电图变化，采用超声心动图评估左室功能，2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色观察梗死范围变化，Masson和TUNEL染色分别观察心肌组织纤维化与细胞凋亡情况，生化检测血清中乳酸脱氢酶（LDH）的活性，ELISA法检测肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量；通过免疫组化及Western blot法分析含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)、Krüppel样因子5(KLF5)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白在心肌组织中的表达水平，并通过免疫共沉淀（Co-IP）分析WWP2与KLF5的相互作用。结果 与空白组和假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死范围增大，心肌损伤标志物LDH、CK-MB、cTnI和炎症指标IL-1β、IL-6、TNF-α均显著上升（P<0.001），心肌组织早期纤维化启动（P<0.001），心肌细胞凋亡增多（P<0.001），左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）显著下降（P<0.001），左心室收缩末期内径（LVDs）明显升高（P<0.001），大鼠心肌组织WWP2、KLF5、TRAIL蛋白表达显著升高（P<0.01,P<0.001,P<0.000 1）；与模型组相比，芪黄逐瘀方各剂量组心肌梗死范围明显减小，LDH、CK-MB、cTnI等心肌损伤标志物含量显著降低（P<0.001），炎症指标IL-1β、IL-6与TNF-α同样明显下降，其中中、高剂量组尤为显著（P<0.001），心肌组织结构改善，纤维化减小（P<0.001），心肌细胞凋亡减少（P<0.001）。超声结果显示，各剂量组LVEF、LVFS、LVDs均呈改善趋势，其中中、高剂量组LVEF显著升高（P<0.05,P<0.01），高剂量组LVFS显著升高、LVDs显著降低（P<0.05）；大鼠心肌组织WWP2、KLF5、TRAIL蛋白表达均明显下调（P<0.05,P<0.01,P<0.001,P<0.000 1）;Co-IP结果表明，WWP2与KLF5在心肌组织中存在相互作用，I/R损伤二者的结合增强，而芪黄逐瘀方干预后该结合程度减弱。结论 芪黄逐瘀方可能通过调节WWP2/KLF5/TRAIL相关信号轴发挥心脏保护作用，但三者之间的直接上下游因果关系仍有待后续功能性实验进一步证实。

关键词

芪黄逐瘀方 / 心肌缺血再灌注损伤 / 细胞凋亡 / 炎症反应 / 心肌纤维化 / 免疫共沉淀 / 心肌保护